Imágenes multicolores de proteínas fijadoras de calcio en cálculos renales humanos para dilucidar los efectos de las proteínas en el crecimiento de cristales
Mar 21, 2022
RiñónLa enfermedad de los cálculos es un trastorno común que afecta al 1,7-14,8 por ciento de la población al menos una vez en la vida1,2. En hasta el 50 por ciento de los casos, esta enfermedad recurre dentro de los 5 años del primer episodio. A pesar de la importancia de este problema de salud, la terapia preventiva para la formación de cálculos no está disponible. Entender la patogenia deriñónla formación de cálculos es esencial para reducir la aparición y recurrencia deriñónenfermedad de las piedras 3. Aproximadamente el 80 por ciento deriñónlos cálculos son de oxalato de calcio (CaOx)4,5. Los cálculos de CaOx consistían en ~90 por ciento de fase mineral, es decir, CaOx, que se clasifica además en oxalato de calcio monohidratado [Ca(C2O4)·H2O](COM) y oxalato de calcio dihidratado [Ca(C2O4)·2H2O](COD), y una fracción relativamente pequeña de materia orgánica, que ha sido considerada Departamento de Nefro‑Urología, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Universidad de la Ciudad de Nagoya, 1‑Kawasumi, Mizuho‑cho, Mizuho‑Ku, Nagoya 467‑8601, Japón . 2Instituto de Estudios Avanzados de Co-Creación, Universidad de Osaka, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japón. 3Escuela de Graduados de Ingeniería, Universidad de Osaka, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japón. 4Escuela de Graduados en Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad de la Prefectura de Kioto, 1‑5, Hangi‑cho, Shimogamo, Sakyo‑ku, Kioto, Kioto 606‑8522, Japón. 5Departamento de Ciencias de la Tierra, Universidad de Tohoku, 6‑3 Aza‑Aoba, Aramaki, Aoba‑ku, Sendai 980‑8578, Japón. 6Museo Nacional de Naturaleza y Ciencia, 4‑1‑1 Amakubo, Tsukuba 305‑0005, Japón. 7Instituto de Investigación Médica y de Salud, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industriales Avanzadas (AIST), 2217‑14, Hayashi‑cho, Takamatsu, Kagawa 761‑0395, Japón. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3‑1‑11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577‑0849, Japón. 9Instituto de Ingeniería Láser, Universidad de Osaka, 2‑6, Yamadaoka, Ciudad de Suita, Osaka 565‑0871, Japón. *Correo electrónico: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp
Palabras clave:riñón; cálculos renales; enfermedad del riñon; renal; fisiología renal
LA CITANCHE MEJORARÁ LA INSUFICIENCIA RENAL/RENAL
como matriz proteica6. La patogenia deriñónLa formación de cálculos incluye procesos de varios pasos que implican interacciones complejas entre los componentes minerales y la matriz proteica7,8. Se han identificado más de 100 especies de proteínas enriñónpiedras9–11. Entre ellas, se sabe que varias proteínas, en particular las proteínas de unión al calcio, desempeñan funciones esenciales en los procesos de formación de cálculos de CaOx12–16. Los efectos específicos de estas proteínas se han investigado intensamente en muchos pasos de la formación de cálculos, incluida la nucleación de cristales, el crecimiento de cristales, la agregación de cristales y la adhesión de cristales, con numerosos estudios de cristalización in vitro17–19. Los estudios in vitro son útiles para evaluar los efectos de proteínas específicas en los pasos específicos de la formación de cálculos. Sin embargo, en los entornos reales de formación de cálculos, la cantidad de proteínas funciona simultáneamente y la composición de la orina en las concentraciones de proteínas, iones de calcio y oxalato fluctúa. Esta preocupación nos motivó a investigar humanos realesriñónPiedras para encontrar los efectos reales de las proteínas en el crecimiento de cristales. En la mayoría de los estudios previos, la identificación de las proteínas enriñónpiedras se ha realizado con espectroscopia de masas después de trituración y extracción9-11. Por lo tanto, se pierde información sobre la distribución espacial de las proteínas en el cálculo. En investigaciones muy limitadas, la identificación de proteínas enriñóncálculos se ha realizado con cortes en rodajas de cálculos renales en los que los cristales de CaOx se eliminan completamente por descalcificación20,21. Este enfoque es útil para encontrar la distribución de una proteína enriñóncálculos que potencialmente ayuda a comprender los efectos específicos de proteínas en la formación de cálculos. Sin embargo, una gran cantidad de información sobre la formación de piedra, registrada enriñóncristales de piedra, se pierde en este método. La importancia de la información mineral de los cálculos renales que se puede adquirir mediante la identificación de las fases cristalinas y las clasificaciones de la textura del cristal realizadas utilizando secciones de corte y secciones delgadas pulidas deriñónpiedras con microscopía óptica ha sido demostrado por más de 70 años de estudios previos22,23.
