Abstracto

El interés de los consumidores por los productos de la industria cosmética con efectos aclaradores de la piel ha incrementado la demanda de preparados que reduzcan la melanogénesis. Se conocen varios fármacos antimelanogénicos por sus efectos secundarios, como dermatitis de contacto y alta toxicidad, y mala penetración en la piel. Una considerable investigación reciente se ha centrado en productos derivados de plantas como alternativas a los medicamentos quimioterapéuticos con menos consecuencias secundarias.

En el presente estudio, examinamos la acción antimelanogénica de las vesículas extracelulares (EV) extraídas del follaje y los tallos del patógeno Dendropanax. Trabajando con métodos espectrofotométricos y bioquímicos, encontramos que las vesículas extracelulares derivadas de hojas (LEV) y las vesículas extracelulares derivadas de tallo (SEV) redujeron el contenido de melanina y la actividad de tirosinasa (TYR) de manera dependiente de la concentración en una línea celular de melanoma de ratón B16BL6. El análisis microscópico electrónico demostró además que los LEV y los SEV inducían una disminución dependiente de la concentración en el contenido de melanina en las células de melanoma. En comparación con la arbutina como control positivo, los LEV y los SEV mostraron un efecto blanqueador más fuerte en las células de melanoma, y ​​el efecto blanqueador de los LEV fue más fuerte. En particular, ni los LEV ni los SEV indujeron una citotoxicidad significativa. También examinamos los efectos de los vehículos eléctricos derivados de plantas en la expresión de proteínas relacionadas con la tirosinasa (TRP) en células de melanoma. Los LEV inhibieron la expresión de genes y proteínas relacionados con la melanogénesis, incluidos el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), TYR, TRP-1 y TRP-2. En un modelo epidérmico humano, los LEV inhibieron la melanogénesis más fuertemente que la arbutina. En conjunto, nuestros datos sugieren que el lev de D. patógenos puede ser una nueva sustancia natural candidata para su uso como agente antimelanogénico en preparaciones farmacéuticas.

palabras clave:vehículos eléctricos derivados de plantas; LEV ySEV; antimelanogénico; TYRactividad; contenido de melanina yBeneficios del extracto de Cistanche

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Introducción

La melanina, una parte fundamental del sistema de pigmentación del cabello, los ojos y la piel humanos, es producida por los melanocitos a través de un procedimiento llamado melanogénesis. La acumulación aberrante de melanina puede provocar trastornos de la piel como pecas, pecas solares y melasma, y ​​también puede causar cáncer y vitíligo. Por lo tanto, regular la melanogénesis es una estrategia vital en el tratamiento de los trastornos hiperpigmentados. Por ejemplo, la hidroquinona, un compuesto de hidroxifenilo que interfiere con la actividad de TYR, se usa como agente blanqueador de la piel en la industria cosmética. Sin embargo, la hidroquinona puede causar efectos secundarios como dermatitis de contacto y enfermedad del pardeamiento exógeno. El ácido Va es otro agente sintético que inhibe la actividad de TYR, pero su uso se asocia con una alta frecuencia de edema o irritación.

Ha habido un interés creciente en identificar medicamentos alternativos de fuentes naturales contra la melanogénesis, dadas las limitaciones de los compuestos químicos existentes, lo que refleja el hecho de que los productos cosméticos elaborados a partir de plantas y hierbas tienden a ser más suaves, más biodegradables y muestran menor toxicidad que los sintéticos. compuestos. Se ha demostrado que los extractos de hojas de la enfermedad de Dendrobium inhiben la producción de melanina al interactuar directamente con la activación de TYR intracelular y la expresión de enzimas involucradas en la biosíntesis de melanina. De manera similar, el extracto de hoja de Croton officinalis suprimió el contenido de melanina y la actividad TYR celular al inhibir el factor de transcripción relacionado con la melanogénesis (MITF) y las enzimas melanogénicas. Además, las hojas de morera tuvieron un efecto inhibidor sobre la actividad TYR y la formación de melanina en las células melan-A. El ácido p-cumárico de las hojas de ginseng se identificó como el principal inhibidor de TYR.

