Cistanche deserticola es una planta en peligro de extinción que se utiliza como medicina y como alimento. Nuestro propósito es explorar las diferencias en el metabolismo entre inflorescencias en partes no medicinales y tallos suculentos en partes medicinales para fortalecer la aplicación y desarrollo de las partes no medicinales de C. deserticola. Realizamos análisis metabolómicos mediante LC-ESI-MS/MS en las inflorescencias y tallos suculentos de tres ecotipos (tierra salino-alcalina, pastizal y tierra arenosa) de C. deserticola. Se identificaron un total de 391 metabolitos comunes en seis grupos, de los cuales la isorhamnetina O-hexósido (inflorescencia) y la rosinidina O-hexósido (tallos suculentos) pueden usarse como marcadores químicos para distinguir tallos suculentos e inflorescencias. Comparando las diferencias metabólicas entre los tres ecotipos, encontramos que la mayoría de los diferentes metabolitos relacionados con el estrés salino-alcalino eran flavonoides. En particular, mapeamos la ruta biosintética de los glucósidos feniletanoides (PhG) y mostramos las diferencias metabólicas en los seis grupos. Para comprender mejor los mecanismos farmacodinámicos y los objetivos de C. deserticola, examinamos 88 componentes químicos y 15 posibles objetivos de enfermedades a través del acoplamiento molecular. Los ingredientes activos de C. deserticola tienen un notable efecto de acoplamiento sobre los objetivos de las enfermedades del envejecimiento como la osteoporosis, la enfermedad vascular y la aterosclerosis. Para explorar el valor de uso de la inflorescencia, analizamos el acoplamiento molecular de los metabolitos de flavonoides únicos en la inflorescencia con objetivos de inflamación. Los resultados mostraron que el crisoberilo y el cinarósido tenían puntajes más altos para los objetivos de inflamación. Este estudio proporciona una base científica para el descubrimiento y la industrialización del valor de los recursos de las partes no medicinales de C. deserticola y la realización del desarrollo sostenible de C. deserticola. También proporciona una estrategia novedosa para explorar las indicaciones de las hierbas chinas.

Según estudios relevantes, la cistanche es una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente es el cistanosido, que tiene diversos efectos como antioxidante, antiinflamatorio y promotor de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana se produce por la oxidación de la tirosina catalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, inhibiendo así la producción de melanina.

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1. Introducción

Cistanche deserticola es una planta comestible y medicinal que a menudo se llama "ginseng del desierto". 1 C. deserticola se registró por primera vez en la Materia médica china de Shen Nong hace unos 1800 años y se ha utilizado ampliamente como un tónico tradicionalmente considerable en China y Japón durante muchos años. Los compuestos que se han aislado de C. deserticola son glucósidos feniletanoides (PhGs), iridoides, lignanos, ácidos grasos, alditoles, carbohidratos y polisacáridos, entre los cuales PhGs es el ingrediente activo principal.2 La farmacología moderna muestra que los extractos de C. deserticola (como los glucósidos feniletanoides, polisacáridos, etc.) tienen una amplia gama de funciones medicinales, especialmente en la mejora de la función sexual, potenciación de la memoria, regulación inmunitaria, protección hepática, actividad laxante, actividad antioxidante, etc.3–5 Además de su valor medicinal, C. deserticola tiene valor ecológico para el control del desierto debido a su capacidad para crecer en ambientes áridos, así como en condiciones de estrés salino-alcalino.6 Sin embargo, las fuentes silvestres de C. deserticola han sido consideradas en peligro en los últimos años. años debido al rápido crecimiento de la demanda del mercado y la sobreexplotación. Ha sido catalogada como una de las plantas de clase II que necesitan protección en China.2 En consecuencia, es urgente desarrollar de manera efectiva los recursos de C. deserticola y determinar el mejor ambiente para el crecimiento de C. deserticola.

