Complejos de mucílago de proteína de leche nano: caracterización y efecto anticancerígeno Parte 1

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Resumen: LosanticancerígenoLa actividad de los compuestos naturales ha atraído recientemente la investigación multidisciplinar. En este estudio, se investigó la complejación de proteínas de la leche (MP) con mucílago de cáscara de Isabgol (IHM) y mucílago de Ziziphus Spina Christi (NabM). En este contexto, se midieron las propiedades fisicoquímicas de los complejos de mucílago de proteína de leche (MPMC), incluidos el pH, el índice de Carr, la solubilidad en agua y los índices de absorción de agua, y se estudió el comportamiento del flujo. Además, el perfil de aminoácidos, la digestibilidad de las proteínas y los valores fenólicos yflavonoidesSe exploró el contenido de MPMC y se visualizó la microestructura de los complejos mediante microscopía electrónica de transmisión. losantioxidantey potencias anticancerígenas de MPMC contra dos líneas celulares cancerosas, cáncer de hígado humano HEPG-2 y cáncer de mama MCF-7, en comparación con dos líneas celulares normales, a saber, Bj-1 y MCF{{ 3}}F, se probaron usando un ensayo de absorción de rojo neutro. Los resultados revelaron que MPMC tenía actividad depuradora contra los radicales DPPH, ABTS y HS. Además, MPMC tiene el potencial de prevenir el daño del ADN inducido por el estrés oxidativo en la reacción de Type-Fenton. Los resultados del ensayo de rojo neutro mostraron una inhibición significativa del crecimiento tanto de HEPG-2 como de MCF-7, mientras que no se detectó ningún efecto citotóxico significativo contra Bj-1 y MCF-12F. Los resultados de la RT-qPCR indicaron que la MPMC estimuló la apoptosis, como lo revela la regulación al alza de los marcadores del gen pro-apoptosis Caspase-3, p53, Bax. Mientras tanto, el gen anti-apoptosis Bcl-2 estaba regulado a la baja. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en las líneas celulares normales tratadas con MPMC. En conclusión, MPMC puede considerarse como una entidad anticancerígena prometedora que puede usarse en el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer con una actividad comparable y efectos secundarios mínimos en comparación con las quimioterapias convencionales contra el cáncer. .

Palabras clave: proteínas de la leche; mucílago de cáscara de isabgol; mucílago nabeq; complejos de mucílago de proteínas de la leche; actividad anticancerígena

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1. Introducción

Cánceres la principal causa de mortalidad en todo el mundo con aproximadamente 10 millones de muertes en 2020 [1]. El diagnóstico precoz y el desarrollo de nuevas terapias es la única esperanza para vencer al cáncer. Los tratamientos convencionales contra el cáncer, como la quimioterapia y la radiación, son relativamente costosos y están acompañados de efectos secundarios significativos.

Por lo tanto, el interés científico y de investigación tiende a la utilización de compuestos naturales (es decir, proteínas, polisacáridos y polifenoles) de sus fuentes que tienen potencial anticancerígeno, ya que se considera que tienen efectos secundarios menos tóxicos en comparación con los tratamientos convencionales.

polisacáridosde fuentes vegetales han recibido recientemente una atención creciente debido a sus propiedades bioactivas [2,3]. Numerosos estudios se han interesado en aislar polisacáridos y polifenoles bioactivos de fuentes vegetales naturales como frutas, verduras, cereales y hierbas debido a sus efectos farmacológicos beneficiosos [4].