La ausencia del análisis para evaluar las distribuciones de proteínas con cristales prístinos de CaOx enriñónpiedras ha sido un obstáculo considerable para la comprensión de la formación de piedra. La evaluación coordinada de las distribuciones de proteínas y las fases/morfologías de los cristales puede proporcionar información importante sobre la historia de la formación de cálculos. La tinción de inmunofluorescencia múltiple (tinción multi-IF) se ha utilizado para mostrar las distribuciones de dos o más proteínas en muchos tipos de tejidos blandos de muestras biológicas24. La aplicación de la técnica a los tejidos óseos, que están compuestos por cristales porosos de fosfato de calcio, también proporcionó importantes conocimientos sobre la regulación dinámica de la homeostasis mineral ósea25. Sin embargo, esto no se ha utilizado para investigarriñónpiedras compuestas de cristales densos y duros, aunque la tinción de inmunofluorescencia única se ha utilizado para mostrar la distribución de una proteína específica en descalcificaciónriñónpiedras que no retienen información mineral20,21. Este estudio investigó las condiciones que permiten la tinción multi-IF deriñónmuestras de piedra para conservar la información mineral original. Investigamos la distribución de tres proteínas diferentes, osteopontina (OPN),renalfragmento de protrombina 1 (RPTF-1), y calgranulina A (Cal-A), en secciones delgadas de cálculos de CaOx. Estas proteínas son comunes en la mayoría de los cálculos de CaOx y se conocen como proteínas de unión al calcio que pueden afectar la formación de cálculos de CaOx26–28. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio en el que se co-visualizan múltiples proteínas de la matriz en unriñónpiedra. Además, interpretamos los diferentes efectos in vivo de cada proteína en el crecimiento de cristales de CaOx en función de sus distribuciones, propiedades fisicoquímicas y los complejos cambios del entorno físico de cada proteína durante la formación de cálculos de CaOx.
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Resultados
Basado en la observación microscópica junto con el análisis FT-IR, los dominios de lariñónLas muestras de piedra se clasificaron en tres tipos de texturas que son consistentes con lo informado por Schubert y Brien23: textura irregular compuesta de cristales euhedral COD (Tipo 1, denominado agregado euhedral COD; Fig. 1c), textura de mosaico compuesta de cristales COM orientados irregularmente cristales (Tipo 2, denominado mosaico COM; Fig. 1f), y cristales COM laminados concéntricamente (Tipo 3, denominado COM concéntrico; Fig. 1i). La mayoría de las muestras de piedra de CaOx observadas consistían en estas tres texturas (Tabla 1). El protocolo de tinción Multi-IF utilizado para muestras biológicas se aplicó al análisis de secciones delgadas deriñónmuestras de piedra preparadas por un método geológico típico. Para la aplicación, se ajustó la condición de grabado de la sección delgada antes de la tinción y se encontró que la visualización solo fue exitosa cuando la sección delgada pulida se grabó ligeramente (con una solución de citrato de pH 6.0 durante 1 min. ) antes del típico proceso de tinción. La tinción multi-IF permitió la co-visualización de tres proteínas en diferentes colores (OPN: verde, RPTF-1: azul y Cal-A: rojo) en las tres texturas de piedra diferentes.