Las partes medicinales tradicionales de las plantas medicinales se utilizan ampliamente, mientras que las partes no medicinales a menudo se descartan. Una gran cantidad de estudios han demostrado que algunas partes no medicinales como Salvia miltiorrhiza, Paris polyphylla y Crocus sativus tienen composiciones químicas y efectos farmacológicos similares a los de las partes medicinales. La investigación sobre partes no medicinales conduce a la expansión de recursos médicos, especialmente para la protección de plantas medicinales en peligro de extinción.7,8 Qiao et al. utilizó la tecnología GC-MS para identificar 40 componentes volátiles en la inflorescencia de C. deserticola.9 Peng et al. utilizaron la transcriptómica y la metabolómica para analizar exhaustivamente los efectos analgésicos de diferentes partes de la citronela.10 Yang et al. aislaron tipos de flavonoides de las partes aéreas de Salvia miltiorrhiza y estudiaron su actividad antioxidante.8 La parte medicinal de C. deserticola es un tallo suculento, lo que hace que una gran cantidad de inflorescencias se descarten cada año, lo que resulta en un enorme desperdicio de recursos .

Los metabolitos, como productos finales de varios procesos bioquímicos catalizados por enzimas, brindan conocimientos moleculares útiles para la bioquímica de los organismos en un momento dado.11 El metabolismo está estrechamente relacionado con la calidad de la planta. Los metabolitos primarios afectan el crecimiento y el desarrollo de las plantas, y los metabolitos secundarios pueden ayudar a las plantas a resistir el estrés ambiental.12 Por lo tanto, la tecnología metabolómica se usa ampliamente en la evaluación de la calidad de las plantas.13–15 Anteriormente integramos el transcriptoma y el metaboloma para evaluar la calidad de los tallos suculentos de los tres ecotipos de C. deserticola y explorar el mecanismo molecular de la variación de la calidad.16 Descubrimos que 20 -acetilacteoside se puede usar como marcador químico para distinguir tres ecotipos. Wenjin Liu et al. basado en 1 H NMR no dirigido a la estrategia de metabolómica dirigida basada en LC-MS, llevó a cabo una comparación de grupos químicos en profundidad de cuatro especies suculentas de Cistanche e identificó echinacósido, acetónido, betaína, manitol, 6-desoxicatalpol, sacarosa, y 8- ácido epi-orgánico se pueden usar como marcadores químicos para distinguir cuatro especies de Cistanche.17 Pingping Zou et al. aplicó metabolómica basada en 1 H NMR para identificar las partes superior e inferior del tallo de C. deserticola y encontró que los metabolitos primarios en serie, especialmente los carbohidratos y los metabolitos del ciclo del ácido tricarboxílico, eran las moléculas primarias que gobernaban la discriminación.18 HaiLi Qiao et al. ilustraron que se encontró un mayor contenido de ésteres y aromáticos en las flores, los cuales aumentaron significativamente en comparación con los compuestos volátiles de las yemas a través del análisis GC-MS de los componentes volátiles de la inflorescencia de C. deserticola. 9 En la actualidad, aún falta la investigación sobre la variación de la calidad entre el tallo suculento y la inflorescencia de C. deserticola desde la perspectiva del metabolismo.

Los estudios existentes han utilizado la simulación de redes de acoplamiento molecular para explorar los objetivos y mecanismos de la medicina china en el tratamiento de enfermedades.19–21 Jianling Liu et al. investigó las combinaciones de fármacos eficaces basadas en la farmacología del sistema entre los compuestos de Cistanche tubulosa. Preliminarmente examinaron 61 compuestos y 43 objetivos relacionados con la neuroinflamación, de los cuales el verbascósido y el tubulosido B podrían desempeñar un papel clave en la neuroprotección.22 YingQi Li et al. farmacología de red integrada y modelo de pez cebra para investigar componentes de efectos duales de Cistanche tubulosa para tratar tanto la osteoporosis como la enfermedad de Alzheimer.23 Los componentes químicos de C. deserticola son complejos y tienen una amplia gama de efectos farmacológicos. Sin embargo, los mecanismos terapéuticos aún no están claros. Es de gran importancia aclarar los objetivos de la enfermedad y los mecanismos para un mayor desarrollo de C. deserticola.