Plantago ovata (Psyllium o Isabgol) y Ziziphus Spina-Christi (Nabeg o Sidr) son fuentes conocidas de polisacáridos bioactivos. El IHM y NabM fueron seleccionados como materiales bioactivos prometedores. Estudios previos indicaron que los complejos IHM y NabM con proteínas de la leche mejoraron la función hepática y disminuyeron el riesgo de enfermedades cardiovasculares[5]. Se ha demostrado que la cáscara de isabgol es eficaz para el tratamiento de la diarrea, el estreñimiento, la colitis ulcerosa, el síndrome del intestino irritable, la hipercolesterolemia y la diabetes. Además, el efecto anticancerígeno de la cáscara de isabgol contra el cáncer colorrectal se atribuyó a su contenido de fibra, que actúa para disminuir sus efectos al reducir el tiempo de tránsito. Esto conducirá a la reducción del metabolismo de la bilis por parte de la microflora intestinal, la dilución de los ácidos biliares por el aumento del volumen de las heces, la alteración del metabolismo de los ácidos biliares microbianos debido a la fermentación de la fibra, la reducción del pH y la producción de ácidos grasos de cadena corta, o por unión directa a la ácidos biliares y, por lo tanto, impidiendo su metabolismo [6]. Los principales componentes biológicamente activos de Ziziphus Spina-Christi son la vitamina C, los fenoles, los flavonoides y los ácidos triterpénicos. Sus bioactividades incluyen actividades anticancerígenas, antibacterianas, antidiabéticas, antiproliferativas y antioxidantes [7]. La cáscara de Isabgol y los frutos de Nabeq se utilizan para la producción de mucílago de cáscara de Isabgol (IHM) y mucílago de Nabeq (NabM), respectivamente [5].

Por otro lado, las terapias para el cáncer basadas en proteínas han ganado un interés creciente debido a características clave como la baja citotoxicidad, la fuerte especificidad y la facilidad de modificación [8]. Además de satisfacer las necesidades nutricionales de aminoácidos esenciales, las proteínas de la leche se encuentran entre las macromoléculas biológicas que tienen muchas propiedades funcionales, como propiedades antioxidantes, inmunomoduladoras, antidiabéticas, antimicrobianas y anticancerígenas [9,10]. Por ejemplo, la actividad anticancerígena de los péptidos derivados de lácteos (es decir, -casomorfinas aisladas de -caseína y 1-fragmentos de caseína 90-95 y 90-96[Arg90-Tyr-Leu -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]) identificado en la leche bovina respalda la suposición de que las proteínas de la leche no solo tienen un valor nutritivo sino que también tienen el potencial para la prevención y el tratamiento del cáncer [11,12]

La formación de complejos entre las proteínas de la leche y los polisacáridos, como el complejo de proteínas de la leche y quitosano, se producía previamente como un intento de mejorar las propiedades funcionales de sus componentes naturales [13]. Debido a la disponibilidad y facilidad de preparación, tales complejos tienen el potencial de usarse en el desarrollo de terapias contra el cáncer menos costosas. Dichos agentes terapéuticos serán menos costosos y mostrarán una actividad comparable a los agentes quimioterapéuticos utilizados actualmente.

La unión no covalente a través de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas son los factores principales en la asociación de las proteínas de la leche conpolisacáridos[14]. Además, las proteínas muestran una sorprendente resistencia a la interacción con otros componentes en el rango de pH de 2 a 11. A un pH específico, la reactividad de la superficie de la proteína aumenta a través del despliegue de la estructura de la proteína [15].

En este contexto, nuestro grupo se ha centrado recientemente en el papel funcional de los complejos proteicos de la leche en la salud humana. Sin embargo, los complejos de proteína de leche con IHM o NabM han mostrado propiedades antihiperlipidémicas y protectoras del hígado [9]. Así, con base en estudios previos, se postuló que los complejos polisacáridos-proteína de la leche podrían tener una interesante actividad anticancerígena. Además, ninguna publicación había realizado un estudio de la actividad anticancerígena de los complejos de proteínas de la leche con IHM y NabM. Por lo tanto, los objetivos principales de este estudio fueron caracterizar las propiedades fisicoquímicas de los complejos de mucílago de proteína de leche recién producidos, incluido el perfil de aminoácidos y las propiedades funcionales de estos complejos. Además, se investigó la actividad anticancerígena de complejos de proteína de leche con IHM y mucílago NabM contra dos células cancerosas humanas (MCF7 y HEPG2) en comparación con líneas celulares no cancerosas (Bi-1 y MCF-12F ). También arrojamos luz sobre el modo de acción de los complejos de mucílago de proteínas lácteas producidos.

