Natalenamidas A–C, tripéptidos cíclicos de Actinomadura sp. RB99

Abstracto:

En los últimos años, han aumentado las investigaciones sobre la bioquímica de las bacterias asociadas a insectos. Cuando se combinan con procesos analíticos de desreplicación, estos estudios proporcionan una poderosa estrategia para identificar compuestos estructural y/o biológicamente nuevos. Los péptidos cíclicos no sintetizados ribosomalmente tienen un amplio espectro de bioactividad con un alto potencial medicinal.

Aquí informamos el descubrimiento de tres nuevos tripéptidos cíclicos: natalenamidas A–C (compuestos 1–3). Estos compuestos se identificaron a partir del caldo de cultivo de Actinomadura sp. RB99 utilizando un método de desreplicación basado en cromatografía líquida (LC)/ultravioleta (UV)/espectrometría de masas (MS). Las estructuras químicas de los nuevos compuestos (1–3) se establecieron mediante el análisis de métodos espectroscópicos integrales, incluidos los magnéticos nucleares unidimensionales (1H y 13C) y bidimensionales (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC). espectroscopia de resonancia (NMR), junto con datos de espectrometría de masas de ionización por electrospray de alta resolución (HR-ESIMS). Las configuraciones absolutas de los nuevos compuestos se aclararon mediante el análisis de Marfey. A través de varias pruebas de bioactividad para los tripéptidos, encontramos que el compuesto 3 exhibió efectos inhibitorios significativos sobre la producción de melanina inducida por 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). El efecto del compuesto 3 fue similar al del ácido kójico, un compuesto ampliamente utilizado como material cosmético con un efecto blanqueador de la piel.

Una piel clara, tersa y delicada ha sido siempre el objetivo perseguido por las mujeres orientales. La investigación y el desarrollo de agentes blanqueadores para productos para el cuidado de la piel se basan principalmente en la inhibición de la actividad de la tirosinasa.

Los compuestos que contienen anillos de benceno o estructuras de hidroxilo fenólico tienen efectos blanqueadores potenciales, como el agente blanqueador arbutina, que se usa comúnmente en la actualidad, que puede ejercer efectos blanqueadores al inhibir la actividad de la tirosinasa.

Y encontramos que Cistanche deserticola tiene un efecto blanqueador. El principal ingrediente activo de Cistanche deserticola, los glucósidos feniletanoides, es un tipo de compuesto glucósido natural. Los estudios han encontrado que los glucósidos feniletanoides pueden inhibir la actividad de la tirosinasa y la producción de melanina en los melanocitos epidérmicos humanos y tener un efecto blanqueador. eficacia del agente.

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Palabras clave:

termitas que cultivan hongos; Actinomadura sp.; tripéptidos; natalenamidas A–C; efectos blanqueadores de la piel.

1. Introducción

El análisis químico de simbiontes bacterianos protectores de insectos agrícolas ha atraído mucha atención entre los químicos de productos naturales en los últimos años [1–5]. Mediante el uso de procesos de desreplicación basados ​​en resonancia magnética nuclear (NMR)/espectrometría de masas (MS) de última generación y bioensayos ecológicamente relevantes, se ha descubierto una cantidad impresionante de productos naturales estructuralmente intrigantes, incluidos varios péptidos cíclicos sintetizados sin ribosomas. de simbiontes microbianos [6]. Los ejemplos más destacados incluyen el antifúngico dentigerumicina, un depsipéptido cíclico aislado de una Pseudonocardia sp. [7], y las gerumicinas A-C, depsipéptidos cíclicos portadores de ácido piperácico identificados a partir de Pseudonocardia sp. [8].

Se ha demostrado que los péptidos cíclicos exhiben una amplia gama de actividades biológicas, lo que fomenta varios enfoques sintéticos hacia estas estructuras farmacológicamente prometedoras [9-12]. Más de 40 fármacos de péptidos cíclicos se comercializan actualmente y se utilizan ampliamente en entornos clínicos, y aproximadamente un nuevo fármaco de péptidos cíclicos ingresa al mercado cada año, en promedio [13].

