El jasmonato de metilo provoca respuestas distintivas de taninos hidrolizables, favonoides y fitoxilipinas en hojas de granada (Punica Granatum L.) Parte 2

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Los lípidos se convirtieron en ácidos grasos libres y fitooxilipinas en hojas de granada tratadas con MeJA

Además de los flavonoides y las antocianinas, los cambios en las moléculas de lípidos también fueron evidentes en las hojas de granada 72- h después de la inducción de MeJA (Fig. 5a). De los 102 metabolitos acumulados diferencialmente, 23 fueron lípidos, ácidos grasos o fitooxilipinas (Tabla S6). En contraste con el isómero 1 del monoacilglicerol (MAG)(18:4) que mostró una mayor acumulación, siete glicerolípidos, incluido el MAG(18: 1)isómero, MAG (18:3)isómero4,galactosilomonoacilglicerol (DGMG)(18:2)isómero,DGMG(18:2)isómero2,DGMG(18:2)isómero3,monogalactosilolos isómeros de monoacilglicerol (MGMG)(18:2) y el isómero 2 de MGMG (18:2) se redujeron en 3-5 veces cuando se aplicó MeJA a las hojas (Fig. 5a; Tabla S6). Los fosfolípidos LysoPC 18: 0 y 18:1 exhibieron un aumento de más del doble en las hojas tratadas con MeJA (Tabla S6).

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La aplicación exógena de MeJA elevó los niveles de JA e isoleucina (JA-Ile) en 4.3-veces y 2.8-veces, respectivamente, en hojas de granada (Tabla S6). Varios no JAFitooxilipinas, incluidos hidroperóxidos de ácidos grasos, ácidos grasos epoxi, ácidos grasos hidroxi, ácidos grasos ceto yacetilénicoácidos grasos, notablemente aumentados en las hojas tratadas con MeJA (Fig. 5a; Tabla S6). También se observó una mayor acumulación de ácido punícico, un PUFA (18:3) abundante en el aceite de semilla de granada, en las hojas tratadas con MeJA (Tabla S6).

Fig.3 Los niveles de flavonoides y antocianinas se alteraron almetiloaplicación de jasmonato (MeJA). Los metabolitos con acumulación aumentada, disminuida y sin cambios significativos (umbral doble) en hojas de granada tratadas con MeJA en comparación con los controles tratados de forma simulada, cosechadas 72- h después del tratamiento, están coloreadas en verde, rojo, y azul, respectivamente. Los intermedios de la ruta que no se detectaron en el análisis de espectrometría de masas en tándem de ionización por electropulverización de cromatografía líquida se muestran en negro. Las flechas discontinuas indican varios pasos de reacción.

Caracterización bioquímica de un LOX candidato para la modificación de ácidos grasos en hojas de granada tratadas con MeJA

Para explorar los genes metabólicos que están involucrados en la alternancia del metabolismo de los ácidos grasos hacia las fitoxilipinas, se analizaron transcriptomas de hojas de granada tratadas con MeJA y simuladas para detectar DEG que se anotan como lipasas o LOX. Dos genes de lipasa Pgr004895 y Pgr001125 mostraron una expresión mejorada en los transcriptomas de tratamiento 24-h post-MeJA y se confirmó una expresión significativamente mayor mediante análisis de qPCR en tiempo real (Fig. 5b). Por otro lado, la lipasa Pgr024441 mostró una expresión reducida en el análisis del transcriptoma, lo que no fue respaldado por el resultado de la qPCR en tiempo real (Fig. 5b). Curiosamente, se observó una expresión elevada de Pgr025417, un supuesto LOX, en transcriptomas de hojas recolectadas a las 2-h, 6-h,24-h y 72-h después del tratamiento con MeJA. (Figura S1). El análisis de qPCR en tiempo real indicó además un aumento continuo de la expresión de Pgr025417, con un rango de 4-a 20-veces, en hojas recolectadas de 2 a 72-h después del tratamiento con MeJA (Fig. 5c).