Encontramos que cada proteína mostró un patrón de distribución característico dependiendo de su ubicación en COM y COD. Los agregados euédricos de DQO se encontraron en 7 muestras de 15 muestras (Tabla 1). Los agregados euédricos de DQO estaban presentes predominantemente en la periferia de CaOxriñónpiedras (Fig. 1a-c). Se sabe que estos cristales de DQO tienen forma de bipirámide tetragonal compuesta por {101} caras29. Muchas de las bipirámides COD también tienen una cara {110} en la punta de ambas pirámides (Fig. 2b y Fig. S1 complementaria). En la Fig. 2a se muestra una imagen de tinción multi-IF de los cristales de COD, y OPN se presenta periódicamente en la cara {110} de COD, como se muestra mediante flechas blancas en la Fig. 2c. Esta cara es la misma cara de la punta de la bipirámide que no aparece en el típico crecimiento de cristales in vitro de DQO29. RPTF-1 apareció como capas paralelas a lo largo de la cara {101}, con intervalos de escala de µm, como se muestra con la flecha amarilla en la Fig. 2d. Esta cara de cristal es característica del crecimiento típico de DQO29. Cal-A estaba presente fuera de los cristales de DQO, sin mostrar adsorción preferencial en caras específicas (Fig. 2e). Se observaron los mismos patrones de distribución en otras muestras de piedra (Figura complementaria S2). La textura mosaico COM es la textura más frecuente en las piedras de CaOx (Fig. 1d-f). Esta textura se observó en 12 muestras de 15 (Tabla 1). La tinción Multi-IF del mosaico COM se muestra en la Fig. 3a, b. OPN y RPTF-1 estaban presentes en todos los cristales COM (Fig. 3c, d). Por el contrario, Cal-A estuvo presente exclusivamente a lo largo de los límites de los granos (es decir, en las superficies de los granos COM) (Fig. 3e). Analizamos además un perfil de intensidad de línea de las proteínas, como se muestra en la Fig. 3a, para evaluar cada patrón de distribución de proteínas en detalle (línea amarilla en la Fig. 4a). OPN y RPTF-1 mostraron intensidades más altas en el área del cristal, mientras que Cal-A mostró una intensidad más baja en el área del cristal.
área de cristal (Fig. 4b). La alta intensidad de Cal-A se observó exclusivamente a lo largo de los límites de los cristales. Estas distribuciones de proteínas se observaron en muchas muestras, aunque los tamaños y formas de los granos COM diferían (Fig. S3 complementaria). El COM concéntrico también es una textura típica en las piedras de CaOx (Fig. 1g-i). Encontramos esta textura en 10 muestras de 15 (Tabla 1). OPN, RPTF-1 y Cal-A se distribuyeron en capas concéntricas (Fig. 5a). OPN y RPTF-1 estaban presentes como capas constantes y regulares a lo largo de los cristales COM, formando un intervalo de escala de µm (Fig. 5b, c). En contraste, la distribución Cal-A estaba compuesta por capas irregulares y de intervalos relativamente amplios ubicadas en la superficie exterior de la piedra (Fig. 5d). La observación SEM mostró una capa de brecha cerca de cada capa Cal-A (Fig. 6a, b). Ambas superficies que creaban el espacio de la brecha estaban ocupadas con pequeños depósitos que eran claramente distintos de los principales cristales COM que componen el COM concéntrico (Fig. 6c, d). Los perfiles de intensidad de línea de estas proteínas en el COM concéntrico mostraron picos en cada perfil de proteína (Fig. 4c, d). Los perfiles de OPN y RPTF-1 fueron similares (es decir, 5,58±2,70 µm/capa de OPN y 5,99±2,56 µm/capa de RPTF-1) (Tabla complementaria S1). Sin embargo, las capas de Cal-A tenían intervalos distintivamente grandes (es decir, 23,17±18,57 µm/capa) que OPN y RPTF-1. Se observaron patrones e intervalos de distribución similares en la mayoría de las otras 9 muestras, aunque la capa Cal-A no se observó en algunas muestras (Figura complementaria S4 y Tabla S1).