2. Resultados y Discusión

2.1. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)

Los espectros infrarrojos de IHM, MP y MP/IHM se ilustran en la Figura 1A. El espectro de IHM mostró la banda característica de los arabinoxilanos a 100-1200 cm-1 y las bandas de los grupos amida I y amida II a 1550 y 1650 cm-1, respectivamente. El espectro MP muestra bandas en 1700-1600 y 1200-900 cm-I correspondientes a amida I (principalmente C=O estiramiento de proteínas) y carbohidratos de leche, respectivamente [16]. Los picos de IHM y MP antes mencionados se reservaron en el espectro del complejo IHM/MP. De manera similar, las bandas características del ácido galacturónico en NabM se mantuvieron en el espectro del complejo NabM/MP (Figura 1B). Esto indicaría la ausencia de interacción química entre el mucílago polisacárido y MP y así confirmar el mecanismo propuesto de atracción electrostática entre MP y polisacáridos (IHM y NabM). Tales observaciones están en línea con las de Vukic et al, quienes informaron la formación de complejos entre las proteínas de la leche de suero y la pectina a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas que resultaron en una buena consistencia del complejo [17].

2.2. Propiedades fisicoquímicas y funcionales de MP y MPMC

Los valores de la densidad aparente (BD), la densidad filtrada (TD), el índice de Carr y las mediciones de pH se enumeran en la Tabla 1. BD y TD de MP fueron más altos que IHM, y IHM tuvo la densidad aparente y filtrada más baja de las muestras analizadas. . De manera similar, el complejo MP/IHM tuvo significativamente (p<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

WSI y WAI son características funcionales importantes en la tecnología de alimentos. La Tabla 1 muestra que WSI y WAI de MP aumentaron significativamente después de la complejación con IHM y NabM. Lo más probable es que esto se deba a que los materiales a base de Isabgol son muy solubles en agua y tienen un efecto espesante tras la adición de cantidades adecuadas de agua [19]. Además, Qaisrani et al. informaron que los arabinoxilanos de la cáscara de Isabgol tienen una capacidad de retención de agua hasta diez veces mayor que su peso seco [20]. Además, MP/IHM tiene WSI y WAI más altos que MP/NabM, ya que IHM tiene WSI y WAI más altos que NabM. Además, el aumento del porcentaje de WSI para MPMC en comparación con MP condujo a un aumento en la dispersabilidad de los componentes activos objetivo cuando se utilizan en cuestiones terapéuticas [21]. Esto quedó claro en los resultados anticancerígenos que demostraron que estos complejos tienen un efecto citotóxico que MP.

2.3. Componentes bioactivos

2.3.1. Compuestos fenólicos de PHM y NabM

Los alimentos contienen compuestos bioactivos muy importantes (es decir, fenólicos y flavonoides) que actúan como antioxidantes y potencias anticancerígenas. El análisis HPLC confirmó y cuantificó la presencia de muchos compuestos fenólicos en Nab e IHM como se demuestra en la Figura 2. Los resultados muestran el alto contenido de varios compuestos biológicamente activos como ácido gálico (177,96 mg/Kg), catecol (13,87 mg/Kg) Ácido p-Hidroxi benzoico (24,02 mg/Kg), Catequina (5,93 mg/Kg) y Rutina (123,70 mg/Kg) en extracto de PHM y Catecol (410,72 mg/Kg) Ácido p-Hidroxi benzoico (426,71 mg/Kg) Clorgénico (72,05 mg/Kg) Rutina (1750,57 mg/Kg) y rosemarínico (1771,72 mg/Kg) en NabM (Figura 2A,B). El contenido de estos compuestos es muy importante para los beneficios para la salud. El efecto anticancerígeno de los compuestos fenólicos se informó anteriormente. Este efecto se atribuyó principalmente al efecto antioxidante de estos compuestos.

