Tulipósidos H–J y componentes bioactivos del bulbo de Amana Edulis
Mar 20, 2023
Abstracto:
Se obtuvieron por primera vez tres nuevos tulipanes H–J (1–3) y 11 compuestos conocidos a partir de extractos metanólicos de los bulbos de Amana edulis. Sus estructuras se elucidaron mediante datos espectroscópicos de RMN, MS e IR, rotación óptica y el método de Mosher. Las propiedades de melanogénesis de todos los aislados se evaluaron en células de melanoma B16. En consecuencia, el citrato de tributilo (9) tenía actividad anti-melanogénesis pero era citotóxico frente a B16. ( más )-ácido piroglutámico (4), ( más )-butil 5-oxopirrolidina-2-carboxilato (6), (–)-3-hidroxi-2-metilbutirolactona (10 ), y 5- (hidroximetil) furfural (12) aumentaron la producción de melanina y las actividades de tirosinasa. Esos componentes activos podrían estudiarse más a fondo como candidatos contra el melanoma y el vitíligo para enfermedades de la piel o el blanqueamiento/hipopigmentación del cabello.
En la investigación de blanqueamiento, encontramos que Cistanche también tiene un efecto blanqueador.
En primer lugar, Cistanche es rica en polisacáridos y flavonoides. Estos compuestos actúan como antioxidantes y pueden ayudar al cuerpo a eliminar los radicales libres, retrasando el envejecimiento de la piel y mejorando así la tez.
En segundo lugar, Cistanche también contiene una variedad de aminoácidos, minerales y vitaminas, que son muy beneficiosos para la reparación y regeneración de la piel. Cistanche puede promover el metabolismo de las células de la piel, mejorar la capacidad de autorreparación de la piel y restaurar la piel a un color saludable.
Finalmente, Cistanche también contiene algunos ácidos orgánicos y sustancias alcalinas, y estos ingredientes también tienen un cierto efecto sobre el acondicionamiento y el metabolismo de las cutículas de la piel. Estas sustancias pueden equilibrar eficazmente el valor del pH de la piel, mejorar el grosor del estrato córneo y hacer que la piel sea más translúcida y delicada.
1. Introducción
Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, sin. Tulipa edulis (Miq.) Baker pertenece a la familia de las liliáceas y es una planta medicinal popular utilizada para tratar enfermedades cancerosas [1,2]. Sin embargo, ha habido pocos estudios fitoquímicos y biológicos de esta especie reportados hasta la fecha.
Por ejemplo, los extractos de EtOH al 95 % y al 50 % podrían inducir la apoptosis en células de carcinoma gástrico humano (SGC7901) [1] y hepatoma (BEL7404, HepG2 y Huh7) [2], respectivamente. Los polisacáridos preparados a partir de A. edulis tienen propiedades antioxidantes, que incluyen DPPH, OH− y ABTS, además de actividades depuradoras [3–5]. En la investigación de nuevos agentes de productos naturales para los trastornos de la piel, encontramos que los extractos de MeOH de los bulbos de A. edulis muestran un potencial de regulación de la melanogénesis que aún no ha sido investigado. Cuando se expone a la radiación ultravioleta de la luz solar o a productos químicos nocivos y factores patógenos, la melanogénesis moderada puede proteger nuestra piel de la generación de especies reactivas de oxígeno en los queratinocitos y melanocitos [6]. La tirosinasa es una enzima importante en la melanogénesis que produce más melanina para que podamos defendernos contra las condiciones peligrosas antes mencionadas [7].
Por lo tanto, los componentes activos de A. edulis merecen autorización para futuras aplicaciones médicas. En esta investigación, se aislaron tres nuevos lados de tulipán H–J (1–3) y 11 compuestos conocidos (4–14) (Figura 1) de A. edulis y se identificaron estructuralmente mediante datos espectroscópicos de RMN, MS e IR, rotación óptica , o reacción del éster de Mosher. El compuesto 9 podría disminuir el contenido de melanina pero ser citotóxico para las células de melanoma B16. Los compuestos 4, 6, 10 y 12 habían aumentado la producción de melanina y las actividades de tirosinasa. En general, este trabajo demostró que A. edulis y sus componentes activos podrían ser nuevos agentes para enfermedades relacionadas con la melanina, como el melanoma y la hipopigmentación (vitíligo de la piel o blanqueamiento del cabello).
