Análisis morfológicos de la expresión de nefrina en la glomerulonefropatía progresiva

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Resumen:

En este estudio, nos centramos en la nefrina, una de las moléculas clave dentro del diafragma de hendidura de los podocitos, ya que aunque ha habido informes sobre su expresión en humanos y ratas, no se ha informado de su presencia en titíes comunes. Investigamos la expresión de nefrina y los cambios en los glomérulos, dependiendo del desarrollo de glomerulonefropatía progresiva espontánea en titíes comunes. Se evaluaron diecinueve titíes comunes de dos a diez años de edad. El riñón se examinó al microscopio con hematoxilina y eosina y tinción inmunohistoquímica para nefrina. Las lesiones se clasificaron en tres grados de acuerdo con un sistema de clasificación de lesiones renales informado anteriormente. El área de nefrina positiva se midió mediante análisis morfométrico y se calculó la proporción de nefrina positiva. Se observó expresión de nefrina a lo largo del asa capilar glomerular en un patrón lineal continuo en los grados de lesión renal 0 a 2 y un patrón lineal discontinuo o granular grueso en el grado 3. La expresión de nefrina tendió a disminuir significativamente según el grado de las lesiones renales . Se ha sugerido que la alteración en la expresión de nefrina juega un papel importante en la progresión de las lesiones renales.

Palabras clave:nefrina, tití,glomerulonefropatía, riñón, patología

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Introducción

Se sabe que la glomerulonefropatía progresiva espontánea en los titíes comunes (Callithrix jacchus) ocurre con frecuencia a partir de los dos años de edad, y la gravedad de la lesión progresa con la edad. Previamente reportamos lesiones primarias y progresivas de nefropatía en titíes comunes1. Los cambios glomerulares primarios de la nefropatía en etapa temprana se caracterizan por el borramiento de los pies de los podocitos y el engrosamiento parcial de la membrana basal glomerular, que se supone que causan la fuga de proteínas de los glomérulos, y pueden observarse con ultramicroscopía pero no con microscopía óptica1–3. Además, la inmunoglobulina juega un papel importante en la progresión de la nefropatía1, 2. La IgM se deposita en el mesangio en la etapa temprana de la glomerulonefropatía, y luego del primer depósito de IgM, el área de depósito se expande a todo el glomérulo, y las IgA e IgG se depositado con progresión2. Los cilindros hialinos que sugieren una fuga de proteína de los glomérulos se pueden observar mediante microscopía óptica con la progresión de la glomerulonefropatía4. La proteinuria exacerba la progresión de las lesiones tubulointersticiales en los titíes comunes4, como en los humanos5, 6 y, en un estudio reciente de los glomérulos, la proteinuria podría ser inducida por trastornos del diafragma de hendidura, uniendo así los procesos del pie adyacentes (pedicelos) del podocito. El diafragma de hendidura es un complejo de unión intercelular presente entre procesos podales adyacentes, y se han identificado algunas moléculas relacionadas con su formación3. Se pensaba que una disminución en la expresión de estas moléculas o una disfunción del diafragma de hendidura estaba relacionada con la progresión de la proteinuria3. La nefrina, una de las moléculas clave expresadas en el diafragma de hendidura de los podocitos, es una glicoproteína que consta de 1241 aminoácidos y es un biomarcador bien conocido que se utiliza para monitorear el trastorno de los diafragmas de hendidura7–10. Las moléculas relacionadas con los diafragmas de hendidura no se han estudiado en la nefropatía de los titíes comunes, aunque se sabe que en ellos se produce la alteración de los procesos podocitarios y la progresión de la proteinuria. Además, ha habido informes sobre la expresión de nefrina en humanos y ratas7–12, pero no en titíes. Por lo tanto, investigamos la expresión de nefrina en los glomérulos y los cambios en la expresión de nefrina, según la progresión de la lesión, mediante análisis inmunohistoquímicos.

