MiR‑214 mejora la lesión renal aguda inducida por sepsis a través de la autofagia regulada por PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
Resumen. Estudios previos han sugerido que el estrés oxidativo y la autofagia resultan enlesión renal (AKI) durante la sepsis y microRNA (miR)‑214 desempeña un papel vital en la protección deriñonessometidos a estrés oxidativo. El presente estudio tuvo como objetivo probar si la renoprotección de miR‑214 está relacionada con la autofagia en la sepsis. El papel de la autofagia se investigó en un modelo de ratón de ligadura y punción cecal (CLP). Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) para analizar la expresión de miR-214. La estructura y función deriñonesrecolectados de los ratones fueron evaluados.RiñónLos niveles de autofagia se detectaron con inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y transferencia Western. Se descubrió que miR‑214 podía aliviar la AKI en ratones sépticos al inhibir el nivel deriñónautofagia. Además, miR-214 inhibió la autofagia al silenciar la expresión de PTEN en elriñóntejidos de ratones sépticos. Estos hallazgos indicaron que miR‑214 mejoró la LRA inducida por CLP al reducir el estrés oxidativo e inhibir la autofagia a través de la regulación de la vía PTEN/AKT/mTOR.
Palabras clave:microRNA‑214, sepsis, lesión renal aguda, autofagia, renal
Introducción Agudolesión renal(AKI) es una de las complicaciones más comunes de la sepsis y ocurre en el 40-50 por ciento de los pacientes sépticos, con una tasa de mortalidad de hasta el 60 por ciento (1). Sin embargo, la patogenia de la LRA inducida por sepsis sigue sin estar clara. Se ha informado que la autofagia desempeña un papel clave en la LRA inducida por sepsis y la inhibición de la autofagia da como resultado el desarrollo de LRA durante la sepsis (2,3). Estudios previos (4,5) han confirmado que la sepsis desencadena la autofagia en múltiples órganos, incluido elriñón(6) y los procesos autofágicos están involucrados en la eliminación de las mitocondrias dañadas y el estrés oxidativo (7). Sin embargo, la autofagia excesiva puede causar una muerte celular no deseada y perjudicial (8). Por lo tanto, un nivel moderado de autofagia es la clave para reducir la LRA inducida por sepsis. Estudios anteriores informaron que miR-214 mejora la LRA inducida por isquemia-reperfusión al inhibir la apoptosis (9) y miR-214 suprime el estrés oxidativo en la nefropatía diabética a través de la vía de señalización de especies reactivas de oxígeno (ROS)/AKT/mTOR (10). El presente estudio encontró que miR‑214 puede atenuar la disfunción miocárdica inducida por sepsis en ratones al inhibir la autofagia (11). Sin embargo, queda por dilucidar si miR‑214 puede mejorar la LRA inducida por sepsis. En el presente estudio, se planteó la hipótesis de que miR‑214 atenúa la LRA inducida por CLP al reducir el estrés oxidativo e inhibir la autofagia a través de la regulación de la vía PTEN/AKT/mTOR.
LA CITANCHE MEJORARÁ LA ENFERMEDAD RENAL/RENAL
materiales y métodos
animalesEn el presente estudio se utilizaron un total de 100 ratones macho Kunming (peso, 20,40 ± 2,92 g; edad, 6‑8 semanas) suministrados por el Centro de animales de laboratorio médico de la Universidad médica de Hebei (Shijiazhuang, China). Todos los ratones se aclimataron a un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 24 °C con un 50 % de humedad y se les dio acceso libre a comida y agua en una semana antes de los experimentos. Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricta conformidad con las pautas del Instituto Nacional de Salud (NIH Publicación No. 85-23, revisada en 1996) y la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Central de Cangzhou (aprobación no. 2017-020- 01). Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia y se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento.