2.3.2. Actividad fenólica, flavonoide y antioxidante total de MP y MPMC

Varios informes han indicado que los compuestos que exhiben propiedades antioxidantes en su mayoría muestran actividad anticancerígena [22]. El contenido total de fenoles (TP) y flavonoides totales (TF) se determinó en NabM, IHM, MP y sus complejos (Figura 3A, B). Los resultados indicaron que TP y TF fueron más altos en NabM y MP/NabM en comparación con IHM y MP/IHM. Sin embargo, los contenidos de TP y TF fueron significativamente menores en MP en comparación con MPC. Estos resultados coincidieron con los datos informados por Singh et al.[23] quienes encontraron que PT y FT de NabM fueron de 1,6 mg de GAE/100 g de peso seco y 47 mg de CE/100 g de peso seco, respectivamente. Los complejos MP/NabM y MP/IHM mostraron un aumento significativo de 309 por ciento y 59 por ciento en TP y 476 por ciento y 123 por ciento en TF en comparación con MP, respectivamente. La conjugación de MP con IHM y NabM condujo a la pérdida de 23 por ciento y 36 por ciento de TPC correspondiente a IHM y NabM, respectivamente. TF se redujo en un 44 por ciento en IHM y en un 46 por ciento en NabM cuando se complejó con MP. Esto probablemente se debió a los bajos TP y TF de MP.

La actividad potencial de eliminación de radicales de MP/IHM y MP/NabM en comparación con MP usando DPPH, ABTS y HS se ilustra en la Figura 3C-E. Los datos obtenidos de la actividad de los tres antioxidantes tuvieron una tendencia similar, lo que indica que NabM mostró una mayor actividad antioxidante que IHM y esto está en el contexto de los resultados de los compuestos fenólicos y

contenidos de flavonoides. La capacidad antioxidante de MP aumentó después de formar complejos con NabM e IHM. Con la excepción del ensayo ABTS, la actividad antioxidante de NabM aumentó por conjugación con MP. La actividad antioxidante indicó que MPMC tenía una mayor actividad antioxidante en comparación con MP. Nuestra hipótesis apunta a una posible interacción entre MP y polisacáridos que conduce a la obtención de la actividad antioxidante potencial descrita por Li et al. [24]. Se ha informado previamente que existe una correlación positiva entre la capacidad depuradora y el contenido de fenoles/flavonoides 5]. Sin embargo, no podemos excluir que se produzcan nuevos péptidos bioactivos enriquecidos con aminoácidos que contienen azufre, lo que explica la alta actividad antioxidante de MPMC en comparación con los componentes no complejados. Además, los péptidos pequeños se liberan en las fracciones de suero de leche, lo que influye en las altas propiedades antioxidantes [4]. Finalmente, los contenidos de fenoles y flavonoides afectan a diferentes células cancerosas. Además, durante los ensayos de cultivos celulares in vitro, se observaron estas actividades y mecanismos. Las actividades antioxidantes y anticancerígenas de los compuestos fenólicos se atribuyen a los dobles enlaces y sustituciones de hidroxilo en los anillos aromáticos [25].

2.4.Perfil de aminoácidos de MP y MPMC

Perfiles de aminoácidos de MP, NabM, MP/IHM y MP/NabMare ilustrados en la Figura 4. No hubo diferencias significativas en los perfiles de aminoácidos de MP y sus complejos con IHM y NabM. Esto indicó que la interacción no covalente de MP con mucílago polisacárido no cambió la composición de las proteínas de la leche. Los resultados muestran el alto contenido de ácido glutámico en MP y MPMC (Figura 4) [26].

2.5. Propiedades reológicas de MP y MPMC

2.5.1. Viscosidad aparente

La Figura S1 muestra la viscosidad de las muestras de proteínas a diferentes valores de rpm. IHM y NabM tenían una alta viscosidad a rotación lenta, pero la viscosidad disminuyó significativamente a medida que aumentaba la velocidad de rotación. Estos hallazgos coincidieron con Chen y Che, quienes registraron que la viscosidad aparente del mucílago soluble en agua de alga verde (Monostroma iridium) disminuyó al aumentar la velocidad de corte [27].

Los resultados en la Figura S1 también demuestran que la complejación de MP con IHM y NabM resultó en un aumento significativo (p menor o igual a 0.05) en la viscosidad aparente de MP. Esto podría atribuirse a las propiedades únicas de IHM (material hidrocoloide) que tiene un efecto de mejora de la viscosidad [28].