En este estudio, utilizamos la metabolómica para investigar las diferencias metabólicas de las inflorescencias y los tallos suculentos de los tres ecotipos (tierra salino-alcalina, pradera y tierra arenosa) de C. deserticola y comparamos los ecotipos de pradera y tierra arenosa con los ecotipos salino-alcalino. ecotipo de tierra alcalina para explorar la variación metabólica en C. deserticola que se ven afectados por el estrés salino alcalino. En particular, identificamos y analizamos los metabolitos de seis grupos involucrados en la biosíntesis de PhG. Aplicamos acoplamiento molecular para filtrar los posibles compuestos y objetivos y dibujamos diagramas de simulación de red, así como análisis de enriquecimiento GO y KEGG. Nuestros hallazgos brindan nuevos conocimientos sobre las diferencias metabólicas entre la inflorescencia y los tallos suculentos de los tres ecotipos de C. deserticola.

2. Materiales y métodos

2.1 Materiales vegetales y recolección de muestras

Recolectamos las inflorescencias (el sufijo del número de serie de la muestra es "1") y los tallos suculentos (el sufijo del número de serie de la muestra es "2") para C. deserticola en la etapa de excavación (abril a mayo de 2017) de tres ecotipos diferentes: Ebinur Lake de Xinjiang (A1 y A2: tierra salina y alcalina), Tula Village de Xinjiang (B1 y B2: pastizales) y Alxa Left Banner of Inner Mongolia (C1 y C2: tierra arenosa) en el noroeste de China (Tabla 1 y Fig. 1a) . Los especímenes de prueba se depositaron en el herbario del Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales de la Academia China de Ciencias Médicas en Beijing, China. Las muestras fueron colectadas en campo y almacenadas en nitrógeno líquido rápidamente. Después de limpiarlos con PBS, los tejidos del tallo suculento se cortaron en trozos pequeños y se almacenaron inmediatamente en un congelador a 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Se tomaron 18 muestras (tres réplicas biológicas por hábitat, dos partes de tejido por muestra) de las partes gruesas de la inflorescencia y tallos carnosos para el análisis del metaboloma.

2.2 Extracción y separación de metabolitos

La muestra liofilizada se trituró utilizando un molino mezclador (MM 400, Retsch) con una bola de zirconio durante 1,5 min a 30 Hz. Se pesaron 100 mg de polvo y se extrajeron durante la noche a 4 grados con 1,0 ml de metanol acuoso al 70 por ciento. Después de la centrifugación a 10 000 g durante 10 min, los extractos se absorbieron antes del análisis LC-MS.

Se utilizó el sistema LC-ESI-MS/MS (UPLC, sistema Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A) para analizar el extracto de muestra liofilizado. Las condiciones analíticas fueron las siguientes: columna UPLC, Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (1,8 mm, 2,1 mm x 100 mm); disolvente, agua (0.04 % de ácido acético): acetonitrilo (0.04 % de ácido acético); programa de gradiente, 100 : 0 v/v a 0 min, 5: 95 v/v a 11,0 min, 5: 95 v/v a 12,0 min, 95: 5 v/v a 12,1 min y 95 : 5 v/v a 15,0 min; caudal, 0,40 mL min 1; temperatura, 40 grados; y volumen de inyección, 2 mL. El efluente se conectó alternativamente a una trampa de iones ESI-triple cuadrupolo lineal (Q TRAP)-MS. En este experimento, se preparó una muestra de control de calidad mediante mezclado uniforme; durante el análisis, se corrieron muestras de control de calidad cada 10 inyecciones para monitorear la estabilidad de las condiciones de análisis.24–26