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Materiales y métodos

animales

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Institución Central para Animales de Experimentación (CIEA; Kawasaki, Japón) y se llevó a cabo en estricta conformidad con las Regulaciones para la Experimentación Animal de la CIEA basadas en las Pautas para la Conducta Adecuada de Experimentos con animales (Consejo de Ciencias de Japón, 2006). Se evaluaron diecinueve titíes comunes (11 machos y 8 hembras) de CLEA Japan Inc. (Tokio, Japón). Sus edades oscilaban entre 2 y 10 años en el momento de la necropsia. Los animales se alojaron en jaulas en una sala para animales mantenida a una temperatura de 26 ± 3 grados y una humedad de 55 ± 20 por ciento. Se alimentaron con LCMS-1M (CLEA Japan Inc., Tokio, Japón) y agua del grifo. Los animales fueron sacrificados humanitariamente bajo anestesia con pentobarbital sódico debido a diversas causas de moribundo (como la sintesis, la curvatura de las vértebras lumbares, la dislocación de la articulación mandibular, etc.). No se realizó análisis de orina porque no se pudo tomar una muestra de orina.

Histopatología

losriñonesfueron perfundidos con solución salina, seguidos de paraformaldehído al 4 por ciento y luego fijados en formalina tamponada neutra al 10 por ciento para examen microscópico. Los especímenes se incluyeron en parafina, se seccionaron a 5 μm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Las lesiones se clasificaron como lesiones glomerulares, tubulares e intersticiales según los criterios publicados1. Los grados de nefropatía se dividieron en cuatro grupos: grado 1 (3 hombres y 1 mujer), grado 2 (3 hombres y 5 mujeres), grado 3 (1 hombre y 3 mujeres) y grado 4 (3 hombres) (tabla 1).

Para inmunohistoquímica, un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de origen humanonefrina(1:1,000, nefrinag{{0}}, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EE. UU.) como anticuerpo principal. Las secciones de 5-μm se desparafinaron, se rehidrataron, se trataron con peróxido de hidrógeno al 3 % a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se calentaron en un autoclave a 121 grados durante 20 minutos en una solución de recuperación de objetivos (pH 6,0, Dako, Glostrup, Dinamarca). Después de enfriar, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario a 4 grados durante la noche. Se utilizó polímero IgG anti-ratón y anti-conejo conjugado con peroxidasa (Histofine Simple Stain Rat MAX-PO(MULTI), Nichirei Bioscience Inc., Tokio, Japón) como anticuerpo secundario para el método basado en polímeros13. Las secciones se incubaron con el anticuerpo polimérico secundario a temperatura ambiente durante 30 min y los productos de reacción se visualizaron utilizando 3,3'-diaminobencidina como cromógeno. La contratinción se realizó con hematoxilina. Para el control negativo, se omitió el anticuerpo primario.

Análisis morfológico

Para el análisis morfológico, se sometieron a examen los glomérulos con el hilio glomerular y se capturaron de 16 a 28 glomérulos en cada portaobjetos (Tabla 1) utilizando un escáner de portaobjetos completo (Aperio AT2, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, EE. UU.) y un software de visualización de portaobjetos de patología correspondiente (Aperio ImageScope, Leica Microsystems Inc.) con la misma resolución y tamaño de imagen.nefrina-Las áreas glomerulares positivas y completas se calcularon con un software de análisis de imágenes (Image-Pro V10, Mediacybenetics Inc., Rockville MD, EE. UU.) dibujando una región de interés alrededor del glomérulo, según un informe anterior14. Se definió toda el área glomerular como el área que se puede distinguir del fondo de color blanco. Los umbrales de color para calcularnefrina-Se determinaron áreas positivas según cada condición de tinción. Los umbrales para rojo, verde y azul fueron 37–67, 31–77 y 32–88, respectivamente. La proporción de nefrina positiva se calculó dividiendo las medidas de losnefrina-área positiva sobre el área glomerular. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de Jonckheere (nivel de significación: 5 por ciento, prueba unilateral) para evaluar la tendencia entre el grado de nefropatía y la expresión denefrina.

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Resultados

Las puntuaciones anatomopatológicas y los grados de las lesiones renales individuales se muestran en la Tabla 1. Al igual que en nuestro primer informe1, el grado de la lesión tendió a aumentar con la edad y no hubo una diferencia evidente entre los sexos. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica denefrinase muestran en la Fig. 1, y elnefrinaLa relación positiva se muestra en la Fig. 2 y la Tabla 1. Entre las puntuaciones y grados en la Tabla 1, el grado de lesión renal, derivado de la puntuación total de cada lesión renal, y la puntuación de yeso hialino se usaron para comparar con elnefrina-relación positiva (Fig. 2 y 3). Los casos individuales en la Tabla 1 se muestran en orden ascendente de grado de lesión renal. La expresión de nefrina se observó junto con el asa capilar glomerular en un patrón lineal continuo en los grados 0 a 2 (Fig. 1A-C) y un patrón lineal discontinuo o granular grueso en los grados 3 (Fig. 1D). En la muestra de control negativo, ninguna reacción positiva paranefrinase observó en ningún sitio.