2.5.2. Comportamiento del flujo

El comportamiento de flujo (curvas de tensión de cizallamiento/velocidad de cizallamiento) de las proteínas de la leche y sus complejos se ilustra en la Figura S2. Con el aumento de la velocidad de cizallamiento, aumentó el esfuerzo de cizallamiento. Transformando los datos de esfuerzo cortante y velocidad de corte a la ecuación de la ley de potencia, los valores del índice de consistencia de flujo (K) y el índice de comportamiento de flujo (n) se muestran en la Tabla S1. IHM y MP/IHM tuvieron el índice de consistencia de flujo más alto. Esto podría deberse a la alta viscosidad del mucílago hidrosoluble de IHM debido a su alta capacidad para retener agua y gelificar en un medio acuoso. Los resultados también demostraron que IHIM, NabM y MP/IHM tenían un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento (fluidos no newtonianos) con un valor de n bajo que oscilaba entre 0,25 y 0,64. Estos resultados coincidieron con Thanatcha y Pranee, quienes estudiaron las propiedades fisicoquímicas de Ziziphus mauritiana[29]. Por otro lado, el valor n de MP fue de aproximadamente 1(0.99) indicando un flujo newtoniano. De manera similar, el valor n para el complejo MP/NabM fue 0.95 como se muestra en la Tabla S1.

2.6.Calorimetría diferencial de barrido de MP y MPMC

Se utilizó calorimetría diferencial de barrido para investigar la estabilidad térmica de MP y sus complejos con IHIM y NabM. Los termogramas de MP y MPMC se ilustran en la Figura S3, y los parámetros de DSC se proporcionan en la Tabla 2. Se observó que no había un pico endotérmico claro en el termograma de MP, pero había un pico endotérmico prominente para MP/IHM y un pico endotérmico amplio para MP/NabM. Esto probablemente se deba a la eliminación gradual del agua libre, el punto de fusión de NabM, la gelificación lenta y la desnaturalización de las proteínas [30].

También se observó que MPMC era más estable al calor que la proteína no complejada, como se observa por la baja temperatura de desnaturalización de MP (101,44 grados) en comparación con MP/IHM y MP/NabM (148,24 y 121,4 grados, respectivamente) como se muestra en la Tabla 2. Además, la temperatura de degradación de MP se registró en 302,3 grados, mientras que no se observó degradación de MPMC con un aumento de temperatura de hasta 350 °C. Estos hallazgos coincidieron con varios estudios, que encontraron que la estabilidad térmica de las proteínas de la leche aumentaba por la interacción con compuestos fenólicos que impedían la agregación de proteínas [2,31].

El calor que entra o sale del sistema durante una reacción es la entalpía (AH). La mayor entalpía de MP/IHM y MP/NabM en comparación con la MP no complejada podría deberse a la posible reacción química entre las proteínas de la leche (suero y caseína) y entre las proteínas de la leche y los polisacáridos a alta temperatura (reacción de Maillard)[ 31

2.7.Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de MP y MPMC

La Figura 5 muestra la microestructura de IHM, NabM, MP y MPMC. Se encontró que el tamaño de partícula de MPMC estaba en el rango nano (114-250 nm) y era más pequeño que el tamaño de partícula de MP (191-300 nm). Además, el TEM de MPMC (Figura 5D, E) reveló el patrón ramificado de los complejos formados. Esto podría atribuirse a la atracción electrostática entre las proteínas de la leche y los polisacáridos Goh, et al. [32]. Además, la estructura ramificada más grande de MP/IHM en comparación con MP/NabM podría ser responsable de su mayor viscosidad, como se muestra en la Figura S1.