Cistanche puede mejorar la inmunidad

Para determinar si la supuesta LOX (Pgr025417) estaba implicada en el aumento de la producción de fitoxilipina en hojas tratadas con MeJA, se examinaron su secuencia y actividad. Cuando se analizó la secuencia de aminoácidos de Pgr025417, se encontraron residuos de His, Asn e Ile que corresponden a los que coordinan el átomo de hierro en el sitio activo de la LOX L-1 de soja (Minor et al. 1996) en Pgr025417 (Fig. 6a). Además, se predice que PgrO25417 se localizará en el cloroplasto (probabilidad de probabilidad de 0,9096) con el péptido señal dividido entre 64 y 65 aa (Fig. 6a). Entre los 11 LOX putativos (786 aa a 970 aa) identificados en el genoma de la granada anotado, se predice que otros LOX: Pgr025413, Pgr025418, Pgr009839, Pgr016852 y Pgr013780 son cloroplásticos además de Pgr025417 y se agrupan con LOX tipo II caracterizados en otras plantas (Fig. 6b). Curiosamente, mientras que Pgr008562, Pgr025678, Pgr018982 y PgrO18980 están agrupados con LOX de tipo I de dicotiledóneas. Pgr020032 tiene una relación más lejana con los otros tipos de ILOX (Fig. 6b). Para determinar la actividad enzimática de PgrO25417, la proteína recombinante (906 aa, ~ 102 kDa; Fig. 6c) se analizó utilizando ácido linoleico como sustrato. Pgr025417 produjo productos oxidados de ácido linoleico como se demostró por una mayor absorción a 598 nm cuando estaban presentes cantidades aumentadas de proteína recombinante en la mezcla de reacción (Fig. 6d).

Respuesta transcripcional a la aplicación de MeJA exógeno en hojas de granada

To understand whether the changes in HTs,flavonoids, lipids, fatty acids, and phyto-oxylipins are regulated transcription-ally, transcriptomes of MeJA-and mock-treated pomegranate leaves collected at2-h,6-h,24-h,and72-h were compared and identified 34 transcription factors(TFs) that showed differen-tial expression (Log,FCl>1, P ajustada<0.05)(table 1);31="" of="" these="" tfs="" also="" exhibited="" significantly="" changed="" expression="" by="" real-time="" qpcr="" analysis="" (fig.7).="" notably,="" a="" zinc-finger="" tf="" pgr009895="" showed="" increased="" expression="" at="" three="" out="" of="" the="" four="" time="" points(2-h,24-h,and="" 72-h)(fig.7a).the="" expression="" of="" pgr002863(pcf5-like),pgr002859(bzip1)and="" pgr006935(auxin="" response="" factor)was="" increased,="" and="" pgro11269="" (myb)="" decreased="" upon="" meja="" elicitation="" at="" two="" time="" points(fig.="" 7a,="" b).both="" pgro09366(anthocyanin="" regu-latory="" c1="" protein/myb)and="" pgro03015(myb)displayed="" increased="" expression="" at="" 6-h,="" but="" decreased="" expression="" at="" 72-h="" (fig.="" 7b).the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" enhanced="" at="" only="" one="" time="" point,including="" pgr009357(2-h),pgr027831="" (2-h),pgr023581(6-h),pgr009363(6-h),pgr000147="" (6-h),="" pgr021507(6-h),="" pgr021504(6-h),pgr020147(24-h),="" pgr025715(72-h),pgr023629(72-h),pgr015728(72-h),and="" pgr004388(72-h)(table="" 1;fig.7b,c).on="" the="" other="" hand,="" the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" suppressed="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leaves="" at="" one="" time="" point,="" including="" pgr013499="" (2-h),pgr023409="" (2-h),pgr017106(6-h),pgr010911(24-h),pgr017568(72-h),pgr024750(72-h),pgr004878(72-h)pgr002084(72-h),pgr008889(72-h),pgr004532(72-h),="" pgr020131="" (72-h),and="">