Como parte de nuestro esfuerzo continuo por identificar metabolitos secundarios estructuralmente nuevos y/o bioactivos de microbios asociados a termitas [14–17], nos enfocamos en Actinomadura sp. RB99, aislado de la termita que cultiva hongos, Macrotermes natalensis. Nuestra estrategia de desreplicación basada en cromatografía líquida (LC)/ultravioleta (UV)/espectrometría de masas (MS) produjo productos naturales bioactivos potencialmente novedosos. En este estudio, informamos el aislamiento y la identificación química de tres nuevos tripéptidos cíclicos, natalenamida A–C (compuestos 1–3, Figura 1), utilizando un método de desreplicación basado en LC/UV/MS, así como sus evaluaciones biológicas de citotóxicos. , actividades antiinflamatorias y blanqueadoras de la piel.

2. Resultados y Discusión

2.1. Aislamiento basado en cromatografía líquida (LC)/ultravioleta (UV)/espectrometría de masas (MS) de los compuestos 1–3

Actinomadura sp. RB99 se aisló de la superficie de una termita obrera (M. natalensis). El análisis filogenético de una secuencia casi completa de ácido ribonucleico ribosomal (ARNr) 16S sugiere que la cepa RB99 pertenece al género Actinomadura, con el vecino más cercano Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. El análisis posterior basado en LC/UV/MS de extractos de cultivos enriquecidos reveló un conjunto de absorciones UV características con picos de iones moleculares únicos que contienen átomos de nitrógeno.

Para identificar los metabolitos respectivos e investigar su actividad, se llevó a cabo una fermentación a gran escala utilizando condiciones de crecimiento optimizadas (100 placas de agar de 2 L de agar ISP2, pH 6, 10 días a 30 ◦C) y un procedimiento establecido de tratamiento y prepurificación. aplicado [17]. El subsiguiente fraccionamiento guiado por LC-UV/MS y la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) semipreparativa repetitiva dieron como resultado el aislamiento de tres metabolitos con un patrón único de NMR/MS. Realizamos estudios de crecimiento y medios utilizando diferentes composiciones de sal (NaCl, KBr 1–3 por ciento) y medios (medios ISP1-6) para imitar el entorno natural y estimular la producción de metabolitos, lo que también condujo a la presencia de los tres nuevos metabolitos (consulte la Figura complementaria S19).

2.2. Elucidación estructural de los compuestos

La natalenamida A (1) se adquirió como un polvo amorfo. Se determinó que la fórmula molecular de 1 era C19H25N3O5 a partir del ion molecular aducido con sodio am/z 398,1691 [M más Na] más (calculado para C19H25N3O5Na, 398,1692) usando espectrometría de masas de ionización por electropulverización de alta resolución en modo de iones positivos (HR- ESIMS) datos. El espectro infrarrojo (IR) mostró una fuerte banda de absorción a 1670 cm−1, lo que sugiere la presencia de grupos amida en la molécula. El análisis detallado de los datos de RMN de 1H de 1 (Tabla 1) indicó las señales típicas de un esqueleto peptídico, mostrando dos señales de metilo (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) y 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), tres señales de metileno (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) y 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), cuatro señales de metino (δH 2,02 (1H , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6), y 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)), y cinco protones aromáticos superpuestos (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18) y 7,24 (2H, m, H-15/17)).

