Los regímenes de vacunación de Chlamydia Trachomatis de refuerzo principal y multicomponente inducen respuestas de anticuerpos y células T y aceleran la eliminación de la infección en un modelo de primate no humano Ⅱ

Materiales y métodos

Antígenos vacunales y adyuvantes

En este estudio se utilizaron diferentes antígenos vacunales y adyuvantes: el antígeno vacunal CTH522, basado en MOMP (11) se administró por vía intramuscular (IM) con adyuvante CAF01 (42) o adyuvante de hidróxido de aluminio (AlOH), o por vía intranasal ( IN) sin adyuvante. La vacuna de ADN plasmídico, pcDNA3.1-MOMP, se elaboró ​​clonando MOMP consenso en el vector plasmídico pcDNA3.1 (14) y se administró por vía intradérmica (ID) con electroporación (EP) en la espalda. La vacuna recombinante de adenovirus humano de serotipo 5 (rHuAd5) que expresa MOMP (HuAd5-MOMP) se elaboró ​​mediante la recombinación homóloga de MOMP de consenso (AAC45154.1) en un vector pAL1112 del plásmido HuAd5 con eliminación de E1 y E2 y se administró por vía intramuscular (14) . Vacuna vaccinia modificada Ankara-MOMP fabricada porrecombinando consenso MOMP(AAC45154.1) en el plásmido p3186 y el vector MVA atenuado (14), y se administra a través delvía intramuscular.

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Stock de C. trachomatis serovar D

Chlamydia trachomatis serovar D (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se propagó en HeLa{ {2}} células, recolectadas y purificadas como se describe por Caldwell et al. (43). El stock de C. trachomatis SvD se almacenó a -80 grados en sacarosa 0,2 M, fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4) y ácido glutámico (SPG) 5 mM y se determinó la concentración de unidades formadoras de inclusiones (IFU) en células HeLa-229 y células McCoy.

Primates no humanos

Treinta macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) que pesaban de 3 a 5 kg se incluyeron en el estudio manejado en instalaciones de NHP de nivel de bioseguridad 3 (ABSL3) de IDMIT ("Modelos de enfermedades infecciosas y terapias innovadoras" en el CEA "Commissariat à l'Energie Atomique," Fontenay-aux-Roses, Francia, número de acreditación #D92- 032-02). Los protocolos fueron aprobados por el comité ético institucional "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) bajo el comunicado número A14-026. El estudio fue autorizado por el "Ministerio de Investigación, Innovación y Educación" con número de registro APAFIS#720-201505281237660. Todos los animales dieron negativo para SIV, SHIV, STLV (virus linfotrópico simio), virus del herpes B, filovirus, SRV-1, SRV-2 antes del estudio y se confirmó que eran seronegativos para la infección por clamidia. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices europeas para el cuidado de los animales ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", directiva 2010/63/UE, 22 de septiembre de 2010).

Protocolos de vacunación

Los 30 macacos se dividieron al azar en 6 grupos con 5 animales en cada uno. En la Figura 1 se ilustran en detalle los diferentes regímenes de vacunación de refuerzo para los 6 grupos. Durante todas las vacunas, los macacos fueron sedados con clorhidrato de ketamina (10 mg/kg de peso corporal por vía intramuscular). Se administró CTH522 (85 µg por animal) por vía intramuscular (IM) con adyuvante CAF{{20}}1 (625 µg/125 µg) o adyuvante AlOH (00,425 mg ), como se muestra en la Figura 1. Las inmunizaciones IM se realizaron en un volumen de 0,6 ml en el muslo derecho (M. quadriceps) del animal. Las inmunizaciones intranasales (IN) de CTH522 (30 µg por animal) se realizaron con un dispositivo Vaxinator conectado a una jeringa de 1 ml con dos administraciones sucesivas de 0,25 ml, una en cada fosa nasal. La vacuna DNA-MOMP se administró por vía intradérmica (ID) con electroporación (EP) en la piel del dorso. Se inyectaron 6 volúmenes repetidos de 0,1 ml ID (en total 1 mg) seguido de EP utilizando el sistema Nepagen™ (configuraciones: 6 pulsos cuadrados de 10 ms con intervalos de 90 ms a 110 V, (300- 700mA)) . La vacuna hAd5-MOMP se administró IM con una dosis de 1011 partículas virales en 1 ml por animal. La vacuna MVA-MOMP se administró IM con una dosis de 4*108 UFP por animal en un volumen de 0,5 ml**. El grupo naïve no recibió ninguna vacuna y se consideró que era el grupo de control.