Los escaneos de trampa de iones lineales (LIT) y triple cuadrupolo (QQQ) se adquirieron en un espectrómetro de masas de trampa de iones lineal de triple cuadrupolo (Q TRAP), sistema API 6500 Q TRAP LC/MS/MS, equipado con un Interfaz de pulverización de iones turbo ESI, que funciona en modo de iones positivos y está controlada por el software Analyst 1.6 (AB Sciex). Los parámetros de operación de la fuente ESI fueron los siguientes: una fuente de iones, turbo spray; temperatura de la fuente 500 grados; voltaje de pulverización de iones (IS) 5500 V; el gas fuente de iones I (GSI), el gas II (GSII) y el gas de cortina (CUR) se fijaron en 55, 60 y 25,0 psi, respectivamente; el gas de colisión (CAD) era alto (12 psi). La puesta a punto del instrumento y la calibración de masa se realizaron con soluciones de polipropilenglicol de 10 y 100 mmol L 1 en los modos QQQ y LIT, respectivamente. Los escaneos QQQ se adquirieron como experimentos MRM con gas de colisión (nitrógeno) ajustado a 5 psi. El potencial de desagrupamiento (DP) y la energía de colisión (CE) para las transiciones MRM individuales se realizaron con mayor optimización. Se controló un conjunto específico de transiciones de MRM para cada período en función de los metabolitos eluidos dentro de este período.

2.3 Identificación y cuantificación de metabolitos

El análisis cualitativo de los datos de MS primarios y secundarios se llevó a cabo mediante la comparación de los valores de iones precursores (Q1), iones de fragmentos (Q3) (ventanas de aislamiento (±15 Da), tiempo de permanencia (ms) o tiempo de ciclo (1 segundo)), tiempo de retención (RT) y patrones de fragmentación con los obtenidos inyectando estándares usando las mismas condiciones si los estándares estuvieran disponibles o se realizaran usando una base de datos autocompilada MWDB (NetWare Biological Science and Technology Co., Ltd Wuhan, China) y disponible públicamente bases de datos de metabolitos si los estándares no estaban disponibles. Las señales repetidas de K plus , Na plus , NH4 plus y otras sustancias de alto peso molecular se eliminaron durante la identificación. El análisis cuantitativo de los metabolitos se basó en el modo MRM. Los iones característicos de cada metabolito se analizaron a través del espectrómetro de masas QQQ para obtener la intensidad de la señal. La integración y la corrección de los picos cromatográficos se realizaron con Multi Quant versión 3.0.2 (AB SCIEX, Concord, Ontario, Canadá). Los contenidos de metabolitos relativos correspondientes se representaron como integrales de área de pico cromatográfico.

Los valores VIP (variable importante en la proyección) de muestras de C. deserticola (tres réplicas biológicas) se calcularon mediante el software SIMCA-P (versión 14.1, Sartorius Stedim Biotech, Ume˚a, Suecia) en función del análisis de componentes principales y mínimos parciales ortogonales. Análisis discriminante de cuadrados. Establecimos fold-change $2 o #0.5 y valor VIP $1 como el umbral para evaluar los metabolitos significativamente diferentes. Los datos de metabolitos se normalizaron, se realizó un análisis de mapas de calor de grupos en todas las muestras y se usó el script del programa R para dibujar mapas de calor de grupos.

2.4 Acoplamiento molecular

2.4.1 Recolección de compuestos químicos.A través de los resultados experimentales preliminares de nuestro grupo de investigación y los resultados de la búsqueda bibliográfica, se recolectó un total de 127 compuestos aislados de los tallos suculentos de C. deserticola y se descargaron del sitio web de Chemical Book o se utilizó ChemDraw para dibujar la estructura molecular 2D. Además, encontramos 4 evitas (crisoberilo, cinarósido, hesperetina y homoeriodictiol) detectados solo en la inflorescencia a través de los resultados del metaboloma. La estructura 2D se convirtió en una estructura tridimensional con el software ChemDraw 3D y se realizó una optimización preliminar. Luego, Avogadro Software verificó la estructura tridimensional preliminar optimizada y se utilizó una mayor optimización de energía para generar el formato de archivo compuesto final requerido para el acoplamiento molecular posterior.