El espectro de RMN de 13C (Tabla 1), con la ayuda de los espectros de HSQC y HMBC, mostró un total de 19 resonancias de carbono responsables de dos señales de metilo (δC 18.9 y 19.9), tres señales de metileno (δC 27.0, 30.6 y 38.8), nueve señales de metino (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) y 130.6 (×2)), incluidos cinco carbonos aromáticos, un carbono olefínico señal (δC 138,8) y cuatro señales de carbono carbonilo (δC 173,2, 173,3, 174,8 y 181,3). En combinación con los datos espectroscópicos anteriores, la inspección detallada de RMN bidimensional (2D) (experimentos 1H-1H COSY, HSQC y HMBC) reveló la presencia de tres aminoácidos en 1: glutamato (Glu), fenilalanina ( Phe) y valina (Val) (Figura 2). La conectividad de estos aminoácidos fue determinada por las correlaciones HMBC de H-1/C-5 y C-19, H-11/C-10 y C{ {50}}, y H-6/C-5 y C-10 (Figura 2).

Para identificar la configuración absoluta de 1, se aplicó el método de Marfey para determinar la estereoquímica de los múltiplos de -H (C-1, C-6 y C-11). Los hidrolizados ácidos de los aminoácidos 1 y estándar (L/D-Glu, Phe y Val) se derivatizaron con 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (L-FDAA). Sucesivamente, la mezcla derivatizada de 1 y los aminoácidos estándar se analizaron por LC/MS para examinar su tiempo de retención. Se determinó que todas las configuraciones absolutas de los restos Glu, Phe y Val eran formas L, basándose en los tiempos de retención de los derivados de L-FDAA de 1 en comparación con los de los aminoácidos estándar. Por lo tanto, la estructura de 1 se aclaró como el tripéptido cíclico que se muestra en la Figura 1.

La natalenamida B (2) se aisló como un polvo amorfo. Su fórmula molecular (C20H27N3O5) se dedujo de los picos de iones moleculares de hidrógeno y sodio aducidos en 390,2032 [M más H] más (calculado para C20H28N3O5, 390,2029) y 412,1849 [M más Na] más (calculado para C20H27N3O5Na, 412,1848), respectivamente. En comparación con la fórmula molecular y los datos espectrales de RMN de 1, el compuesto 2 parecía tener un grupo CH2 adicional en el esqueleto peptídico. El examen exhaustivo de los espectros unidimensionales (1D) (1H y 13C NMR) y 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC y HMBC) de 2 reveló la existencia de tres residuos de aminoácidos: Glu, Phe y Leu (leucina). La secuencia de estos aminoácidos se construyó en base a las correlaciones HMBC de H-1/C-6 y C-20, H-12/C-11 y C -20, y H-7/C-6 y C-11 (Figura 2). Para determinar la configuración absoluta de 2, se realizó la derivatización de los residuos Glu, Phe y Leu con L-FDAA y luego se analizó por LC/MS. En los datos de LC/MS, se detectaron L-Glu, L-Phe y L-Leu comparando los tiempos de retención de los derivados de L-FDAA de 2 con los de los aminoácidos estándar. Por lo tanto, la estructura química de 2 se estableció como el tripéptido cíclico que se muestra en la Figura 1.

Los datos de HR-ESIMS en modo positivo de natalenamida C (3) mostraron iones moleculares aducidos con hidrógeno y sodio a 424,1870 [M más H] más (calculado para C23H26N3O5, 424,1872) y 446,1694 [M más Na] más (calculado para C23H25N3O5Na, 424.1692). Esto sugirió que su fórmula molecular era C23H25N3O5. Un análisis detallado de los espectros de RMN 1D y 2D de 3 indicó que su estructura química era similar a la de 2, excepto que Leu se sustituyó con Phe en 3. La conectividad de los tres aminoácidos identificados en 3 se verificó utilizando las correlaciones HMBC de H-1/C-9 y C-23, H-15/C-14 y C-23, y H-10/ C-9 y C-14 (Figura 2). Al aplicar el método de Marfey al compuesto 3, se dilucidaron las configuraciones absolutas de los múltiplos de -H (C-1, C-10 y C-15) para ser un L-Glu y dos L -Framentos Phe. En consecuencia, la estructura completa de 3 se determinó como se muestra en la Figura 1.