Para evaluar la regulación transcripcional de los genes candidatos que pueden funcionar en la modulación de las vías de flavonoides y ácidos grasos/fitooxilipinas tras la inducción de MeJA, se predijeron los sitios de unión a TF en las regiones promotoras de los genes candidatos utilizando PlantRegMap (Tian et al.2020) con TF identificados bioinformáticamente de Eucalyptus Grandis, que está estrechamente relacionado con la granada en Myrtales (Tabla S7). Para PgrO25417 (LOX putativo), se identificaron 80 sitios de unión de 65 TF, incluidos abundantes sitios de unión para MYB (10 TF, 15 sitios) y WRKY (11 TF, 18 sitios), pero sin sitios de unión para TF con dedos de zinc bipolares (Tabla S7). Debido a que CHS y CHI están posicionados en el punto de entrada de las vías biosintéticas de flavonoides y antocianinas y mostraron una expresión génica reducida en transcriptomas y análisis de qPCR en tiempo real (Figs. S1 y 4), los promotores de CHS putativo (Pgr005566) y CHI (Pgr025966) también se analizaron los sitios de unión a TF putativos. Para CHS, hay 104 sitios de unión de 76 TF, siendo MYB (20 TF, 23 sitios) y LH (13 TF, 23 sitios) los TF más abundantes (Tabla S7). Para CHI, hay 93 sitios de unión de 78 TF, siendo bHLH (16 TF, 23 sitios) y WRKY (13 TF, 13 sitios) los TF más abundantes (Tabla S7).

Discusión

Los cambios metabólicos únicos inducidos por la aplicación exógena de MeJA sugieren funciones de HT, flavonas/flavonoles metilados y fitooxilipinas en la respuesta de la granada a MeJA.

MeJA tiene un papel demostrado en provocar respuestas de estrés en las plantas (Cheong y Choi 2003). Se indujo la acumulación de dos intermediarios de la ruta de la HT: glucogalina y pentagaloilglucosa en las hojas 30- h después de la aplicación de MeJA (Fig. 2b), lo que sugiere que actúan en respuesta al estrés abiótico y biótico en el medio ambiente. Este resultado también corrobora la función de los HT en la protección de la granada del estrés abiótico en el tejido de la cáscara de la fruta (Schwartz et al.2009; Habashi et al.2019). En correspondencia con el aumento en la acumulación de metabolitos de HT, el shikimato y los genes de la vía biosintética de HT también mostraron una mayor expresión (Fig. 1). La caracterización bioquímica anterior de cuatro isoformas de SDH de vid (Vitis vinifera) indicó que solo VvSDH3 y VySDH4 podían producir ácido gálico a partir de 3-deshidroshikimato (Bontpart et al. 2016). De acuerdo con nuestros análisis de transcriptoma y qPCR en tiempo real, PgSDH3_1 y PgSDH3_2, homólogos de WvSDH3, pero no PgSDH4, un homólogo de VSDH4, exhibieron expresión inducida por MeJA (Figs. S1 y 1) . Esta observación sugiere que PgSDH3_1 y PgSDH3_2 probablemente estén involucradas en la síntesis de HT en respuesta al tratamiento con MeJA y al estrés ambiental. Además, la expresión mejorada de PgUGT8423 y PgUGT84A24, que codifican enzimas que catalizan el paso comprometido de la biosíntesis de HT, mediante la aplicación MeJA respalda aún más el papel de los HT en la respuesta al estrés.

72- h después de la inducción de MeJA, se encontró una supresión general de flavonoides y antocianinas en hojas de granada (Fig. 3; Tabla S6), lo que es contrario al aumento de la acumulación de estos compuestos observado en muchas otras plantas (Pandey et al. al.2016; De Geyter et al.2012; Shafiq et al.2011; Flores y Ruiz del Castillo 2014; Portu et al. 2015). Sin embargo, tres flavonas y flavanoles metilados: di-O-metil quercetina, venta de 5-O-hexósido y crisoe-riol O-hexosil-O-hexósido se acumularon en un nivel mayor a pesar de la reducción de precursores biosintéticos no metilados. (Fig.3; Tabla S6). La quercetina mono- y di-O-metilada es secretada por los tricomas de las especies de solanáceas y se ha propuesto que actúa en la defensa de las plantas, posiblemente de manera específica para cada especie (Wollenweber y Dörr 1995; Roda et al.2003). También se demostró que los glucósidos de crisoberilo, luteolina y apigenina disuadían a los herbívoros acuáticos de alimentarse de hojas de Potamogeton lucens (hierba de estanque) en ensayos in vitro (Erhard et al. 2007). La acumulación inducida de metiladosflavonas/flavonolesen hojas de granada sugiere que pueden desempeñar un papel en la respuesta al estrés provocada por MeJA y tener implicaciones para la defensa contra heridas, patógenos y herbívoros en esta especie de árbol.