2.4.2 Recolección de la colección Target.Buscamos objetivos de proteínas de la enfermedad a través de la literatura y la base de datos STITCH. Obtuvimos los objetivos genéticos correspondientes utilizando la base de datos Uniport y recuperamos la identificación PDB del haplotipo de proteína y la estructura de moléculas pequeñas por RCSB. Al determinar el fármaco positivo, utilizamos la literatura y el sitio web de Yaodu para identificar preliminarmente 45 objetivos de enfermedades relacionadas que se informaron, incluidas 10 enfermedades relacionadas con los tallos suculentos de C. deserticola en la literatura. Estas diez enfermedades eran aterosclerosis, osteoporosis, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, Parkinson, estreñimiento crónico, taquicardia ventricular torsades de pointes, enfermedad vascular, lesión miocárdica y cáncer de recto. Además, recolectamos 467 objetivos relacionados con la inflamación y obtuvimos 2 objetivos importantes (6KBA y 7AWC) a través de la detección, que se utilizaron para el análisis de acoplamiento molecular de flavonoides específicos de inflorescencia.

2.4.3 Simulación de acoplamiento molecular.Para evaluar la afinidad de unión de los compuestos en C. deserticola a los objetivos candidatos, realizamos una simulación de acoplamiento molecular a través del software QuickVina 2.0, una utilidad de código abierto desarrollada por el grupo de investigación Alhossary. Para verificar la afinidad de unión entre los objetivos y los compuestos, calculamos una puntuación de acoplamiento a través de QuickVina 2.0. Las puntuaciones de acoplamiento que superaron las de los fármacos positivos (los datos de cada fármaco positivo se pueden obtener de los objetivos correspondientes en RCSB o en la literatura) indicaron una fuerte afinidad de unión entre los objetivos candidatos y los compuestos correspondientes.27–30 Nosotros usó PyMOL (Versión 2.0 Schr¨odinger, LLC) para trazar los resultados de acoplamiento del compuesto y el objetivo.

2.4.4 Construcción de la red componente-objetivo-vía y análisis de la función GO/KEGGLa construcción de la red componente-objetivo-vía se llevó a cabo utilizando el software de visualización de red Cytoscape. En las interacciones de red, los nodos representan componentes, objetivos y rutas, mientras que los bordes representan la interacción entre ellos. Utilizamos el valor de puntuación del acoplamiento molecular del compuesto y el gen objetivo como indicador del color de la conexión. Cuanto más verde sea el color, mayor será el valor de puntuación. Se construyó y analizó una red de interacción proteína-proteína (PPI) asociada con objetivos genéticos con STRING.31

Para conocer más a fondo las funciones biológicas dentro de la red construida, utilizamos el módulo de anotación funcional de la base de datos DAVID29 para realizar análisis de ontología génica (GO) y enriquecimiento KEGG en genes diana.