Las natalenamidas A-C son péptidos tricíclicos, presumiblemente de origen no ribosómico. Actualmente, varios tripéptidos cíclicos bioactivos se han caracterizado como productos naturales: tripéptidos cíclicos 17-miembros citotóxicos (p. ej., OF4949 I–IV) aislados de Penicillium rugulosa [18]; esclerotomías antifúngicas A-K, identificadas a partir del caldo de fermentación de bacterias halotolerantes [10]; y E psicrófila antiproliferativa, aislada de un cultivo mixto de dos cepas fúngicas derivadas de algas marinas del género Aspergillus [19].

2.3. Actividades biológicas de los compuestos 1-3

Dado que se ha informado que los péptidos cíclicos exhiben una amplia gama de actividades biológicas, los efectos biológicos de los tripéptidos cíclicos aislados ({{0}}) se evaluaron utilizando tres bioactividades. La citotoxicidad de los compuestos 1-3 se investigó contra cuatro líneas celulares de cáncer (células de cáncer de mama MCE7, células de cáncer de cuello uterino HeLa, células de cáncer de pulmón humano A549 y células de cáncer de hígado HepG2) a diferentes concentraciones (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 y 100 uM). El compuesto 1 no afectó a la viabilidad celular de las células MCF-7, HeLa o A549. Sin embargo, el tratamiento de células HepG2 con 100 M del compuesto 1 disminuyó la viabilidad celular a 78,5 más 3,2 por ciento (Figura 3). El compuesto 2 redujo las viabilidades celulares de las células HeLa y A549 a 82,9  2,1 por ciento y 73,5=3,0 por ciento, respectivamente, pero no afectó la viabilidad de MCF-7 o Células HepG2 (Figura 3). El Compuesto 3 no afectó a la viabilidad de ninguna de las líneas celulares (Figura 3).

A continuación, se utilizaron macrófagos RAW264.7 para investigar los efectos antiinflamatorios de los compuestos aislados. Para eliminar errores en la producción de NO causados ​​por cambios en las tasas de supervivencia celular, se examinaron concentraciones no tóxicas de cada compuesto. Como se muestra en la Figura 4, los compuestos 1–3 tuvieron pocos efectos citotóxicos en las células RAW264.7 (Figura 4A–C) y no ejercieron efectos inhibitorios sobre la producción de NO en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacáridos (LPS) (Figura 4D–F) .

Los efectos inhibitorios de los compuestos 1–3 sobre el contenido de melanina en las células B16F10 se examinaron como evidencia de sus actividades de blanqueamiento de la piel (Figura 5). Dado que los cambios en la viabilidad celular causan errores en la producción y medición de melanina, primero examinamos los efectos de los compuestos 1 a 3 en la supervivencia de las células B16F10. Los compuestos 1–3 no ejercieron efectos citotóxicos en las células B16F10 en ninguna de las concentraciones utilizadas (Figura 5A–C). Luego evaluamos los efectos inhibitorios de los compuestos sobre la producción de melanina inducida por 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) en células B16F10 (Figura 5D-F). IBMX, un conocido estimulador de la melanogénesis, induce un aumento significativo en la producción de melanina luego de un solo tratamiento en células de melanoma. Entre los compuestos evaluados, el compuesto 3 (a 5–100 µM) exhibió efectos inhibitorios significativos sobre la síntesis de melanina mediada por IBMX de una manera dependiente de la dosis. El ácido kójico, nuestro control positivo, se ha utilizado ampliamente como material cosmético con efectos blanqueadores de la piel [20]. El efecto inhibitorio del compuesto 3 sobre la producción de melanina inducida por IBMX fue similar al del ácido kójico (Figura 5F), lo que sugiere que el compuesto 3 funciona como un potente inhibidor de la producción de melanina inducida por IBMX en células de melanoma B16F10.