la comparacion de losnefrina-la relación positiva con el grado de lesión renal se muestra en la Fig. 2. En los casos de grado de lesión renal 0, la media ± desviación estándar (SD) de lanefrina-la relación positiva fue 5,66 ± 1,18 por ciento, y los valores máximo, mínimo y mediano fueron 6,84 por ciento, 4,27 por ciento y 5,76 por ciento, respectivamente. En los casos de grado 1, la media ± DE fue de 3,99 ± 1,61 % y los valores máximo, mínimo y mediano fueron de 5,69 %, 1,19 % y 4,35 %, respectivamente. En los casos de grado 2, la media ± SD fue 3,82 ± 2,25 por ciento, y los valores máximo, mínimo y mediano fueron 6,71 por ciento, 1,58 por ciento y 3,49 por ciento, respectivamente. En los casos de grado 3, la media ± SD fue 2,52 ± 1,02 por ciento, y los valores máximo, mínimo y mediano fueron 3,67 por ciento, 2,17 por ciento y 2,17 por ciento, respectivamente. En conjunto, las diferencias individuales en la expresión de nefrina fueron pequeñas en los casos de grado 0, pero grandes en los casos de grado 1 o superior, y se detectó esporádicamente una expresión positiva baja.nefrinala expresión tendía a disminuir según el grado de las lesiones renales (fig. 2). Hubo una tendencia significativamente más baja entre el grado de lesión renal ynefrina-proporción positiva según la prueba de Jonckheere (p=0.0166). La puntuación de yeso hialino en comparación con el grado de lesión renal se muestra en la Fig. 3. En los casos con una puntuación de yeso hialino de 0, la media ± DE de la proporción de nefrina positiva fue de 5,40 ± 1,32 por ciento, en los casos de puntuación 1, fue de 4,10 ± 1,70 por ciento, y en la puntuación de 2 casos, fue de 3,37 ± 1,98 por ciento. Hubo una tendencia significativamente más baja entre la puntuación de yeso hialino y la proporción de nefrina positiva según la prueba de Jonckheere (p=0.0654).