Ligadura y punción cecal (CLP).CLP se realizó en ratones para crear un modelo de sepsis murina, como se describió anteriormente (12). Después de la anestesia por inhalación de isoflurano (inducida al 3 por ciento y mantenida al 0,5 por ciento), se cortó una incisión en la línea media de 1 cm. El ciego expuesto (a 1 cm de distancia del extremo) se ligó con dos punciones utilizando una aguja de calibre 23. El ciego extrajo suavemente una pequeña cantidad de heces y se volvió a colocar en su posición anatómica. La pared abdominal se suturó por capas con una trenza de seda de 3‑0. Después del procedimiento, se inyectó subcutáneamente 1 ml de 0.9 por ciento de solución salina. A los ratones se les proporcionó acceso libre solo a agua. Los ratones del modelo simulado se operaron de la misma manera que el modelo CLP sin CLP.
Diseño experimental. Los ratones (n=6 para cirugía simulada y CLP) se asignaron aleatoriamente a siete grupos: grupo simulado, grupo CLP, adenovirus (Ad)‑proteína verde fluorescente (GFP) más grupo CLP, Ad‑miR‑214 más grupo CLP , anti‑miR‑214 más grupo CLP, inhibidor de PTEN más grupo CLP y Ad‑miR‑214 más inhibidor de PTEN más grupo CLP. Los ratones del grupo Sham se expusieron al mismo procedimiento pero sin ligadura ni punción del ciego. Los ratones de los otros grupos recibieron ligadura cecal y perforación. Todos los ratones fueron anestesiados rápidamente por inhalación de isoflurano para recolectar sangre, orina yriñónmuestras 24 h después del último tratamiento.
Ad-miR-214, anti-miR-214 o Ad-GFP mediados por adenovirustransferencia génica in vivo e inyección de inhibidor de PTEN. Se administró Ad‑miR‑214, anti‑miR‑214 o Ad‑GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) en la cavidad abdominal de los ratones 4 días antes del CLP. Brevemente, los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano. Se administró un catéter que contenía 200 µl de adenovirus (2x1011 pfu, que expresan miR‑214, anti‑miR‑214 o Ad‑GFP) a ratones normales mediante inyección intraperitoneal. El inhibidor de PTEN (VO‑OHpic, intraperitoneal, Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) se administró a ratones CLP que habían recibido anti‑miR‑214 mediante inyección intraperitoneal en una dosis única de 10 µg/kg 30 min antes de la administración de adenovirus .
Evaluación de la función renal. Se recogieron muestras de sangre del corazón de los ratones, seguidas de centrifugación (a temperatura ambiente durante 15 min a 3,000 xg) para recoger el suero. Los niveles séricos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina sérica (Cr) se determinaron utilizando un analizador automático Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA se utilizó para analizar los niveles delesión renalmolécula-1 (KIM-1; n.° de cat. RKM100; R&D Systems, Inc.) y lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL; n.° de cat. DY3508; R&D Systems, Inc.) en muestras de orina.
Ensayo de citoquinas de inflamación sérica.El suero TNF- (n.º de cat. H052) y la IL-6 (n.º de cat. H007) se examinaron utilizando kits ELISA comerciales (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Medición de marcadores de estrés oxidativo. Se utilizó el kit de ensayo correspondiente (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) para medir los niveles de malondialdehído (MDA) y probar la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Histología y puntuación de lesión tubular. Todos los ratones fueron sometidos ariñónperfusión bajo anestesia 24 h después de CLP. losriñónlas muestras se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante 72 horas a 4 °C. A continuación, las muestras de tejido se deshidrataron en una serie graduada de soluciones de etanol, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 µm. Se cortaron secciones (4 µm) usando un micrótomo y las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina (5 min) y eosina (1 min) a temperatura ambiente para el examen histológico. Los portaobjetos se evaluaron y calificaron usando un microscopio (BX51, Olympus Corporation).Renaltissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 por ciento (13).
Microscopía electrónica de transmisión (TEM).Nuevoriñonesse lavaron en solución salina tamponada con fosfato, se cortaron en cubos de 1 mm y se fijaron secuencialmente en glutaraldehído al 2,5 por ciento durante 24 horas a 4 °C. Las secciones se sumergieron en tetróxido de osmio al 1 por ciento durante 2 horas a 4 °C, se deshidrataron en etanol graduado y se incluyeron en resina epoxi. Finalmente, las secciones ultrafinas (60 nm) se tiñeron dos veces con acetato de uranilo y citrato de plomo a 20 °C durante 60 min. La observación se realizó en un microscopio electrónico de transmisión (Tecnai; Hitachi, Ltd.) a 80 kV utilizando Electron Microscopy Film 4489 (ESTAR base gruesa; Kodak).