Además, el compuesto 3 estaba contaminado con una pequeña cantidad de impurezas, que se determinaron como análogos de ácidos grasos mediante la interpretación de los datos espectroscópicos de RMN y el análisis de LC/MS (Materiales complementarios, Figuras S11–S15 y S23). Para identificar la actividad de las impurezas, se realizaron experimentos adicionales con los análogos de ácidos grasos por sus efectos inhibitorios sobre la producción de melanina inducida por IBMX en células B16F10, lo que reveló que los compuestos probados no tenían efecto blanqueador (Materiales complementarios, Figura S24). Por lo tanto, aunque no podemos excluir que las impurezas en el compuesto 3 sean responsables del efecto inhibidor sobre la producción de melanina inducida por IBMX, esto parece poco probable.

3. Materiales y Métodos

3.1. Procedimientos Experimentales Generales

Los espectros infrarrojos se adquirieron en un espectrómetro Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, EE. UU.). La ionización por electropulverización y los espectros HR-ESIMS se midieron en un espectrómetro de masas de cromatografía líquida (LC) SI-2/LCQ DecaXP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los espectros de RMN, incluidos los experimentos 1H–1H COSY, HSQC y HMBC, se realizaron con un espectrómetro Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, EE. UU.) que funciona a 800 MHz (1H) y 200 MHz (13C), con desplazamientos químicos dados en ppm (δ). La HPLC preparativa utilizó una bomba de HPLC binaria Waters 1525 con detector de matriz de fotodiodos Waters 996 (Waters Corporation, Milford, CT, EE. UU.). Se utilizó gel de sílice 60 (malla 230–400, Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.) y gel de sílice RP-C18 (malla 230–400, Merck) para la cromatografía en columna. La HPLC semipreparativa utilizó un sistema de HPLC Shimadzu Prominence con SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC detectores ultravioleta-visible (UV-Vis) (Shimadzu, Tokio, Japón). Los análisis LC/MS se llevaron a cabo en un sistema Agilent 1200 Series HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. EE. UU.) equipado con un detector de matriz de diodos y un espectrómetro de masas ESI serie 6130 con un Kinetex analítico (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Se utilizaron placas F254 de gel de sílice recubiertas previamente de Merck y placas RP-18 F254s para cromatografía en capa (TLC) Se detectaron manchas en TLC bajo luz ultravioleta o por calentamiento después de rociar con una solución de anisaldehído-ácido sulfúrico.

3.2. Material microbiano

Actinomadura sp. RB99 fue aislado de la superficie de una termita obrera del género M. natalensis, (colonia Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) el 2 de enero{ {13}}10. El biomaterial se colocó en bolsas de plástico limpias y se procesó en el plazo de un día desde la recogida. Las termitas se lavaron en agua desionizada estéril y las bacterias se aislaron sembrando las suspensiones resultantes en medios bajos en nutrientes con quitina (por litro: 4 g de quitina, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 y 20 g de agar) [21]. Los aislamientos con morfología similar a Actinobacteria se transfirieron a agar ISP2 (por litro: 10 g de extracto de malta, 4 g de extracto de levadura, 4 g de glucosa y 20 g de agar) y se subcultivaron hasta obtener aislamientos puros.

3.3. Extracción de ADN y amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa

Actinomadura sp. RB99 se cultivó en medio líquido rico en nutrientes ISP2 durante cinco a siete días a 30 ◦C. Se recolectaron las células y se extrajo el ADN genómico utilizando el kit de purificación de ADN genómico GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante con los siguientes cambios: (a) el tratamiento con lisozima se extendió a 40 min y (b) el tratamiento con proteinasa K se extendió a 40 min. El ADN se cuantificó fotométricamente utilizando un espectrómetro Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Para los estudios filogenéticos, el gen 16S rRNA se amplificó utilizando el juego de cebadores 1492R/27F. Cada reacción de amplificación se preparó en un volumen de reacción final de 25 µL que contenía 7,25 µL de agua destilada, 5 µL de tampón HF, 5 µL de cada cebador (2,5 µM), {{10}},5 µL de dNTP (10 µM), 0,25 µL de ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) y 2 µL de ADN extraído (plantilla). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en las siguientes condiciones: 98 ◦C durante 38 s; 32 ciclos de 98 ◦ por 30 s, 52 ◦C por 45 s, 72 ◦C por 1 min 20 s; y una extensión final de 72 ◦C durante 8 min. El producto de PCR se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa y las reacciones de PCR se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR (Thermo Scientific). Los fragmentos de ADN se secuenciaron en GATC (Konstanz, Alemania).