Discusión

Una disminución de la nefrina se correlacionó con la progresión de las lesiones renales durante el desarrollo de la glomerulonefropatía del tití. El anticuerpo antinefrina utilizado en este estudio reconoció el dominio extracelular en el lado N-terminal. Este dominio extracelular interactúa con las moléculas NEPH1 y forma una estructura similar a una cremallera dentro del diafragma de hendidura15. La localización de la nefrina en los glomérulos normales es a lo largo del asa capilar glomerular y el patrón de tinción es un patrón lineal de gránulos finos continuos tanto en ratas como en humanos11, 12, 16–18. La tinción realizada en este estudio es apropiada; lo cual se confirma al observar que las paredes de los capilares en contacto con la región mesangial no se tiñeron, mientras que las que estaban en contacto con los podocitos sí. En condiciones anormales, como el síndrome nefrótico en humanos o la nefrosis por puromicina aminonucleósido en ratas, el patrón de tinción de nefrina en los glomérulos es discontinuo y granular grueso, y la intensidad de la tinción inmunohistoquímica es más débil que en los glomérulos normales11, 16, 17. En el presente estudio , el patrón de expresión de nefrina en los grados 0 a 2 fue normal; sin embargo, el patrón de tinción en los grados 3 fue comparable al de condiciones anormales. En una investigación anterior de la expresión de nefrina glomerular en ratas Crl: CD(SD) con enfermedad de cambios mínimos, la expresión de nefrina estaba intacta, aunque los procesos podocitarios del pie mostraron borramiento bajo microscopía electrónica sin cambios morfológicos aparentes observados bajo microscopía óptica18. En la enfermedad renal común de las ratas, la nefropatía crónica progresiva (NPC), se ha demostrado que la albuminuria acompañada de NPC en etapa temprana puede provocar menos cambios en la permeabilidad glomerular debido a la incapacidad de reabsorber la albúmina de los túbulos proximales19. En humanos, ha habido algunas investigaciones sobre la reducción de la expresión de nefrina bajo cambios menores10 o bajo otras enfermedades renales14, 16. Por otro lado, ha habido un informe sobre la expresión de nefrina intacta en la nefrosis de cambios mínimos20. La presencia o ausencia de un cambio en la expresión de nefrina en la enfermedad nefrótica de cambios mínimos aún se discute. En realidad, fue difícil confirmar el aumento o la disminución de la reacción de anticuerpos de la nefrina mediante observación visual en la nefropatía de tití, pero fue posible detectar el cambio en todo el riñón mediante análisis de imágenes. Nuestra investigación sugiere que la anomalía de los diafragmas hendidos del glomérulo puede estar implicada en la progresión de la nefropatía en los titíes comunes debido a una disminución de la nefrina. La transformación del patrón de tinción positivo de la nefrina, de un patrón lineal a un patrón granular, se ha informado en un modelo animal de rata con enfermedad nefrótica durante el desarrollo de la lesión11, 16, 21. Se ha observado una asociación entre anomalías de la membrana de hendidura y proteinuria. reportado con frecuencia22, 23; por lo tanto, se ha especulado que la proteinuria puede ser causada por una disfunción del diafragma de hendidura. En nuestro estudio sobre la nefropatía en titíes, la progresión de la permeabilidad de las proteínas glomerulares debido a la disfunción del diafragma en hendidura podría haber ocurrido porque las características morfológicas de los cilindros hialinos se observaron solo en los casos sin cambios tubulointersticiales. En este estudio, no se observó diferencia estadísticamente significativa entre la puntuación de los cambios morfológicos de los cilindros hialinos y la disminución de la expresión de nefrina. Sin embargo, la expresión de nefrina tiende a disminuir dependiendo de la puntuación de yeso hialino, que es un indicador de fuga de proteínas del glomérulo.

En nuestra investigación anterior, se observó borramiento de los procesos podales en la etapa temprana de la nefropatía del tití y el área del proceso podal afectado se expandió según el grado de lesión renal1. La Tabla 2 muestra la relación entre la tasa de reducción de nefrina en este estudio y los hallazgos de microscopía electrónica para cada grado de lesión renal de un estudio anterior. Se cree que el borramiento se debe a una ruptura en el citoesqueleto de actina de los procesos del pie24. La nefrina se desfosforila cuando se construye la membrana de hendidura y se une a la actina a través de CD2AP y podocina25, 26. Cuando se lesiona un diafragma de hendidura, las moléculas de nefrina se agrupan, lo que induce la fosforilación de la nefrina, la polimerización de actina y el borramiento de los procesos del pie26. La fosforilación de la nefrina también ocurre rápidamente después de la inducción del borramiento del proceso del pie en el modelo de sulfato de protamina en ratones27. La nefrina es una proteína de adhesión glomerular asociada con la maduración, diferenciación, formación de procesos y señalización de los podocitos24. Nuestra investigación mostró que había una correlación entre la reducción de la expresión de nefrina, según lo determinado por inmunohistoquímica, y la progresión del grado de la lesión renal, lo que sugiere una expansión del borramiento de los pies de los podocitos. Sin embargo, no está claro si las anormalidades en el complejo proteico del diafragma de hendidura causan daño a los procesos de los pies de los podocitos o si el daño de los podocitos causa cambios en los diafragmas de hendidura y la reducción de la nefrina. Dado que la nefrina también está involucrada en la diferenciación de los podocitos, se cree que esta relación se aclarará aún más con los datos sobre la regeneración y diferenciación de los podocitos.

En conclusión, nuestros resultados proporcionan información sobrenefrinaexpresión en glomerulonefropatía progresiva en titíes comunes. El análisis morfológico reveló una tendencia más baja denefrinaexpresión en podocitos en glomerulonefropatía progresiva de tití común, y la alteración denefrinaSe sugirió que la expresión juega un papel importante en la progresión de las lesiones renales.

Divulgación de posibles conflictos de intereses:

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Reconocimiento:

Los autores desean agradecer al Sr. Takayoshi Ito por la excelente asistencia técnica que brindaron. Los autores también agradecen a la Sra. Kanae Tamatsukuri y al Sr. James Harada por la edición del idioma del manuscrito.

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