Además de los HT, los flavonoides y las antocianinas, otros cambios metabólicos notables incluyeron la movilización de ácidos grasos libres de los lípidos y la biosíntesis de fitooxilipinas 72- h después de la aplicación de MeJA (Fig. 5a). El triple aumento de ácido punícico (18:3, cis-9,trans-11, cis-13) tras la inducción de MeJA sugiere un papel potencial de este PUFA con un sistema de tres enlaces dobles conjugados en señalización de estrés o defensa química directa de las plantas de granada (Tabla S6). La reducción simultánea de MAG, MGMG y DGMG también sugiere que el ácido punícico podría conjugarse habitualmente con estos glicerolípidos en las hojas de granada (Fig. 5a; Tabla S6). De las fitoxilipinas, el aumento de JA y JA-Ile en hojas de granada tratadas con MeJA podría deberse a la desmetilación del MeJA aplicado exógenamente para formar JA, que posteriormente se convierte en JA-Ile (Tabla S6) (Stuhlfelder et al. .2004). También puede sugerir que MeJA puede regular directamente la biosíntesis de JA y sus derivados en granada. Según se informa, los compuestos volátiles derivados de las fitoxilipinas participan en la señalización de la respuesta a las heridas y los ataques de patógenos (Lim et al.2017). Estudios recientes también han revelado funciones antimicrobianas directas de las fitooxilipinas que no son JA, aunque la base mecánica de tales funciones aún no está clara (Deboever et al. 2020). La producción inducible de fitooxilipinas en granada corrobora las observaciones anteriores en otras plantas. Queda por determinar si estas fitoxilipinas son biocidas o funcionan para estimular una respuesta inmune innata en la granada.

El metabolismo modificado de flavonoides y antocianinas, pero no de fitoxilipinas, tras la inducción de MeJA se regula al menos parcialmente a nivel transcripcional.

De acuerdo con la acumulación generalmente disminuida de flavonoides y antocianinas, los genes que codifican CHS y CHI, dos enzimas ubicadas en el punto de entrada de la biosíntesis de flavonoides y antocianinas, mostraron una expresión reducida en las hojas tratadas con MeJA (Fig. 4). Curiosamente, un homólogo de granada (PgrO09366) de la proteína C1 reguladora de antocianina TF MYB de maíz se reguló inicialmente al alza en las hojas tratadas con MeJA a las 6- h, pero luego se reguló a la baja en las hojas tratadas con MeJA a las 72- h (Tabla 1 ;Figura 7b). Un homólogo de granada (PgrO10911) del maíz MYB TF P se reguló a la baja en hojas tratadas con MeJA a las 24- h (Tabla 1; Fig. 7c). Como se demostró en estudios en maíz, el Cl activa varios genes en la biosíntesis de flavonoides y antocianinas, como CHS(C2), dihidro flavonol reductasa (A1), antocianidina 3-O-glucosiltransferasa (BZ1) y leucoantociani-dina dioxigenasa( A2)(Lesnick y Chandler 1998; Sainz et al.1997; Quattrocchio et al.1993). P, por otro lado, controla la expresión de A1, pero no de BZ1 (Grotewold et al. 1994). En maíz, C1 (MYB TF) trabaja en conjunto con R (bHLH TF) para regular la expresión de genes biosintéticos de antocianina ( Mol et al.1998; Goff et al.1992). Pgr024750, un bHLH TF, también se reguló a la baja en las hojas tratadas con MeJA a las 72-h y podría ser un socio potencial del homólogo C1 de la granada (Tabla 1; Fig. 7c). Además, se identificaron sitios de unión para TF de MYB y bHLH en las regiones promotoras de CHS y CHI putativos de granada mediante análisis bioinformáticos (Tabla S7). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la disminución general de flavonoides y antocianinas se logra, al menos parcialmente, a través del control transcripcional de los genes biosintéticos de etapa temprana.