Inmunohistoquímica (IHC).Nuevoriñónlos tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4 % (durante 72 h a 4 °C) y se incluyeron en parafina. Las muestras se cortaron en secciones de 4 µm de espesor y se desparafinizaron en xileno. Después de lavar las secciones de tejido con PBS, se hirvieron en tampón de citrato 10 mM (pH 6.0) durante 4 min para la recuperación del antígeno y luego se bloquearon con suero de cabra al 10 % en PBS a temperatura ambiente. durante 1 h. El anticuerpo primario (anti‑LC3B; 1:400; n.º de cat. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) se añadió de acuerdo con las instrucciones y se incubó a 4 °C durante 12 h. Se añadió el anticuerpo secundario (HRP anti-conejo de cabra; 1:2,000; nº de cat. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió DAB (100 µl) y se contratiñó durante 5 min con la tinción observada bajo un microscopio óptico (Modelo CX31-P; Olympus Corporation). La intensidad de la tinción positiva, que apareció marrón, se determinó utilizando el software de análisis de imágenes Image‑Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). Se calculó la densidad óptica integral (IOD) para representar la intensidad. Los valores de IOD aumentaron a medida que aumentaba la expresión de proteínas.
Transcripción inversa-cuantitativa(RT‑q) PCR. El ARN total se extrajo detejido renaltras la inducción del modelo utilizando el reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). De acuerdo con las instrucciones del kit de transcripción inversa TaqMan (n.º de cat. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), el ARN se transcribió inversamente en ADNc. Se utilizaron las siguientes condiciones de termociclado (miR‑214): desnaturalización inicial a 95 ˚C durante 5 min; seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95˚C durante 30 segundos, recocido a 60˚C durante 30 segundos y elongación a 72˚C durante 30 segundos. La RT‑qPCR se realizó con un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7500 (PerkinElmer, Inc.) y un kit de PCR SYBR Green estándar (Toyobo Life Science). U6 se utilizó como control interno para miR‑214. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: miR‑214, directo, 5'‑AGCATAATACAGCAGGCACAGAC‑3' y reverso, 5'‑AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC‑3'; U6, adelante, 5'‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3' y atrás, 5'‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3'. Estos experimentos se replicaron seis veces. Los resultados se analizaron utilizando el método 2-ΔΔCq (14). Los niveles de expresión de ARNm de LC3, p62, PTEN, AKT y mTOR se evaluaron mediante RT‑qPCR. Con la ‑actina como referencia interna de estos genes, se utilizó el 2‑ΔΔCq para medir la expresión relativa de los genes diana. Las secuencias de cebadores que se muestran en la Tabla I fueron sintetizadas por Sangon Biotech Co., Ltd.
transferencia occidental. Riñónel tejido se mezcló con lisado RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology) para hacer el homogeneizado y la lisis se detuvo cuando no se observó tejido visible. Las muestras se centrifugaron a 13,000 xg durante 10 min a -4˚C y el sobrenadante se recuperó para el análisis de transferencia Western. En resumen, las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteínas micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Las muestras de proteínas (80 µg por muestra) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio reductor al 12 % y luego se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno a 4 °C durante la noche. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de PVDF. Después del bloqueo en leche desnatada al 5 % a temperatura ambiente durante 2 h, las membranas se incubaron durante la noche (a 4 °C) con anticuerpos primarios. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios (todos de Cell Signaling Technology, Inc.): cadena ligera 3B (1:1,000; n.° de cat. 4412), p62 (1:1,000; cat .n.º 4412), anti‑PTEN (1:1,000; n.º de cat. 9188), anti‑fosforilado (p)‑AKT (Ser473) (1:1,000); cat. . n.º 4060), anti‑AKT (1:1,000; n.º de cat. 9272), anti‑p‑mTOR (Ser 2448) (1:1,000; n.º de cat. . 5536), anti-mTOR (1:1,000; n.º de cat. 2972) y -actina (1:2,000; n.º de cat. 4970). Después del lavado, las membranas se incubaron (a temperatura ambiente durante 2 h) con los anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con HRP (1:3,000; n.º de cat. A0208; Instituto de Biotecnología Beyotime). Las bandas de proteína se detectaron con Immobilon Western (MilliporeSigma) y se analizaron con el software Total‑Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). La expresión de proteína se normalizó a -actina.
Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Todos los datos se presentaron como medias ± desviación estándar o medianas (rango intercuartílico) para las variables continuas, según sus distribuciones. Las características iniciales y los resultados se compararon mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba posthoc de Tukey o la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Dunn, según corresponda. PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultados
Punto de tiempo 24 h después de CLP. Estudios previos informaron (6,15,16) que el análisis bioquímico (es decir, LC3 y p62) revela que el flujo de autofagia se suprime con la progresión de la sepsis después de 6 a 8 h de CLP. En el presente estudio, el número de autolisosomas en elriñónde ratones tratados con CLP aumentó dentro de las 24 h posteriores a la cirugía. Además, el análisis de marcadores delesión renalmostró quefunción renalse dañó más gravemente 24 h después de CLP. Por lo tanto, se eligió el punto de tiempo 24 h después de CLP para los siguientes experimentos.
Efecto regulador sobre miR‑214 en tejidos renales. Se utilizó el análisis RT-qPCR para detectar la expresión de miR-214 en ratones tratados con CLP. Se encontró que la expresión de miR‑214 estaba ligeramente aumentada en elriñóntejidos después de la cirugía CLP 24 h, en comparación con el grupo simulado (1,47 veces, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">riñóntejido, en comparación con el grupo simulado (tanto P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
LA CITANCHE MEJORARÁ LA INSUFICIENCIA RENAL/RENAL
Efecto de miR‑214 sobre la disfunción renal en ratones sépticos.Todos los ratones fueron sacrificados para recolectar sangre, orina yriñónmuestras 24 h después de la cirugía CLP. BUN y Cr son indicadores importantes de la gravedad derenaldeterioro (17). Además, NGAL y KIM-1 se han identificado como biomarcadores específicos delesión renaly su mayor expresión se asocia con la tempranarenallesión tubular en AKI (17). Como se muestra en la Fig. 2A-D, los niveles de BUN, Cr, KIM-1 y NGAL aumentaron significativamente después de la cirugía CLP en comparación con el grupo simulado. Sin embargo, Ad‑miR‑214 disminuyó significativamente los niveles de BUN, Cr, KIM‑1 y NGAL en comparación con el grupo CLP (todos P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">Función del riñónparámetros Sin embargo, después del pretratamiento con inhibidor de PTEN, se mejoraron los efectos de protección de Ad-miR-214. Los resultados muestran que miR‑214 atenúa la disfunción renal en ratones sépticos.
Efecto de miR‑214 sobre la inflamación renal y el estrés oxidativo.Como se muestra en las Fig. 3A y B, CLP elevó significativamente los niveles de TNF- e IL-6, mientras que Ad-miR-214 disminuyó significativamente los niveles de estos marcadores. Comparado con el
Efecto de miR‑214 sobre la autofagia renal en ratones sépticos.El presente estudio examinó los cambios en LC3 enriñóntejidos mediante tinción IHC. Como se muestra en la Fig. 6, la intensidad de la tinción positiva de LC3 aumentó significativamente en el grupo CLP en comparación con el grupo simulado (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR‑214 activa la vía AKT/mTOR para inhibirautofagia al silenciar PTEN en tejidos renales.El efecto de CLP en la autofagia enriñóntejidos se investigó evaluando los niveles de LC3‑II/I y p62. La vía de señalización PTEN/AKT/mTOR cumple una función importante en la autofagia (18). Para investigar el efecto de miR‑214 en la vía PTEN‑AKT/mTOR, se analizaron los niveles de proteína de LC3‑II/I, p62, AKT, p‑AKT, mTOR, p‑mTOR y PTEN mediante transferencia Western y RT‑ Análisis qPCR. Como se muestra en la Fig. 7A-C, la modificación en estas proteínas ocurre rápidamente, con un aumento en la tasa de LC3-II/LC3-I y una reducción en los niveles de p62 (tanto P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">riñón tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Estos resultados mostraron que la autofagia fue inducida por CLP y la sobreexpresión de miR-214 podría inhibirla parcialmente.