3.4. Secuenciación e identificación de especies

Se evaluó la pureza y los desajustes de las secuencias utilizando BioEdit [22]. Las secuencias directa e inversa obtenidas para cada cepa se ensamblaron con BioEdit y se analizaron en busca de quimeras utilizando DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Las secuencias resultantes se depositaron en GenBank (número de acceso: KY558684). Los análisis Blast con secuencias de ARNr 16S casi completas (1368 pb) se realizaron utilizando la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (secuencias de ARN de referencia). Los resultados indicaron que la cepa RB99 es miembro del género Actinomadura. Las secuencias de los primeros 10 aciertos se descargaron de la base de datos del NCBI y se alinearon con la secuencia de ARNr 16S de Actinomadura sp. RB99 utilizando el servicio de alineación de secuencias de Sina [23]. Se reconstruyeron dos árboles filogenéticos diferentes con algoritmos de unión de vecinos o de máxima verosimilitud utilizando el software MEGA versión 7.0.26 [24–26]. El modelo de distancia evolutiva de Tamura y Nei se utilizó para generar matrices de distancia evolutiva para los algoritmos de máxima verosimilitud y unión de vecinos, con la eliminación de lagunas completas y datos faltantes [27]. Para el algoritmo de máxima verosimilitud, se utilizó una distribución gamma discreta (más G) y el modelo de variación de la tasa permitió que algunos sitios fueran evolutivamente invariables (más I). Para el algoritmo de unión de vecinos, la variación de la tasa entre sitios se modeló con una distribución gamma (más G). Los valores de confianza de los nodos se evaluaron mediante análisis de arranque basados ​​en 1000 pasos de remuestreo [28].

3.5. Extracción y Aislamiento

Actinomadura sp. RB99 se cultivó en 50 mL de caldo ISP2 durante siete días a 30 ◦C (precultivo) y se usó para inocular 100 placas de agar ISP2. Las placas se incubaron durante 10 días a 30 ◦C, se cortaron en trozos pequeños, se consolidaron y se sumergieron durante la noche en MeOH. La fase de MeOH se filtró y se evaporó a presión reducida. El extracto de MeOH (20 g) se disolvió en agua destilada (700 ml) y luego se repartió el disolvente con EtOAc (700 ml) tres veces, proporcionando 1,1 g de residuo. La fracción soluble en EtOAc (1,1 g) del extracto de MeOH se cargó en una columna de gel de sílice (malla 230–400) para cromatografía y se eluyó con un sistema de disolvente en gradiente de CH2Cl2-MeOH (100:1 a 1: 1, v/v). Esto proporcionó seis fracciones (A–F), que se sometieron a un análisis basado en LC-UV/MS. El análisis de desreplicación utilizando una biblioteca espectral UV interna sugirió la existencia de análogos de péptidos menores en la fracción E. Estos mostraron un patrón UV simple en alrededor de 220 nm y picos de iones de fórmula molecular únicos que contienen átomos de nitrógeno. La fracción polar E (233 mg) se fraccionó mediante HPLC preparativa de fase inversa (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, EE. UU.) usando CH3CN/H2O (1:9 a 9:1, v /v, sistema de gradiente, velocidad de flujo: 5 mL/min) para producir cinco subfracciones (E1–E5). La subfracción E2 (27 mg) se purificó mediante HPLC de fase inversa semipreparativa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm de d.i., 5 µm) con 33 % de MeOH/H2O (sistema isocrático, caudal: 2 ml/min). ) para producir el compuesto 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Los compuestos 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) y 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) se aislaron de la subfracción E3 (15 mg) mediante fase inversa semipreparativa. HPLC eluyendo con 43 por ciento de MeOH/H2O (sistema isocrático, velocidad de flujo: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamida A (1)