En este estudio, las proporciones de las tres texturas en los cálculos de CaOx y las distribuciones de las tres proteínas en las tres texturas no tenían una relación clara con la edad y el sexo del formador de cálculos, aunque la cantidad de cálculos investigados no fue suficiente para el análisis de correlación. . Se sabe que OPN, RPTF-1 y Cal-A están presentes en los cálculos de CaOx según la detección de los extractos de polvos de cálculo con electrólisis9–11. Las distribuciones a microescala de OPN en cálculos de CaOx descalcificados con técnica inmunocitoquímica mostraron distribuciones de OPN en las laminillas concéntricas de los cálculos de CaOx21,30. El presente método visualizó vívidamente las ubicaciones de tres proteínas diferentes en "capas orgánicas" previamente consideradas (Fig. 7a, b). El patrón de distribución de OPN que mostramos en el presente estudio en el COM concéntrico es consistente con las observaciones anteriores. Además, encontramos que el patrón de distribución de RPTF-1 en el COM concéntrico es casi el mismo que el de OPN, mientras que la distribución de RPTF-1 en los cristales de COD es diferente a la de OPN. Por el contrario, el patrón de distribución de Cal-A es completamente diferente al de las otras dos proteínas. Estas diferentes distribuciones a microescala de OPN, RPTF-1 y Cal-A registran la historia de la formación de cálculos de CaOx.
Discusión
El principal factor de control de la incorporación de proteínas en los cristales.Tanto OPN como RPTF{{0}} estaban presentes en cristales de COD euédricos, granos de COM de mosaico y COM concéntricos (Figs. 2a, 3a y 5a). Este hallazgo confirma que estas proteínas se incorporan tanto en cristales de COD como de COM. Cal-A estaba presente en el exterior de los cristales de DQO euédricos y alrededor de los granos de COM en mosaico (Figs. 2e y 3e). En el caso de COM concéntrico, un espacio de separación que normalmente se encuentra alrededor de las capas de Cal-A sugiere que las capas de Cal-A no están incluidas en los cristales sino distribuidas en la superficie de los cristales (Figs. 5d y 6a-d). Estas distribuciones indican que OPN y RPTF-1 tienden a incorporarse a los cristales de CaOx, mientras que Cal-A apenas se incorpora. La adsorción de proteínas y la incorporación en los cristales de CaOx están teóricamente influenciadas por la fuerza de unión de sus cadenas laterales de aminoácidos y otras propiedades específicas de las proteínas respectivas, como la carga electrostática negativa31,32. La carga neta indica que OPN y RPTF-1 tienen una carga más negativa que Cal-A, con puntos isoeléctricos de OPN, RPTF-1 y Cal-A de 3,5, 2,5–3.{{28} } y 6,5–7,0, respectivamente33–35. Se sabe que Te OPN, RPTF-1 y Cal-A tienen dominios de unión al calcio36–38. Estos dominios también pueden funcionar como sitios de unión locales a las superficies de cristal en crecimiento. Los dominios de unión a calcio de OPN, RPTF-1 y Cal-A pueden unir 10, 7 y 2 iones de calcio, respectivamente36–38. Por lo tanto, las afinidades locales y de volumen de estas proteínas con el Ca cargado positivamente en la superficie de CaOx causan la diferente eficiencia de incorporación de estas proteínas en CaOx. . Las compatibilidades tridimensionales entre las proteínas y las superficies cristalinas en crecimiento determinarían
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el grado de incorporación de la proteína en la superficie del cristal. Las proteínas con una fuerte capacidad de unión a los sitios y pasos de torcedura en crecimiento tienden a incorporarse al cristal en crecimiento de manera más eficiente41–43. Las distribuciones informadas actualmente y las afinidades de calcio de las tres proteínas sugieren que la fuerte afinidad de OPN y RPTF-1 facilita la unión e incorporación en cristales de COD y COM. Por el contrario, Cal-A, que tiene una afinidad menor, solo se adhiere a la superficie del cristal pero no se incorpora al cristal. Un estudio anterior que mostró tasas más altas de incorporación de péptidos en COM por parte de más péptidos fosforilados respalda esta explicación43. Estas discusiones nos permitirían predecir las distribuciones de muchas otras proteínas en función de sus propiedades de unión al calcio.