Como se muestra en la Fig. 7A y D‑F, el nivel de expresión de PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">riñón tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Estos hallazgos sugieren que CLP induceriñónautofagia tisular al inhibir la vía AKT/mTOR. Ad‑miR‑214 activó la vía AKT/mTOR al silenciar PTEN enriñóntejidos Sin embargo, en comparación con el grupo CLP, anti-miR-214 no inhibió significativamente la expresión de mTOR. Por lo tanto, la RT‑qPCR se usó más para determinar la expresión de ARNm de genes relacionados con la vía de señalización de PTEN/AKT/mTOR. De acuerdo con los resultados de RT-qPCR (Fig. 8), en comparación con el grupo Sham, los niveles de expresión de ARNm de p62, LC3 y PTEN aumentaron notablemente, mientras que la expresión de ARNm de AKT y mTOR disminuyó en el grupo CLP. Comparado con el grupo CLP, el Ad‑miR‑214, PTEN
Los grupos inhibidor y Ad‑miR‑214 más inhibidor de PTEN mostraron una expresión reducida de ARNm de LC3 y PTEN, pero una expresión aumentada de ARNm de p62, AKT y mTOR (todos P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Por lo tanto, el efecto de p62 en la autofagia puede ocurrir a nivel transcripcional más que a nivel postranscripcional. Los resultados actuales demostraron que miR‑214 regulaba a la baja la expresión de PTEN y activaba la vía de señalización de AKT/mTOR.
Discusión
El presente estudio encontró que la autofagia excesiva fue perjudicial parafunción renalen ratones sépticos. Estudios previos han demostrado que miR-214 está asociado con una mayor proliferación, metástasis, invasión y funciona como un oncogén para células y tejidos (19-22). Los estudios informan que miR‑214 cumple una función protectora contra la LRA a través de la atenuación de la apoptosis, el estrés oxidativo y la regulación negativa de los factores inflamatorios (21,23). El presente estudio examinó más a fondo los mecanismos subyacentes al efecto protector de miR‑214 en la LRA inducida por sepsis centrándose en la posible participación de miR‑214 en la modulación de la autofagia. Los resultados mostraron que el estrés oxidativo ocurrió en elriñóndespués de la administración de la cirugía CLP. Mientras tanto, la activación de la autofagia se produce en elriñón.LC3 II/I elevado y la reducción de p62 en elriñónse observó después del tratamiento con cirugía CLP. Como era de esperar, la sobreexpresión de miR-214 atenuó significativamenteriñónlesiones patológicas yriñóndisfunción causada por la sepsis. Sin embargo, la inhibición de miR-214 mostró una tendencia opuesta a la renoprotección. Además, el inhibidor de PTEN mejoró el efecto de protección de Ad‑miR‑214.
en un sépticoriñón, la inflamación excesiva se acompaña de aumentos masivos en la producción de ROS y una gran cantidad de ROS desencadena cambios en la estructura mitocondrial y altera la función mitocondrial, lo que hace que el cuerpo entre en un círculo vicioso que agravariñóndaño (24,25). Por lo tanto, el estrés oxidativo puede ser uno de los principales mecanismos patológicos de la LRA inducida por sepsis. El presente estudio proporcionó evidencia adicional que demuestra un estrés oxidativo excesivo, que fue indicado por una mayor producción de MDA y una actividad reducida de SOD en elriñóntejidos después de la cirugía CLP. Además, se encontró que la sobreexpresión de miR-214 podría proteger elriñóncontra la lesión oxidativa inducida por CLP, que está involucrada en la inhibición autofágica. Esto es consistente con los estudios previos de que miR-214 protege varias células y tejidos contra el estrés oxidativo (26,27).