Coleccion de muestra

Durante todos los procedimientos de muestreo, los macacos fueron sedados con clorhidrato de ketamina (10 mg/kg de peso corporal IM). Se recolectó sangre mediante venopunción femoral en las semanas 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Se recolectó líquido cervicovaginal para la detección de anticuerpos con Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL). , EE. UU.) en las semanas 4, 8, 16, 18, 20, 22 y 24. Las muestras cervicovaginales para la detección de carga de clamidia se recolectaron con hisopos flatlock regulares (Mast Diagnostic - ref.: 552C/ 10). Tras el contacto con la mucosa vagino-cervical, la torunda se colocó en un vial que contenía medio UTM-RT (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) y se mantuvo en hielo.

Infección de provocación vaginal con 5*107 IFU de C. trachomatis SvD

Los animales fueron sedados con clorhidrato de ketamina (10 mg/kg IM), colocados en decúbito ventral con las caderas elevadas y se aplicó traumáticamente 1 ml del inóculo directamente a la mucosa vaginal en la transición vagino-cervical utilizando una jeringa de 1 ml. Se administró una dosis de 5 x 107 IFU a cada animal. Se permitió que el animal permaneciera en decúbito ventral con las caderas elevadas durante un corto tiempo después de la inoculación.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

CTH522anticuerpos específicosen suero y muestras de hisopos se detectaron con un ELISA indirecto. Se recubrieron placas Maxisorp® (NUNC A/S, Roskilde, Dinamarca) con CTH522 (0,5 µg/ml) durante la noche a 4 grados. Los isotipos IgG e IgA se detectaron con anticuerpos conjugados con HRP específicos contra IgG de primate no humano (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, EE. UU., 1:75.{{10) }}) e IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, EE. UU., 1:50.000). Las reacciones se visualizaron con sustrato TMB PLUS (KemEnTec, Taastrup, Dinamarca) y se detuvieron con ácido sulfúrico 0,5 M. Las placas se leyeron en un lector ELISA a 450 nm con corrección a 650 nm. Se usó un control positivo (suero de un estudio anterior) como estándar interno para corregir la variación de una placa a otra. Se corrieron dos pocillos sin sustrato como control negativo en cada placa. Los títulos de anticuerpos se calcularon como el recíproco de la dilución más alta con un valor de densidad óptica (OD) superior al valor de corte. El corte se determinó a partir de la media de la muestra del día 0 más 2*DE.

Matriz y análisis de péptidos

La matriz de péptidos CTH522 se diseñó con triplicados de péptidos de 15 mer inmovilizados superpuestos por 14 aminoácidos que se imprimieron en portaobjetos de vidrio funcionalizados y se incubaron con muestras de suero por JPT Peptide Technologies, Berlín. Brevemente, la matriz se incubó con muestras de suero recolectadas en la semana 24 y los complejos peptídicos de IgG se visualizaron utilizando IgG anti-mono de cabra biotinilada y estreptavidina Alexa Fluor® 647. Los portaobjetos se escanearon con un escáner de alta resolución a 635 nm y los datos se informaron como unidades de fluorescencia arbitrarias. Se determinó la media de los valores por triplicado, si el coeficiente de variación era mayor que 0.5, solo se usaban los 2 valores más cercanos. El 10 por ciento de la señal de máxima intensidad (65.535) se utilizó como punto de corte para unrespuesta positiva, y a las señales medias por debajo de este umbral se les asignó un valor correspondiente a la mitad del valor del umbral (3277).

Ensayo de neutralización in vitro

El ensayo de neutralización in vitro se realizó para probar la capacidad de los anticuerpos séricos inducidos por la vacuna para neutralizar la infección por Chlamydia de las células HaK in vitro. El ensayo siguió principalmente el protocolo descrito previamente (44). En primer lugar, se incubaron muestras de suero de animales individuales a 56 grados durante 30 minutos para inactivar el complemento. La reserva de clamidia (SvD, SvE y SvF) se mezcló y se incubó con diluciones en serie de suero inactivado de cada uno de los animales vacunados durante 30 minutos y luego se inoculó en una monocapa de células HaK en 96-placas de fondo plano en duplicados Después de 30 horas de incubación, las células y las inclusiones se fijaron y visualizaron con suero policlonal de conejo anti-Ct043 y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (Alexa Flour 488, cabra-anti-conejo IgG, A11008, Life Technologies) en la dilución 1:500 . El recuento de inclusiones se realizó manualmente en 20 campos de visión con un aumento de 40x (microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX71). La neutralización se calculó como el porcentaje de reducción en el número medio de IFU en comparación con un conjunto de sueros de animales del grupo de control (sin tratamiento previo).