3.5.2. Natalenamida B (2)

3.5.3. Natalenamida C (3)

3.6. Hidrólisis ácida de los compuestos 1–3

Se hidrolizó una cantidad total de 00,4 mg de cada compuesto (1–3) con HCl 6 N (500 µL) durante 1 h a 110 ◦C. Después de enfriar a temperatura ambiente, los hidrolizados de 1 a 3 se evaporaron para eliminar las trazas de HCl. Se añadió agua destilada (500 µL) a las mezclas de hidrolizado y luego se evaporó para eliminar las trazas de HCl; este proceso se realizó tres veces.

3.7. Determinación de la configuración absoluta de los aminoácidos en 1–3

Las mezclas de hidrolizados (1–3), así como los aminoácidos estándar (L/D-Leu, Glu, Phe y Val), se disolvieron en NaHCO3 1 N (100 µL) y luego se trataron con 50 µL de L-FDAA (10 mg/mL en acetona). Sucesivamente, cada hidrolizado se calentó durante 10 min a 80 ◦C. Cada mezcla se inactivó con HCl 2 N (50 µl) y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en 300 µL de MeOH. Cada alícuota (5 µL) adquirida de las mezclas de hidrolizados se inyectó directamente en el LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, caudal de 0,3 ml/min) y se realizó un escaneo completo en positivo y negativo. Se aplicaron modos iónicos (rango de barrido de m/z 100 a 1000) para identificar los tiempos de retención de los aminoácidos derivatizados con L-FDAA.

La fase móvil, que consiste en ácido fórmico en agua destilada ({{0}},1 por ciento v/v) (A) y acetonitrilo (B), se transportó con un sistema de gradiente de disolvente de la siguiente manera: 20–40 % (B) durante 10 min, 100 % (B) isocrático durante 5 min y, a continuación, 20 % (B) isocrático durante 5 min, para realizar un procedimiento de lavado posterior a la ejecución de la columna. Los tiempos de retención de los aminoácidos derivatizados con L-FDAA utilizados como estándares fueron 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M más H] más ), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M más H] plus), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M más H] más ), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M más H] más ), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M más H] más ) y 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M más H] más ). Los tiempos de retención de los hidrolizados derivatizados de 1–3 fueron L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) y L-Val (22,5 min) de 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) y L-Leu (25,6 min) de 2; y L-Glu (16,9 min) y L-Phe (25,7 min) de 3.

3.8. Ensayos citotóxicos con células cancerosas

Las células MCF7, HeLa y A549 se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE. UU.). Las células HepG2 se adquirieron del Korean Cell Line Bank (Seúl, Corea). Las células MCF7 se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complementado con suero fetal bovino al 10 por ciento. Las células HeLa y A549 se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, EE. UU.) complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento. Las células HepG2 se cultivaron en Medio Mínimo Esencial suplementado con suero fetal bovino al 10 por ciento. Las condiciones de cultivo se mantuvieron a 37 ◦C en una atmósfera humidificada que contenía un 5 por ciento de CO2. La citotoxicidad se analizó en estas cuatro líneas celulares humanas (MCF7, HeLa, A549 y HepG2) utilizando el kit de ensayo de viabilidad celular EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón). Brevemente, se sembraron 5 × 103 células/pocillo en 96-placas de pocillos. Después de 24 h, las células se trataron con los compuestos a las concentraciones indicadas. Después de 72 h de incubación, se utilizó el kit de ensayo de viabilidad celular EZ-CyTox. Después de 2 h de incubación, se midió la absorbancia a 450 nm con una referencia a 620 nm. La viabilidad celular se calculó como un porcentaje del control.