La autofagia sirve como una 'espada de doble filo' en el desarrollo de la sepsis: la autofagia basal puede ejercer efectos protectores al eliminar las proteínas oxidativas tóxicas, pero la autofagia excesiva puede conducir a la muerte celular autofágica bajo estrés severo, como la erupción de ROS (28,29) . Se ha demostrado que la autofagia se activa inicialmente en la sepsis, seguida de una fase posterior de disfunción debido a la muerte celular autofágica (30), que agrava la lesión oxidativa inducida por la sepsis. En el presente estudio, el inhibidor de PTEN o la sobreexpresión de miR-214 mostraron una renoprotección antioxidante en ratones tratados con CLP. Sin embargo, la inhibición de miR‑214 mostró una tendencia opuesta a la renoprotección antioxidante. Así que la autofagia excesiva o inadecuada puede causarDaño en el riñón; ambos son desadaptativos y eventualmente provocan la muerte celular. Por lo tanto, mantener niveles moderados de autofagia es la clave para atenuar el daño oxidativo en condiciones sépticas.
LA CITANCHE MEJORARÁ EL DOLOR DE RIÑÓN/RENAL
La evidencia acumulada ha indicado que miR‑214 inhibe la autofagia en varias células y tejidos (31‑33). En el presente estudio, se encontró que la sobreexpresión de miR-214 inhibe la autofagia inducida por CLP entejidos renales,como lo indican los cambios en los marcadores de proteínas, como LC3‑II/I y p62. Además, los resultados demostraron que la sobreexpresión de miR-214 atenuó la lesión oxidativa inducida por CLP al inhibir la autofagia excesiva. El presente estudio también investigó los mecanismos moleculares por los cuales miR‑214 modulariñónautofagia en LRA inducida por sepsis. PTEN/AKT/mTOR es una vía de señalización importante que regulariñónautofagia (34,35) y que desempeña un papel clave en la LRA inducida por sepsis, y PTEN es un inhibidor negativo de la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR. Estudios anteriores informaron que miR‑214 puede regular la autofagia a través de la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR en varios modelos (36‑38). Ma et al (39) encontraron que miR-214 puede regular a la baja la autofagia en riñones diabéticos. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que los efectos de miR‑214 en la LRA inducida por CLP podrían estar implicados en la regulación de la vía PTEN/AKT/mTOR. En particular, los resultados del presente estudio mostraron que la cirugía CLP elevó significativamente los niveles de PTEN pero disminuyó los niveles de p-AKT y p-mTOR, lo que indica que la cirugía CLP inactivó la vía AKT/mTOR. Además, la sobreexpresión de miR‑214 activó la vía AKT/mTOR mediante el silenciamiento de PTEN en la autofagia inducida por CLP enriñóntejidos Sin embargo, anti-miR-214 no inhibió significativamente la expresión de mTOR en los análisis de transferencia Western. Por lo tanto, la RT-qPCR se usó más para determinar la expresión de ARNm de genes relacionados con la vía de señalización de PTEN/AKT/mTOR. El presente estudio identificó que miR‑214 reducía la expresión de PTEN y activaba la vía de señalización de AKT/mTOR para inhibir la autofagia. Sin embargo, se deben realizar más estudios exhaustivos para obtener detalles adicionales relacionados con el mecanismo deriñónautofagia en condiciones sépticas.
Para concluir, los resultados del presente estudio sugirieron que miR‑214 desempeñó un papel protector contra la sepsis inducida porlesión renalal reducir el estrés oxidativo e inhibir la autofagia mediante la regulación de la vía PTEN/AKT/mTOR. Los hallazgos actuales sugirieron que miR-214 puede ser un objetivo terapéutico potencial para la LRA inducida por sepsis. Sin embargo, el presente estudio utilizó ratones de 6 a 8 semanas de edad, por lo que se necesita más investigación sobre el mecanismo de miR-214 en ratones adultos.