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A pesar de que se ha utilizado una amplia gama de compuestos botánicos en formulaciones cosméticas medicinales, su baja solubilidad, baja afinidad por el objetivo y moderada acción aclarante de la piel han dificultado el progreso en la mejora de los efectos terapéuticos de los cosméticos botánicos. Esto ha motivado la búsqueda de técnicas nuevas y progresivas para mejorar la eficacia de los compuestos medicinales y bioactivos y mejorar su eficiencia de suministro a la piel. Por ejemplo, se han desarrollado con éxito una serie de tecnologías de nanoentrega, que incluyen nano-lovely para un cuidado eficaz de la piel, nanoquercetina para retrasar el daño celular causado por la radiación ultravioleta (UV), nanofullerenos para la regeneración del colágeno y la prevención del envejecimiento de la piel. , nano-luteolina para mantener la actividad antioxidante y nano-resveratrol para proteger la piel de la radiación UV.

En el presente estudio, nos concentramos en el papel de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de plantas. Estudios recientes han demostrado que los vehículos eléctricos derivados de plantas tienen una estructura similar a la de los exosomas aislados de mamíferos y actúan como mensajeros extracelulares que median en la comunicación intercelular. Además, estas vesículas son capaces de trasladar ARNm, microARN (miARN), lípidos bioactivos y proteínas a las células animales.

Mientras tanto, hemos estudiado el efecto inhibitorio de los vehículos eléctricos derivados de hojas y tallos de leguminosas enfermas sobre la melanogénesis. Caracterizamos el tamaño y las propiedades de las vesículas extracelulares derivadas de hojas (LEV) y las vesículas extracelulares derivadas de tallo (SEV) extraídas de hojas y tallos de leguminosas enfermas y demostramos que estas EV fueron absorbidas fácilmente por células de melanoma y no eran citotóxicas. Para demostrar los efectos antimelanogénicos de los LEV y los SUV, examinamos el contenido de melanina y la actividad de TYR en células de melanoma. Además, evaluamos el efecto de los vehículos eléctricos en el complejo proceso de síntesis de melanina al monitorear los cambios en los niveles de varias proteínas y enzimas.

La hormona estabilizadora de melanocitos alfa (-MSH) se une al receptor de melanocortina 1 (MC1R) en la superficie celular y activa la adenilato ciclasa, lo que lleva a un aumento de los niveles intracelulares de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). El AMPc está mediado por la proteína quinasa A dependiente de AMPc, lo que conduce a la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc (CREB). CREB activado induce MITF, que se expresa en los melanocitos y desempeña un papel clave en la diferenciación y el desarrollo de los melanocitos. -TRP1 es esencial para la correcta translocación de TYR a la síntesis de melanina y TRP2 juega un papel importante en la actividad catalítica de TRP en las primeras etapas de la síntesis de melanina. Estos tres interactúan en las células de melanoma (Fig. 1 complementaria).

Encontramos una expresión reducida de MITF en células de melanoma tratadas con LEV, seguida de una expresión reducida de TYR, TRP-1 y TRP-2, y confirmado por microscopía electrónica que la síntesis de melanina se redujo dentro de estas células en el nivel ultraestructural. Además, confirmamos el efecto antimelanogénico de los LEV utilizando un modelo epidérmico humano reconstruido. Para evaluar cuantitativamente el efecto inhibidor de los LEV en la síntesis de melanina celular, preparamos soluciones estándar de tejidos y medimos el contenido de melanina con un colorímetro. las manchas de melanina se redujeron en las secciones de tejido teñidas con Fontana-Masson. los LEV inhibieron la producción de melanina con más eficacia que el inhibidor de TYR, la arbutina, que se utilizó como control positivo.

En resumen, estos hallazgos indican que el uso de vehículos eléctricos derivados de sustancias naturales para el manejo de la hiperpigmentación es un enfoque futuro factible para la industria farmacéutica. Además, con las ventajas de tamaño pequeño, baja toxicidad, alta absorción y seguridad ambiental, se espera que los vehículos eléctricos derivados de plantas sean la próxima generación de sistemas de administración terapéutica para el tratamiento de otras enfermedades. En particular, los EV derivados de plantas tienen buenos efectos antimelanogénicos en el tejido de la piel humana reconstruida (similar a la epidermis humana), preparando el escenario para futuros ensayos clínicos.