3.9. Actividad antiinflamatoria

La línea celular de macrófagos de ratón RAW264.7 se adquirió de la American Type Culture Collection. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 por ciento, 100 unidades/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina, y se incubaron a 37 ◦C en una atmósfera húmeda con 5 por ciento de CO2. La viabilidad celular se midió usando el kit de detección de viabilidad celular Ez-Cytox. Las células se incubaron en 96-placas de pocillos a una concentración de 2500 células por pocillo durante 24 h y se trataron con las concentraciones indicadas de los compuestos 1–3 durante 24 h. A continuación, se añadieron reactivos Ez-Cytox a cada pocillo. La densidad óptica a 450 nm se midió después de 1 h utilizando un lector de microplacas (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.) para estimar la viabilidad celular. En un experimento separado, las células RAW264.7 se incubaron en 96-placas de pocillos a una concentración de 30000 células por pocillo durante 24 h. Después de la privación de suero durante 12 horas, las células se pretrataron con los compuestos 1–3 durante 1 hora y luego se estimularon con 1 µg/mL de LPS durante 24 horas. La absorbancia de los medios de cultivo en una reacción de Griess se midió a 540 nm usando un lector de microplacas PowerWave XS para estimar el nivel de NO.

3.10. Medición del contenido de melanina

La línea celular de melanoma de ratón, B16F10, se adquirió de la American Type Culture Collection. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, y se incubaron a 37 ◦C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Las células B16F10 se incubaron en placas de cultivo de 6 cm a 250,000 células por pocillo en DMEM suplementado con FBS al 10 %, estreptomicina 100 µg/ml y penicilina 100 U/ml durante 24 h. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se estimularon con IBMX y se incubaron con diferentes concentraciones de los compuestos 1–3 o ácido kójico (control positivo) en medio RPMI sin rojo fenol complementado con 10 % de FBS, 100 unidades /mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina durante 24 h y 48 h. La absorbancia del medio de cultivo se midió a 405 nm usando un lector de microplacas PowerWave XS para estimar el contenido de melanina. Los resultados se expresan como veces de cambio en comparación con el control (células no estimuladas por IBMX).

3.11. Análisis estadístico

Todos los datos, incluida la viabilidad celular, el NO y las producciones de melanina, se presentaron como el valor promedio y la desviación estándar (DE). Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces. En este estudio, solo se incluyeron unas pocas repeticiones de cada experimento de celda, por lo que se adoptó el método de análisis no paramétrico para el análisis estadístico. Para el análisis estadístico de cada variable se utilizó la prueba de Kruskall-Wallis. Para todos los análisis se utilizó el paquete estadístico SPSS (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statistics versión 21, Boston, MA, EE. UU.). Se consideró significancia estadística a un valor de p inferior a 0.05.

4. Conclusiones

Nuestro informe proporciona un análisis químico de aislamientos microbianos de una termita que cultiva hongos. Se aislaron y caracterizaron estructuralmente tres nuevos tripéptidos cíclicos, natalenamidas A–C (1–3), a partir del caldo de cultivo de Actinomadura sp. RB99 usando un método de desreplicación basado en LC-UV/MS. Se evaluaron las actividades biológicas de todos los compuestos aislados usando ensayos basados ​​en células. Los compuestos 1 y 2 mostraron una citotoxicidad débil frente a las células HepG2 y HeLa/A549, respectivamente. Ninguno de los compuestos aislados mostró efectos inhibidores significativos sobre la producción de NO en células RAW264.7 estimuladas con LPS. El compuesto 3 exhibió efectos inhibidores significativos sobre la síntesis de melanina mediada por IBMX de una manera dependiente de la dosis. El efecto fue similar al del ácido kójico, que se utiliza como material cosmético con efectos blanqueadores de la piel.

Expresiones de gratitud:

Estamos profundamente agradecidos a Michael Thomas-Poulsen (Departamento de Biología, Universidad de Copenhague, Dinamarca) por apoyar nuestro trabajo de campo.

Conflictos de interés:

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Disponibilidad de muestras:

Las muestras de los compuestos no están disponibles de los autores.

For more information:1950477648nn@gmail.com