Absorción selectiva in vivo y efectos inhibitorios de OPN y RPTF‑1 sobre el crecimiento de cristales de CaOx.Se ha considerado que los cristales euédricos de DQO que están presentes predominantemente en la periferia de la piedra CaOx crecen con una textura laminada característica en la que la llamada "capa de materia orgánica" y la "capa mineral" se alternan entre sí durante el crecimiento del cristal44,45. Aunque las razones exactas que subyacen al cambio de capa siguen sin estar claras, las posibles explicaciones incluyen los cambios ambientales en el huésped humano,riñónfisiología y cambios bioquímicos en la orina, y mecanismos de retroalimentación cinética que forman estructuras de zonificación oscilatorias que se encuentran en los minerales8. Los resultados actuales muestran que OPN y RPTF-1 construyen una textura laminada correspondiente a {110} y {101} de las caras COD como proteínas intracristalinas, respectivamente, mientras que Cal-A no está incluida en la textura laminada (Fig. 2c -mi). Esta evidencia in vivo de adsorción/incorporación selectiva de proteínas en la superficie sobre/enriñóncristales de piedra indica que las distribuciones de proteínas no son idénticas a la "capa de materia orgánica" tradicional observada por microscopía óptica (Fig. 7a). La evidencia in vitro sobre la adsorción selectiva de OPN en cristal COD fue reportada por Chien et al. (2009 y 2018)46,47. Según estos informes, OPN se une a la cara cristalográfica típica {110} de COD y se incorpora a la fase mineral, lo que es consistente con nuestros resultados (Fig. 7b). La adsorción/incorporación selectiva a la superficie probablemente ha sido el resultado de la capacidad de unión de calcio de cada proteína y/o diferentes compatibilidades moleculares entre los grupos funcionales en las moléculas de proteína y la disposición de los iones de la red en cada superficie cristalina.
Según se informa, la mayoría de las proteínas inhiben el crecimiento de cristales de CaOx durante la formación de cálculos48,49. La inhibición del crecimiento de cristales por parte de los péptidos se considera a través de la fijación escalonada y/o el bloqueo de torceduras41–43. En estudios in vitro anteriores, se sabe que OPN y RPTF-1 son inhibidores del crecimiento de cristales de CaOx48,49. Sin embargo, el grado de inhibición enriñónla formación de cálculos sigue sin estar clara.
La presente observación muestra que la mayoría de los cristales de DQO de cálculos renales tienen un hábito cristalino típico con caras {101} (Fig. 2b). Las superficies de cristal que tienen tasas de crecimiento relativamente lentas generalmente están bien desarrolladas40. Esta financiación indica que la tasa de crecimiento de {101} caras de COD es lenta en comparación con otras superficies (por ejemplo, {110}). La adsorción preferencial de RPTF-1 que potencialmente desaceleró el crecimiento de cristales al incorporarse en COD se encontró como una estructura laminada junto con las caras {101} (Fig. 2d). Por otro lado, encontramos caras {110} como estructuras laminadas OPN dentro del cristal COD (Fig. 2c). Las caras {110} que aparecieron como estructura laminada de OPN están más desarrolladas que las caras {110} de los cristales de COD sin OPN obtenidos en el estudio in vitro46. La cara {110} de la DQO con adsorción preferencial de OPN no es la cara cristalina que aparece en la DQO del hábito cristalino típico47. Por lo tanto, la absorción de OPN en {110} desaceleraría extremadamente la tasa de crecimiento superficial relativa, y la desaceleración fue lo suficientemente lenta como para que aparezcan las caras {110}. La aparición de las caras {110}, en otras palabras, cambia el hábito cristalino general en muchas muestras de cálculos renales. Los cristales de COM aparecen como una textura de mosaico o una textura concéntrica (Figs. 3a y 5a). Tanto OPN como RPTF-1 están homogéneamente presentes en los granos COM en la textura del mosaico (Fig. 3c,d). Por lo tanto, los efectos de estas proteínas sobre la tasa de crecimiento de este tipo de COM no están claros. En COM concéntrico, los cristales en forma de listón se alinearon radialmente desde el centro hacia el exterior50. Las caras cristalinas de los cristales en forma de listones no son claras, pero la superficie exterior del COM esférico que se expone a la orina debería tener las mismas caras cristalográficas. Los presentes resultados muestran claramente que OPN y RPTF-1 tienen