3. Resultados

3.1Perfiles metabólicos de C. deserticola

Para obtener una descripción general de los cambios metabólicos de las inflorescencias y tallos suculentos de los tres ecotipos C. deserticola, se realizó un análisis de metaboloma ampliamente específico mediante LC-ESI-MS/MS. Como se muestra en la Fig. 1b, las inflorescencias y los tallos suculentos de C. deserticola de diferentes ecotipos mostraron diferentes separaciones, y la separación de diferentes tejidos fue mayor que la de diferentes ecotipos. Y las tres muestras replicadas tienen puntajes de PC similares, lo que indica que los metabolitos de C. deserticola mostraron poca separación entre las muestras replicadas. Además, las muestras de control de calidad (mezcla) se agruparon en el centro de la gráfica de puntajes de PCA. El diagrama de pétalos (Fig. 1c) y el diagrama alterado (Fig. 1d) indicaron que había 391 metabolitos comunes en los seis grupos, y el número de metabolitos detectados en la inflorescencia fue generalmente mayor que en el tallo suculento. El número de metabolitos detectados en la inflorescencia salino-álcali (A1) fue el mayor, con un total de 515, de los cuales 18 metabolitos solo se detectaron en A1. El número de metabolitos detectados en tallos suculentos de pastizal (B2) fue el menor, con un total de 458, sin sus metabolitos únicos.

Se determinaron los contenidos relativos de 578 metabolitos, incluidas 35 categorías de metabolitos (ESI File S1). Los metabolitos más abundantes de las inflorescencias y tallos suculentos en los tres ecotipos fueron lípidos, glicerolípidos, aminoácidos, nucleótidos y sus derivados, glucósidos feniletanoides (PhG) y flavonoides (Fig. S3a, 3b y c). Después de la normalización, el contenido proporcional de cada metabolito se determinó mediante el área de respuesta máxima promedio durante UPLC-MS/MS, como se muestra en la Fig. 1e con un mapa de calor, y se realizó además con un análisis de agrupamiento jerárquico. Más metabolitos secundarios mostraron altos niveles de concentración relativa en A1 y C2 que en otros grupos. Entre los metabolitos secundarios en los tres ecotipos, el contenido relativo de glucósidos feniletanoides (PhGs) en los tallos suculentos fue mayor que en las inflorescencias, mientras que el contenido relativo de flavonoides en las inflorescencias fue mayor que en los tallos suculentos.

En este análisis del metaboloma, se detectaron 12 componentes activos principales de C. deserticola, incluidos 2′-acetilacteoside, acteoside, cistanoside A, coniferin, echinacoside, formononetin-7-O-glucoside, inosine, isoacteoside, ononin, pinoresinol, jeringas y uridina. Se dibujó un mapa de calor de agrupamiento jerárquico (Fig. 1f) para los principales componentes activos de C. deserticola detectados por el metaboloma, que muestra que el contenido relativo de los principales componentes activos en el tallo suculento era mayor que en la inflorescencia. En comparación con diferentes tejidos, los ingredientes activos con contenido relativamente alto en la inflorescencia fueron 2'-acetilacteoside y coniferina, mientras que los ingredientes activos con contenido relativamente alto en tallos suculentos fueron acteoside, cistanoside A, echinacoside e isoacteoside. En comparación con diferentes ecotipos, el contenido relativamente alto de ingredientes activos en la tierra salina-alcalina fue 2′-acetilacteoside, acteoside, coniferin, echinacoside e isoacteoside. El contenido relativamente alto en pastizales fue echinacósido, y los contenidos relativamente altos en terrenos arenosos fueron cistanósido A.

3.2 Diferencia metabólica entre inflorescencia y tallo suculento de C. deserticola

Para comprender la diferencia en el metabolismo entre la inflorescencia y el tallo suculento de C. deserticola en tres ecotipos, analizamos los diferentes metabolitos. Se observó una alta previsibilidad (Q2) de los modelos OPLS-DA para generar una comparación por pares entre la inflorescencia y el tallo suculento en tierras salinas y alcalinas (Q2 = 0.996), pastizales (Q2 = 0.997) , y tierra arenosa (Q2 = 0.997) (Fig. S1a). Los valores de Q2 y R2 fueron más altos en la prueba de permutación que en el modelo OPLS-DA (Fig. S1b). Para identificar posibles variables, establecemos el cambio de pliegue mayor o igual a 2 o menor o igual a 0.5 y el valor VIP mayor o igual a 1 como el umbral para evaluar los metabolitos significativamente diferentes en cada par de comparaciones. Los 10 metabolitos diferentes principales de las inflorescencias y los tallos suculentos de los tres ecotipos se muestran en la Tabla S1. En comparación con los tallos suculentos, el contenido relativamente alto de metabolitos diferenciales en las inflorescencias fueron flavonoides, como flavonol, flavona y glucósidos C de flavona.