Se observó una reducción de varios glicerolípidos en las hojas tratadas con MeJA (Fig. 5). Sin embargo, los homólogos de granada (números de acceso de GenBank: XP_031374952 y XP_031374953) de Arabidopsis Wrinkled1 (ArWRI1), un TF de la familia APETALA2 (AP2) que se considera un regulador "maestro" para la biosíntesis de lípidos vegetales (Cernac y Benning 2004), expresado de manera similar en hojas tratadas con simulación y MeJA (datos no mostrados). La caracterización funcional de los TF que responden a la inducción de MeJA (Tabla 1; Fig. 7) podría revelar potencialmente un papel regulador para el metabolismo de los lípidos en las hojas de granada.

La granada LOX (Pgr025417) con una expresión continuamente aumentada después de la aplicación de MeJA exógeno, catalizó la oxidación de ácidos grasos y se predijo que se localizaría en el cloroplasto (Figs. 5c y 6). Por lo tanto, es probable que Pgr025417 participe en la biosíntesis de JA que tiene lugar en este compartimento subcelular (Fig. 6). De las 11 LOX supuestas en la granada, 5 son citosólicas (tipo I) y 6 son cloroplásticas (tipo II) (Fig. 6b). Dado que las fitooxilipinas no JA se sintetizan en el citosol (Ponce de León et al.2015), uno o más de los tipos ILOX pueden ser responsables de convertir PUFA en fitooxilipinas no JA tras la inducción de MeJA. Teniendo en cuenta que la LOX(Pgr025417) con un aumento sostenido en la expresión génica en hojas tratadas con MeJA está ubicada en un compartimento subcelular diferente de las fitooxilipinas no JA, es probable que las enzimas responsables de producir fitooxilipinas no JA inducidas por MeJA no modulada transcripcionalmente.

La aplicación exógena de MeJA indujo respuestas transcripcionales en hojas de granada

Un estudio reciente en Arabidopsis reveló que una red reguladora compleja enriquecida con MYC (bHLH), factor de respuesta de etileno (ERF) y TF de la familia MYB estuvo involucrada en la respuesta transcripcional temprana inducida por MeJA (Hickman et al.2017). ERF TF, incluidos Pgr013499 (2-h), PgrO00147 (6- h) y PgrO21504 (6- h), y homólogos de MYB TF, incluidos PgrO09357 (2- h) ), Pgr009366 (6- h), Pgr003015 (6- h) y Pgr011269 (6- h), se encontraban entre los TF con expresión variada en hojas tratadas con MeJA recolectadas en puntos de tiempo tempranos (Tabla 1; Fig. 7). Como se discutió anteriormente, los homólogos de granada de las proteínas reguladoras de flavonoides y antocianinas de maíz C1 y P (TF de MYB) y un TF de bHLH mostraron una expresión disminuida y podrían controlar potencialmente la reducción general de flavonoides y antocianinas. Además, la región promotora de LOX (PgrO25417) contiene sitios de unión de los TF WRKY, MYB y bZIP (Tabla S7), lo que sugiere que podrían estar regulados por los TF expresados ​​diferencialmente que pertenecen a estas familias de TF en respuesta a la aplicación MeJA .

La expresión génica comparativa y el análisis de metabolitos de las hojas tratadas con MeJA facilita el interrogatorio de diversas vías fenólicas en las frutas