perfiles de línea de distribución similares en los que se distribuyen periódicamente en el COM concéntrico como capas de intervalo de escala de aproximadamente 4 a 6 µm (Figs. 4c, d, 5b, c y Tabla complementaria S1). Esto indica que OPN y RPTF-1 tienen una diferencia insignificante en la adsorción e incorporación en las caras cristalinas específicas de COM expuestas a la orina. Trabajos in vitro anteriores mostraron que OPN tiene efectos inhibitorios sobre el crecimiento de COM de {100}, {121} y {010} caras 51. Cuando se considera este efecto inhibitorio, el presente resultado indica que el crecimiento de COM concéntrico fue inhibido por OPN y posiblemente por RPTF-1 ya que RPTF-1 tiene una capacidad de unión de calcio similar y, por lo tanto, tiene una eficiencia de incorporación similar a COM.
Figura 7. Esquemas de la distribución de proteínas en tres texturas principales en CaOx. (a) La distribución de la matriz proteica se considera en estudios previos (color blanco: fase mineral color negro: materia orgánica). (b) Distribución específica de proteínas encontrada en el presente estudio (verde: osteopontina (OPN), azul: fragmento de protrombina renal 1 (RPTF-1) y rojo: calgranulina A (Cal-A). DQO idiomórfico tipo 1, Tipo 2 mosaico COM y Type3 laminado concéntricamente COM.
Efectos inhibitorios in vivo de Cal‑A sobre el crecimiento de cristales de CaOx.La adsorción de Cal-A en caras de cristal específicas de cristales COM y COD no se observó en el presente resultado (Figs. 2a y 3a). Cal-A tiene una capacidad de unión de calcio más baja que OPN y RPTF-1 y estaba presente en el exterior de los cristales de DQO euédricos y alrededor de los granos de COM de mosaico sin estructura laminada (Figs. 2a,e y 3a,e). Sin embargo, también se sabe que Cal-A inhibe el crecimiento de cristales de CaOx en estudios in vitro28. Por lo tanto, Cal-A podría haber funcionado como una molécula de surfactante que afecta la morfología y la tasa de crecimiento del cristal sin incorporarse al cristal39,40,52. Bajo condiciones regulares de orina (es decir, sin una alta concentración irregular de Cal-A), Cal-A puede tener un efecto inhibidor más bajo que OPN y RPTF-1 en el crecimiento de cristales de COM y COD desde OPN y RPTF{{17} } inhibir el desarrollo de escalones en las caras de los cristales mediante fijación y/o bloqueo por incorporación en los cristales. Por lo tanto, la capacidad de unión de calcio de las proteínas en los cálculos renales ayudaría a evaluar el alcance de sus efectos inhibidores sobre el crecimiento de CaOx. En COM concéntrico, Cal-A mostró capas no periódicas que tenían distancias de 20 a 50 µm (Figs. 4c, d , 5d y Tabla Suplementaria S1). Se ha identificado Cal-A en orina de formadores de cálculos28. Por lo tanto, las fluctuaciones en su concentración en la orina deberían ocurrir naturalmente. Sin embargo, debido a su menor afinidad por los iones de calcio, es posible que no se registren pequeñas fluctuaciones en la concentración de Cal-A en la textura COM. Cal-A se excreta en la orina de forma no periódica como proteínas antiinflamatorias en respuesta a la inflamación53,54. Por lo tanto, las capas no periódicas de Cal-A pueden registrar altas concentraciones ocasionales de Cal-A en la orina debido a cambios ambientales irregulares, como infecciones, lesiones y hemorragias. Su efecto inhibitorio sobre el crecimiento de COM dependería en gran medida de su concentración alrededor de los cristales en crecimiento, ya que varios péptidos tienen tal dependencia del crecimiento de cristales de calcita42. Cal-A puede desacelerar débilmente el crecimiento de COM al ocupar parcialmente la superficie de crecimiento cuando su concentración alrededor del cristal es baja porque la proteína no es propensa a incorporarse en CaOx. En COM concéntrico, las capas de brecha rodeadas por pequeños depósitos encontrados por observación SEM presentan lugares casi idénticos a las capas Cal-A encontradas por imágenes multi-IF (Fig. 6a-d). Por lo tanto, cuando la capa de Cal-A se espesa debido a su alta concentración irregular debido a algunos cambios biológicos, Cal-A puede funcionar como un potente inhibidor del crecimiento de CaOx al ocupar ampliamente la superficie de crecimiento. La inflamación, que es un desencadenante de la secreción de Cal-A, también puede afectar un paso diferente de la formación de cálculos porque en experimentos que utilizan un ratón modelo de cálculos renales16.