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Materiales y métodos

1. Aislamiento de D. morbifera LEV y SUV

Se recolectaron hojas y tallos frescos de Poge Island, Guandao-gun y Jeollanam-do. Los EV se aislaron de 50 g de hojas y tallo, respectivamente, moliendo con un extractor y pasando el jugo resultante a través de papel de filtro y centrifugando a 10,000 × g durante 10 min. Los desechos grandes se eliminaron filtrando el sobrenadante a través de una membrana de 0,22 μm, seguido de una centrifugación con un filtro de centrífuga Amicon Ultra-4 PL 100 K (Merck Millipore. Darmstadt, Alemania) para concentrar los EV centrifugando las muestras a 5000 × g durante 10 min a 4 grados. Después de la centrifugación, la concentración de proteína de los EV se determinó utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bisquinolínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

2. Caracterización del tamaño de vehículos eléctricos aislados

El tamaño hidrodinámico de los vehículos eléctricos aislados se midió mediante dispersión de luz dinámica (DLS), una técnica utilizada para determinar la distribución del tamaño de partículas pequeñas en suspensión, utilizando un sistema Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Los vehículos eléctricos recogidos se colocaron en una celda de temperatura constante a 20 grados. La distribución del tamaño de partícula y el promedio z utilizados para determinar la distribución hidrodinámica del tamaño de partícula se determinaron midiendo la función de autocorrelación de la intensidad de dispersión. Los EV aislados se diluyeron con agua de burbujas sin vesículas y luego se sometieron a análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Nanosight; usando un láser de 488 nm a 25 grados).

3. Análisis de microscopía electrónica de transmisión de vehículos eléctricos

Se cargaron 5 μL de solución de muestra en una película de carbono recubierta de rejilla de cobre para el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Después de la adsorción de la muestra durante 1 minuto, las rejillas se lavaron con una gota de agua pura y luego se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 1 por ciento durante 1 minuto. El exceso de colorante se eliminó con papel de filtro y las rejillas se secaron al aire. Se tomaron imágenes de las muestras enfocadas entre 0.8 - 1.5 μm utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEM- 1400 Plus (JEOL Ltd., Tokio, Japón) equipado con una pistola Lab6 que funciona a 120 kV . Las imágenes se registraron con una cámara UltraScan OneView CMOS (Gatan, Pleasanton, CA, EE. UU.).

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4. preparación de liposomas

Las mezclas de liposomas se prepararon utilizando una proporción de 95:5 (mol/mol) de DMPC (1,2-estearoil-sn-glicerol-3-fosfocolina) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE. UU.) con DSPE-mPEG (1,2-estearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina-[metoxi(polietilenglicol)- 2000] (lípidos polares Avanti) para preparar las mezclas de liposomas como membranas lipídicas. El colorante fluorescente hidrofóbico 1,1-dioctadecil-3,3,3ʹ,3ʹ-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) se mezcló con vehículos eléctricos, 725,49 ug de DMPC, 151,64 ug de DSPE-PEG y 15 ug de DiI.Después de la evaporación del solvente orgánico, la membrana que contenía la mezcla de lípidos y DiI se hidrató con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).A continuación, se prepararon liposomas de 100 nm de tamaño usando una extrusora (Avanti Polar lípidos).

5. Ensayos de viabilidad y cultivos celulares

Se cultivaron células de melanoma B16BL6 en medio esencial mínimo alfa (alfa-MEM) que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, EE. UU.) y penicilina/estreptomicina al 1 por ciento (Lonza, Basilea, Suiza) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) en cultivo. Las células se incubaron a 37 grados en una atmósfera humidificada con 5 por ciento de CO2. Se inocularon 100 μl de células de melanoma B16BL6 en 96-placas de pocillos (5 × 104 células/pocillo) para ensayos de viabilidad celular. Después de la incubación durante 24 h, las células se trataron con LEV y SEV en concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL, respectivamente, durante 24 h. Las concentraciones de liposomas y arbutina fueron de 10 µg/mL y 70 µg/mL, respectivamente, para todos los experimentos. Posteriormente se añadieron 10 µL de reactivo EZ-Cytox (Daeil Lab Service, Seúl, Corea) a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 h. Luego, las placas se agitaron suavemente y luego se midió la absorbancia a 450 nm usando un marcador enzimático (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.).

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