En tierra salina-alcalina, en comparación con las inflorescencias, los tallos suculentos tenían 43 metabolitos diferenciales regulados al alza y 71 metabolitos diferenciales regulados a la baja (Fig. 2a). El mapa de calor (Fig. 2b) mostró que el contenido relativo de las inflorescencias fue mayor que el de los tallos suculentos. Al comparar los tallos suculentos con las inflorescencias, los principales metabolitos regulados al alza fueron cianidina 3-O-rutinósido (queracianina), icariina (kaempferol 3,7-O-diglucósido 8-derivado de prenilo), ácido homovanílico , éster metílico del ácido clorogénico y O-hexósido de rosinidina. Los principales metabolitos diferenciales regulados a la baja incluyeron N′, N′′-di-p-cumaroilespermidina, 8-C-hexosil-luteolina O-hexósido, ácido cafeico, isorhamnetina O-hexósido e isorhamnetina 5- O-hexósido (Fig. 2c). El análisis de enriquecimiento de la vía metabólica KEGG (Fig. 2d) clasificó los metabolitos diferenciales identificados de la inflorescencia y el tallo suculento en biosíntesis de flavonoides, biosíntesis de flavonas y flavonoles, biosíntesis de isoflavonoides, biosíntesis de fenilpropanoides y metabolismo de lípidos de éter.

En los pastizales, en comparación con las inflorescencias, los tallos suculentos tenían 35 metabolitos diferenciales regulados al alza y 54 metabolitos diferenciales regulados a la baja (Fig. 2a). El mapa de calor (Fig. 2b) mostró que el contenido relativo de las inflorescencias fue mayor que el de los tallos suculentos. Al comparar tallos suculentos con inflorescencias, los principales metabolitos regulados al alza fueron l-(plus)-arginina, ácido adípico, N-metilnicotinamida, ácido 4-hidroxibenzoico y dihidromiricetina. Los principales metabolitos diferenciales regulados a la baja incluyeron rosinidina O-hexósido, ácido cafeico, isorhamnetina O-hexósido, venta de 5-O-hexósido e isorhamnetina 5-O-hexósido (Fig. 2c). El análisis de enriquecimiento de la ruta metabólica KEGG (Fig. 2d) clasificó los metabolitos diferenciales identificados de la inflorescencia y el tallo suculento en biosíntesis de flavonoides, biosíntesis de flavonas y flavonoides, biosíntesis de diterpenoides, biosíntesis de isoflavonoides y arrastre circadiano.

En tierra arenosa, en comparación con las inflorescencias, los tallos suculentos tenían 40 metabolitos diferenciales regulados al alza y 87 metabolitos diferenciales regulados a la baja (Fig. 2a). El mapa de calor (Fig. 2b) mostró que el contenido relativo de las inflorescencias fue mayor que el de los tallos suculentos. Al comparar los tallos suculentos con las inflorescencias, los principales metabolitos regulados al alza fueron O-feruloil 4-hidroxicumarina, jeringa, rosinidina O-hexósido, 3-(4-hidroxifenil) ácido propiónico y ácido homovanílico. Los principales metabolitos diferenciales regulados a la baja incluyeron el ácido crisoeriol O-ramnosil-O-glucurónico, C-hexosil-apigenina O-cafeoilhexósido, venta de O-malonilhexósido, isorhamnetina O-hexósido y 8-C-hexosil-luteolina O- hexósido (Fig. 2c). El análisis de enriquecimiento de la vía metabólica KEGG (Fig. 2d) clasificó los metabolitos diferenciales identificados de la inflorescencia y el tallo suculento en biosíntesis de flavonas y flavonoides, biosíntesis de flavonoides, biosíntesis de isoflavonoides, biosíntesis de diterpenoides y degradación de compuestos aromáticos.