Tinción de citoquinas de PBMC intracelulares y citometría de compañeros

Las PBMC se aislaron y ({{0}} x 106) se resuspendieron en 150 µl de medio completo que contenía 0,2 µg de cada anticuerpo coestimulador CD28 y CD49b. La estimulación se realizó en 96 pocillos/placas usando 2 µM de cada conjunto de péptidos o SEB (como control positivo) o medio solo (como control negativo). Se añadió Brefeldina A a cada pocillo a una concentración final de 10 µg/ml y la placa se incubó a 37 grados C, 5 por ciento de CO2 durante la noche. A continuación, las células se lavaron, se tiñeron con un tinte de viabilidad (violeta, tinte reactivo fluorescente, Invitrogen), se fijaron y se permeabilizaron con el reactivo BD Cytofifix/Cytoperm. A continuación, las muestras de células permeabilizadas se almacenaron a -80 grados antes del procedimiento de tinción. La tinción de anticuerpos se realizó en un solo paso después de la permeabilización. todo lo usadoanticuerposse enumeran en la Tabla 1. Después de 30 minutos de incubación en hielo en la oscuridad, las células se lavaron en tampón BD Perm/Wash. Las células se contaron con un LSR II (BD) inmediatamente después del procedimiento de tinción y se usó el software FlowJo para el análisis de datos.

TABLA 1 Anticuerpos utilizados para la tinción de marcadores de células inmunitarias y citocinas intracelulares

Detección de ADN de clamidias vaginales mediante PCR cualitativa

El ensayo Abbott RealTime CT/NG (ABBOTT, Rungis, Francia) es un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) in vitro para la detección directa y cualitativa del ADN plasmídico de los genomas CT (C. trachomatis) y NG (N. gonorrhoeae). . El ácido nucleico se extrajo de muestras UTM (medios de transporte universales) en M2000SP y la amplificación se realizó en M2000SP, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como umbral de ciclo (Ct).

análisis estadístico

Todas las estadísticas se realizaron con el software GraphPad Prism (versión 8.1.2). Los datos que no se distribuyeron normalmente se analizaron con pruebas no paramétricas; Prueba de Kruskal-Wallis y pruebas de comparación múltiple de Dunn para determinar la importancia de la diferencia entre grupos. Las curvas que muestran el porcentaje de animales PCR negativos se compararon con una prueba estadística de rango logarítmico (Mantel-Cox). Las comparaciones se consideraron estadísticamente significativas si el valor de P era < 0.05 (P < 0.05). Los niveles adicionales de significancia se indican con asteriscos *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/Material Suplementario. Las consultas adicionales pueden dirigirse al autor de correspondencia.

Declaración de Ética

El estudio con animales fue revisado y aprobado por el "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) bajo la declaración número A14-026. El estudio fue autorizado por el "Ministerio de Investigación, Innovación y Educación" con número de registro APAFIS#720-201505281237660.

Contribuciones de autor

Experimentos concebidos y diseñados: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Experimentos realizados: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Vacunas producidas y construcciones de antígenos: IR, PM, AO. Analizó los datos: JD, EL, FF, IR, HJ. Redactaron y editaron el artículo: JD, EL, FF. Cada uno de los coautores enumerados hizo contribuciones sustanciales al trabajo a través del diseño y la concepción, y/o adquisición, análisis e interpretación de los datos. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión enviada.

Expresiones de gratitud

Agradecemos a la Fondation Dormeur, Vaduz por la donación a la Unidad de Transmisión y Evolución Viral de instrumentos de laboratorio relevantes para este proyecto.

Conflicto de intereses FF, IR, PA y AWO son coinventores de una solicitud de patente sobre vacunas contra la clamidia [WO2014146663A1]. Todos los derechos han sido asignados a Statens Serum Institut, un instituto gubernamental danés sin fines de lucro. Los restantes autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Nota del editor Todas las afirmaciones expresadas en este artículo pertenecen únicamente a los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda hacer su fabricante, no está garantizada ni respaldada por el editor.

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