2.8. Estudios biológicos sobre MP y MPMC

2.8.1. Actividad anticancerígena de MP y MPMC

El efecto citotóxico de varias concentraciones (1, 5, 10 y 20 ug/mL) de MP y MPMC en células HepG-2 y MCF-7 en comparación con MCF-12F y Bij{ Las células normales {7}} se ilustran en las Figuras 6 y 7. MPMC exhibió un efecto anticancerígeno en las células HepG-2 y MCF-7 Figura 6A, B, respectivamente. La curva dosis-respuesta mostró una reducción en la viabilidad celular en respuesta a concentraciones más altas. Por otro lado, no se observó ningún efecto citotóxico significativo de MP y MPMC en células normales Bj-1 y MCF-12F (Figura 6C, D). Nuestros resultados también indicaron que MP/NabM tenía una mayor actividad anticancerígena contra las líneas celulares de cáncer HepG-2 y MCF-7, con valores de IC50 de 5,13 y 10,07 ug/mL, respectivamente. Además, MP/IHM exhibió un efecto citotóxico moderado contra las líneas de células cancerosas en comparación con los controles respectivos. En conjunto, nuestros datos citotóxicos sugieren que la MP complejada con IHM y NabM mejora significativamente la actividad anticancerígena en comparación con las proteínas de leche no complejadas, como se muestra en la Tabla 3. También fue evidente que las células Hep G-2 eran más sensibles a MP y MPMC en comparación con las células MCF-7 como se manifiesta por los valores más bajos de IC50.

El efecto anticancerígeno de los péptidos antitumorales derivados de la proteína de la leche se ha informado anteriormente. En este contexto, Jeong y Hong [33] observaron que los hidrolizados de tripsina de -lactoalbúmina tenían un efecto citotóxico en el cáncer de hueso humano SJSA-1, el cáncer colorrectal humano HCT 116 y el cáncer gástrico humano en las líneas celulares NCI-N87. Se encontró que la o-lactoalbúmina interactúa con los moduladores de la superficie celular y altera la tasa de crecimiento celular, el calcio intracelular y la tasa de transporte de calcio [34]. Vale la pena señalar que la lactoferrina bovina indujo la apoptosis en las células MCF7 de una manera dependiente de la dosis [35]. Además, las fracciones de caseína y proteína de suero de leche mostraron efectos antitumorales en un modelo animal, así como actividad antiproliferativa in vitro [36]. Además, Elzoghby et al.[37] informaron que las nanopartículas de caseína se pueden usar para encapsular el fármaco anticancerígeno hidrofóbico, flutamida, para controlar la liberación del fármaco, mejorar su actividad antitumoral y disminuir su hepatotoxicidad.

El efecto anticancerígeno de IHIM y NabM se informó previamente [6,38]. El efecto citotóxico de MP y MPMC podría atribuirse a la presencia de aminoácidos como la glutamina, la arginina y la cisteína que, según se informa, presentan actividad anticancerígena contra el cáncer colorrectal [39]. Estos resultados están de acuerdo con el alto contenido de ácido glutámico de MPMC (Figura 5).

2.8.2. Determinación del nivel de proteínas p53, Bax, caspasa-3 y Bd-2

Para investigar el mecanismo de citotoxicidad de MPMC, se determinó el nivel de proteínas marcadoras de apoptosis p53, Bax, Caspase-3 y Bcl-2 en HepG-2, MCF-7 , Bj-1 y líneas celulares MCF-12F tratadas con IC0 de MPMC (Figura 8). El nivel de marcadores pro y antiapoptóticos está asociado con la inducción de apoptosis en líneas celulares de cáncer [40,41]. Los resultados indicaron que MP/NabM y MP/IHMaumentaron la apoptosis en las líneas celulares HepG-2 y MCF-7, pero no en las líneas celulares MCF-12F y Bj-1. El nivel de caspasa-3, p53, Bax aumentó significativamente en comparación con los controles respectivos (Figura 8), mientras que la proteína Bcl-2 se redujo en todos los tratamientos. Curiosamente, MP también mostró una alteración significativa en los marcadores de proteínas de apoptosis. Esto coincidió con los resultados del estudio contra el cáncer y podría denominarse efecto citotóxico de una serie de péptidos derivados de proteínas de la leche, como se mencionó anteriormente (Sección 2.8.1).