3.3Diferencias metabólicas relacionadas con el estrés salino-alcalino en tres ecotipos de C. deserticola

Para comprender las características metabólicas únicas de los tres ecotipos de la tierra salino-alcalina de C. deserticola, analizamos los diferentes metabolitos en tierra salina-alcalina versus pradera y tierra arenosa versus tierra salina-alcalina. Se observó una alta predictibilidad (Q2) de los modelos OPLS-DA para generar una comparación por pares entre tierra salina-alcalina versus pastizal de inflorescencia (Q2 = 0.997) y tallo suculento (Q2 = 0.991) . Por su parte, alta predictibilidad (Q2) de los modelos OPLS-DA entre terreno arenoso versus terreno salino-alcalino de inflorescencia (Q2 = 0.988) y tallo suculento (Q2 = 0.995). Los valores de Q2 y R2 fueron más altos en la prueba de permutación que en el modelo OPLS-DA (Fig. S2†). Para identificar posibles variables, establecemos el cambio de pliegue Mayor o igual a 2 o Menor o igual a 0.5 y el valor VIP Mayor o igual a 1 como el umbral para evaluar los metabolitos significativamente diferentes en cada par de comparaciones. La Tabla 2 mostró los diferentes metabolitos de las inflorescencias y los tallos suculentos relacionados con el estrés salino-alcalino (tierra salina-alcalina frente a pastizales y tierra arenosa frente a tierra salina-alcalina), ordenados por categoría de metabolitos, y demostró que la clase de la mayoría de los metabolitos era el flavonoide. . Entre ellos, el contenido relativo de antocianinas, flavonoides, flavonoles, flavanonas, catequinas y sus derivados, e isoflavonas son los más altos en tierra salino-alcalina. Además, el mapa de calor (Fig. 3d) mostró que los grupos con mayor contenido relativo de metabolitos diferenciales de flavonoides fueron A1 y C1. El contenido relativo de antocianinas fue el más alto en el grupo A2, y el contenido relativo de flavonoides y flavonoles fue el más alto en el grupo A1.

Los mapas de volcanes (Fig. 3a) mostraron que el número de metabolismo diferencial regulado al alza en suelos salinos-alcalinos es mayor que el de pastizales y suelos arenosos, ya sea en inflorescencias o tallos suculentos. Los 20 principales metabolitos diferenciales de cada comparación se muestran en la Fig. 3b. En tierras salinas y alcalinas frente a pastizales, las vías KEGG de metabolitos diferenciales de inflorescencia se enriquecieron principalmente en biosíntesis de flavonoides, flavonol y biosíntesis de flavonol, biosíntesis de diterpenoides, biosíntesis de isoflavonoides y biosíntesis de fenilpropanoides. Además, las vías KEGG de los diferentes metabolitos del tallo suculento se enriquecieron principalmente en la sinapsis dopaminérgica, el metabolismo de las purinas, la biosíntesis de flavonoides, el metabolismo de las pirimidinas y el arrastre circadiano. En tierras salinas y alcalinas frente a pastizales, las vías KEGG de metabolitos diferenciales de inflorescencia se enriquecieron principalmente en biosíntesis de isoflavonoides, biosíntesis de metabolitos secundarios, flavona y biosíntesis de flavonol, agentes antineoplásicos de productos naturales y asma. Además, las vías KEGG de los diferentes metabolitos del tallo suculento se enriquecieron principalmente en la biosíntesis de aminoacil-tRNA, la digestión y absorción de proteínas, el metabolismo central del carbono en el cáncer, la biosíntesis de aminoácidos y la biosíntesis de fenilpropanoides (Fig. 3c).

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