Comprender las respuestas metabólicas y transcripcionales de las hojas de granada a la aplicación de MeJA es claramente pertinente para mejorar la salud y la productividad de las plantas (es decir, la producción de frutos). Además, la expresión génica comparativa y el análisis de metabolitos de las hojas tratadas con MeJA también brindan la oportunidad de dilucidar la regulación de las vías de HT, flavonoides y antocianinas que están presentes en los tejidos de las hojas y los frutos (Bar-Ya'akov et al.2019). ). Los compuestos fenólicos HT, flavonoides y antocianinas contribuyen en gran medida a las actividades beneficiosas para la salud humana de los frutos de granada, sin embargo, el control de su producción y acumulación no se ha explorado ampliamente en la granada (para flavonoides y antocianinas) o cualquier especie vegetal (para HT). ). Por ejemplo, estudios previos en frutas de granada a las que se les aplicó MeJA determinaron los niveles de antocianinas y flavonoides en las frutas después de la cosecha, sin investigar la expresión de genes estructurales o reguladores relacionados con estos metabolitos (Koushesh Saba y Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). ). Por otro lado, el estudio actual descubrió TF (p. ej., TF MYB) que mostraban una expresión diferencial en hojas tratadas con MeJA y simuladas con patrones de expresión similares a los de los genes biosintéticos de HT, flavonoides y antocianinas (Fig. 7; Tabla 1) . Estos TF están potencialmente involucrados en la regulación de las vías de HT, flavonoides y antocianinas, lo que justifica una mayor investigación en el futuro.

Vale la pena señalar que nuestro estudio reveló un aumento específico en los flavonoides metilados y disminuciones generales en otros flavonoides en hojas de granada tratadas con MeJA, lo que sugiere un papel potencial de los flavonoides metilados en la defensa de las hojas de granada contra patógenos (Fig. 3; Tabla S6). El informe anterior sobre frutas de granada tratadas con MeJA mostró una mayor acumulación de flavonoides, aunque solo se determinó el contenido total de flavonoides sin cuantificar las moléculas de flavonoides individuales (Koushesh Saba y Zarei 2019). Como tal, se necesita un análisis más profundo de las frutas de granada tratadas con MeJA para permitir una comparación lado a lado de los cambios de flavonoides en los tejidos de las hojas y las frutas. En contraste con el aumento de antocianinas en las frutas de granada después de las aplicaciones de MeJA (Garcia-Pastor et al.2020), el nivel de antocianinas se redujo en las hojas tratadas con MeJA (Fig. 3; Tabla S6). Esta disparidad podría deberse a los distintos roles que desempeñan las antocianinas en los tejidos de las hojas y los frutos ante los ataques de patógenos. De hecho, la acumulación diferencial de antocianinas en hojas y frutos subraya la necesidad de examinar las respuestas de MeJA en diferentes tejidos de granada.

Observaciones finales

Nuestro estudio reveló cambios metabólicos únicos en HT, flavonoides, antocianinas y fitooxilipinas en hojas de granada provocados por la aplicación exógena de MeJA. El transcriptoma y los análisis bioquímicos sugirieron que, si bien la supresión de múltiples flavonoides y antocianinas ocurre al menos parcialmente a nivel transcripcional, es probable que el aumento de la biosíntesis de fitooxilipinas que no son JA no se controle transcripcionalmente. Este trabajo impulsa nuevas investigaciones sobre la arquitectura reguladora del metabolismo de HT, flavonoides y antocianinas, la orquestación de respuestas metabólicas en hojas de granada a la aplicación de MeJA, así como el papel que juegan los metabolitos con acumulación inducida en la señalización y/o defensa química directa.

Declaración de contribuciones del autor LC y LT concibieron el estudio. LC y WS realizaron experimentos. LC, WS y LT analizaron los datos. LC, WS y LT escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Información complementaria La versión en línea contiene material complementario disponible en https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9.

Agradecimientos Agradecemos a los colegas de la Academia Panzhihua de Ciencias Agrícolas y Forestales por proporcionarnos las semillas de granada utilizadas en este estudio. También agradecemos al Dr. Binjie Ge del Jardín Botánico Chenshan de Shanghái por su asistencia en la identificación y el registro del espécimen del comprobante.

Financiamiento Este trabajo fue apoyado por la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái bajo la subvención 14DZ2260400 y el Fondo Especial para la Investigación Científica de la Oficina Administrativa de Paisajismo y Apariencia de la Ciudad de Shanghái bajo las subvenciones G172403 y G182403.

Disponibilidad de datos y materiales Los conjuntos de datos de transcriptoma generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en Sequence Read Archive (SRA) en NCBI con el número de acceso PRJNA600139. Los conjuntos de datos de perfiles de metabolitos generados y analizados durante el estudio actual se incluyen en este documento publicado. artículo y sus archivos complementarios.

Este artículo está extraído de Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9