2.8.3. Protección contra daños en el ADN por MPMC contra la escisión oxidativa del plásmido RNH1

El ADN del plásmido RNH1 tiene tres formas en la electroforesis en gel de agarosa ordenadas de arriba a abajo como ADN circular abierto, lineal y circular superenrollado. El estrés oxidativo por el reactivo de Fenton indujo daño en el ADN. Posteriormente, se altera el nivel de formas de ADN. Sin embargo, las formas lineales y circulares abiertas indican daño en el ADN y el ADN circular superenrollado indica un mayor potencial de protección. En este ensayo, probamos si MP y MPMC en su IC50 pueden proteger contra la degradación de la forma circular superenrollada en respuesta al estrés oxidativo. Como resultado, tanto MP/NabM como MP/IHM mostraron una alta capacidad de protección similar al control de ADN (carriles 3 y 4, Figura 9A). Por otra parte, no se observaron diferencias significativas en el ADN tratado con MP en comparación con el control de ADN y el ADN tratado solo con el reactivo de Fenton (carril 5).

2.8.4.Protección del daño del ADN por MPMC contra la escisión oxidativa del ADN genómico

Usando la técnica de PCR, se examinaron las propiedades protectoras de MPMC sobre el daño del ADN genómico inducido por la reacción de Fenton. En general, el daño en el ADN reduce el número de copias de ciertos genes, lo que produce una menor intensidad de banda en la electroforesis en gel. Se analizó el gen MTHFR de densidad de banda del ADN genómico de la sangre incubado con el reactivo de Fenton con y sin las IC50 de MP, MP/NabM y MP/IHM. Se encontró que MP/NabM y MP/IHM (carriles 3 y 4, Figura 9B) prevenían el daño del ADN y, posteriormente, protegían el sitio de corte de la plantilla MTHFR. Por lo tanto, se produjo una intensidad de banda de producto de PCR más alta en el gel de electroforesis en comparación con los controles respectivos (Figura 9B). Estos resultados indicaron que la actividad antioxidante de MPMC inhibía la producción de radicales libres que mediaban en el daño del ADN.

2.8.5. La expresion genica

De acuerdo con los datos obtenidos del marcador de proteína de apoptosis, los resultados de RT-qPCR revelaron que la incubación de células HepG-2, MCF-7 con MP, MP/NabM y MP/IHM indujo una regulación positiva significativa de pro- marcadores de ARNm apoptóticos, a saber, Casp3, p53 y Bax, mientras que el nivel de expresión del marcador antiapoptótico Bcl-2 estaba significativamente regulado a la baja (Figura 10A-D). Las caspasas son proteínas actoras que juegan un papel vital en el inicio y mantenimiento de la apoptosis. Sin embargo, la regulación al alza de la proteína caspasa 3 es indicativa de la ejecución de la vía intrínseca principal de la apoptosis (Figura 10A, B) que se caracteriza por el colapso de la membrana mitocondrial con la liberación de citocromo c inducida por Bax y la activación de la caspasa 9 que conduce a la compromiso posterior de caspasa 3 [42]. La regulación positiva de Casp3, p53 y Bax, junto con la reducción de la expresión de Bcl-2 reveló que MP, MP/NabM y MP/IHM desencadenaron la apoptosis. En este sentido, la regulación al alza de p53 estimuló la expresión de Bax, que a su vez inducirá la liberación de citocromo c, seguida de la activación de caspasa-9 y -3. Sin embargo, se sabe que Bcl-2 como antiapoptosis inhibe la liberación de citocromo c [43], el tratamiento resultó en reducciones significativas en los niveles de transcripción de ARNm del gen marcador antiapoptótico Bcl-2 debido a Tratamiento con MP/NabM y MP/IHM, que facilita la liberación de citocromo c inducida por Bax sin oposición y la posterior apoptosis. En este estudio, MP/NabM mediaba severamente la apoptosis en comparación con MP/IHM y MP como se observa en la (Figura 10). Los efectos anticancerígenos observados de MP/NabMor MP/IHM proceden a través de la modulación de la vía de apoptosis dependiente de ap53-ya que tanto sus niveles de transcripción de proteína como de ARNm estaban significativamente regulados al alza.

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