La posible aplicación de imágenes multi-IF a la formación general de cálculos renales.El presente trabajo amplió la aplicación de imágenes multi-IF de proteínas a muestras biominerales más duras, es decir, cálculos renales. La nucleación de cristales, el crecimiento de cristales, la agregación de cristales y la adhesión de cristales se han considerado pasos importantes en la formación de cálculos renales. OPN, RPTF-1 y Cal-A se informan como inhibidores de la nucleación, el crecimiento y la agregación de CaOx en estudios in vitro48,49. La presente aplicación ampliada de imágenes multi-IF proporciona evidencia in vivo del efecto inhibidor del crecimiento de CaOx por proteínas que estaban implícitas en los estudios in vitro anteriores. Se han realizado investigaciones sobre los efectos de las proteínas en cada paso mediante estudios in vivo en ratones, así como numerosos estudios in vitro14,15,26. Por ejemplo, una función renoprotectora crítica de OPN como inhibidor de la formación de cristales e inhibidor de la adhesión de cristales se ha informado en base a experimentos in vivo en ratones26 mientras que la promoción de la adhesión de cristales a las células epiteliales tubulares por OPN y la mejora de los cálculos de CaOx la formación se ha informado sobre la base de experimentos in vivo más recientes utilizando ratones knockout para OPN14,15. Una morfología de cristal completamente diferente que se encuentra en los cálculos renales de un ratón knockout para OPN también respalda los efectos de OPN en múltiples pasos de formación de cálculos renales. El presente método de visualización sería útil para evaluar los efectos de las proteínas en estos estudios in vitro en ratones e incluso sería útil para evaluar diferentes etapas de la formación de cálculos renales humanos. Este novedoso análisis nos permitiría interpretar los efectos in vivo de diferentes proteínas sobre la formación de cálculos de CaOx que pueden abrir una vía para el examen patológico y la medicina personalizada para el manejo de la enfermedad de cálculos renales humanos.
Métodos
Declaración de Ética. El proyecto de investigación presentado en este artículo fue aprobado por la junta de revisión institucional de la facultad de medicina de la universidad de la ciudad de Nagoya. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos de acuerdo con los procedimientos aprobados por la junta del comité de ética.
Recolección de piedra y preparación de secciones de piedra. Se recolectaron cálculos renales de pacientes y se analizaron en la universidad de la ciudad de Nagoya en Japón. Se seleccionaron quince muestras de cálculos renales de CaOx de nuestras miles de colecciones de cálculos renales humanos en función de la información de la espectroscopia infrarroja (IR) a granel y se prepararon secciones delgadas. La composición mineralógica a granel de la piedra se estimó con el análisis IR. A esta investigación de cálculos renales se le aplicó una metodología de corte fino petrológico, originalmente diseñada para investigaciones geológicas55. Las muestras de cálculos renales se incrustaron completamente en resina epoxi y se cortaron. La sección transversal fue rectificada con abrasivos (SiC y Al2O3), y luego la cara pulida fue adherida a un portaobjetos de vidrio utilizando resina epoxi. Se realizó un segundo corte para hacer una muestra de 1- mm de espesor paralela al portaobjetos de vidrio. Luego, la muestra se pulió hasta un espesor de 20 a 30 µm y se terminó con el pulido con lechada de diamante.
Microscopía polarizada y espectrofotometría infrarroja por transformada de Fourier.Las características ópticas de cada cristal que compone los cálculos renales se observaron mediante microscopía polarizada con las secciones de fragmentos de cálculos de 20–30 µm de espesor. El índice de superficie de cada plano de COD se determinó comparando la observación con la forma típica de cristal de COD calculada por VESTA56. Según las características ópticas, los cristales se clasificaron y luego se analizaron con un espectrofotómetro infrarrojo de transformada de Fourier (FT/IR6100, JASCO). El rango de número de onda de medición fue de 7800 a 350 cm-1. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente. El tamaño del punto de medición se fijó en 20 × 20 µm2. Las fases cristalinas se identificaron en base al espectro IR obtenido con la base de datos RRUFF.
Tinción inmunofluorescente multicolor de la matriz proteica.Las secciones de cálculos utilizadas para el análisis de fases minerales también se utilizaron para el análisis de distribuciones de proteínas con tinción Multi-IF. Las secciones delgadas se trataron con una solución de citrato (pH 6.0) durante 1 min para un grabado mínimo. La sección se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se bloqueó durante 60 min en albúmina de suero bovino al 1 por ciento en solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST). Después del bloqueo, la sección se incubó con anticuerpos primarios durante la noche a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-calgranulina A monoclonal de ratón (dilución 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), anti-osteopontina policlonal de conejo (dilución 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ), y Fragmento 1 de protrombina antihumana monoclonal de oveja (dilución 1:500, Cedarlane Ontario, Canadá, CL20111AP). Luego, la sección se lavó 3 veces con PBS durante 10 min antes de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia durante 1 h, protegidos de la luz. Los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia utilizados fueron anti-IgG de conejo (H más L) de adsorción cruzada conjugada con Alexa Fluor 488, anti-IgG de ratón (H más L) de adsorción cruzada conjugada con Alexa Fluor 546 y anti-Oveja IgG (H más L) Adsorbido en cruz conjugado con Alexa Fluor 647. Después de un lavado extensivo 3 veces con PBS durante 10 min, se detectó la fluorescencia utilizando una microscopía de autofluorescencia confocal (Nikon A1R). Las longitudes de onda de excitación y emisión recopiladas incluyeron excitación de 487 nm (emisión recopilada entre 500 y 550 nm), excitación de 561 nm (emisión recopilada entre 570 y 620 nm) y 639 nm (emisión recopilada entre 663 y 738 nm) para OPN, RPTF{{ 46}} y Cal-A, respectivamente. Se observó autofluorescencia (AF) en una parte de las muestras, pero la intensidad de la señal fue mucho más baja que las señales de proteínas discutidas en este estudio. También se evaluó la unión de anticuerpos que no son específicos de las proteínas diana. Se confirmó la ausencia de señales de IF del anticuerpo no específico. Se realizaron pruebas de control negativo para evaluar la ausencia de señales falsas positivas (Figura complementaria S5). Para la tinción de anticuerpos, se usaron controles de isotipo para detectar cualquier unión no específica. Específicamente, los anticuerpos primarios utilizados para los controles fueron control de isotipo mAb IgG XP de conejo (DA1E) (dilución 1:100 de señalización celular), control de isotipo mAb IgG1 de ratón (G3A1) (dilución 1:100 de señalización celular) e isotipo de mAb IgG de oveja (dilución 1:100). :100 dilución Novus) utilizando los mismos anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que antes. Los perfiles de línea se construyeron con ImageJ, mostrando el punto de contraste más alto y más bajo como 100 por ciento y 0 por ciento, respectivamente, para cada proteína.