2. Resultados y Discusión
2.1. Elucidaciones de la estructura de los aislamientos 1–3
El extracto de MeOH (TEM) de los bulbos de A. edulis se dividió en fracciones solubles en EtOAc (TEE), solubles en n-BuOH (TEB) y solubles en HO (TEW) por separado. La fracción. la acción de los extractos de TEE y TEB proporcionó nuevos glucósidos isoprenoides 1-3 y compuestos conocidos 4-14 (Figura 1). Además, los principales componentes del extracto TEW eran carbohidratos.
El HRESIMS (espectrometría de masas de ionización por electropulverización de alta resolución) de 1 mostró un ion (M - H- en m/z 351,1652, lo que indica una fórmula molecular de CsH2gOg (calcd forC;5HoOg; 351,1655) y dos grados de insaturación. El espectro IR mostró absorciones para las funcionalidades hidroxilo (3376 cm-l) y carbonilo (1725 cm-l) Quince señales de carbono, incluidos dos metilos, cinco metilenos, siete metinos y un carbono cuaternario, se observaron en la RMN unidimensional (1D) espectros de 1 (Tabla 1). El carbono cuaternario se identificó como un carbono carbonilo basado en el cambio químico 6c 176,6. Los espectros de RMN 1D y HSOC (coherencia cuántica simple heteronuclear) mostraron un anomérico (0/8c: 4,27 (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4,9), cinco oximetolona (0h/8c: 3,21(t, J { {34}}.0 Hz)/75,1, 3,28 (superposición)/71,6, 3,28 (superposición)/78.0, 3,35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77,9 y 3,89 (td, I=7.0, 2,5 Hz)/73,6) y tres de oximetileno (6,/6c: 3,57 (dd, J {{64} }.5, 7.0 Hz)4.01 (dd, I {{70}}.5, 2.5 Hz)/73.1, 3.66 (dd, I { {78}}.0, 5.0 Hz), 3.85 (brd, I=12.0 Hz)/62.7 y 4.10 (2H, t, J=7.5 Hz)/65.5) señales. Las correlaciones HMBC (correlación de enlace múltiple heteronuclear) (Figura 2) del compuesto 1 en los protones metino H-2 (8 2.67, quint con C-1 (6 176. 6)/C-3 (6 73.6)/C-4 (6 73.1)/C-5 (6 13.9) , H-3 (6 3.89, td) con C-1/C-2(6 44.6)/C-4/C -5, H-1' (6 4.27, d) con C-4, y los protones de metilo H-5 (8 1.14 , d) withC-1/C-2/C-3 sugirió que los restos metilo e hidroxilo se colocaron en C-2 y C-3, respectivamente. Además, los protones de metileno en H,-1" (8 4.10, t) y H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) exhibieron 3 interacciones con C{{ 142}} y C-1' (8 104.9), respectivamente, en el espectro HMBC (Figura 2) que respaldaron las asignaciones del grupo n-butilo en C-1 y una beta -glucosa (H-1', 8 4.27, d, J=8.0 Hz) en C-4 8].
La Figura 2 muestra las correlaciones clave de COSY y HMBC observadas para 1. Las configuraciones relativas en C-2 y C-3 (3-resto hidroxi-2-metilo) de 1 podrían determinarse anti -forma por el valor 3 JH2-H3 de 7.0 Hz (antiforma: 7.0 Hz; forma sintética: 4.0 Hz) [ 9]. Para determinar la configuración absoluta, el compuesto 1 se trató por separado con cloruro de (R)- y (S)- -metoxi- -(trifluorometil)-fenilacetilo [(R)- y (S)-MTPA- Cl] en presencia de piridina-d5 para obtener los ésteres (S)- y (R)-MTPA (1a y 1b), respectivamente. Los ésteres de MTPA se generaron con éxito en C-3 y C-20/C-30/C-40 , como se aclara a partir de 1H NMR y 1H-1H COSY espectros (1a, H-3, δ 5,82, m; H-20 , δ 5,70, t, J=9,5 Hz; H-30 , δ 4,39, t, J=9.5 Hz; H-40 , δ 5.76, t, J=9.5 Hz; 1b, H-3, δ 5.81, m; H{{64 }}, δ 5,56, t, J=9, 5 Hz, H-30, δ 4,12, t, J=9, 5 Hz, H-40, δ 5,66, t, J=9.5 Hz). Las diferencias entre los desplazamientos químicos de RMN de 1H para 1a y 1b (los valores de ∆ que se muestran en la Figura 3) dieron lugar a las asignaciones de configuraciones S y R en C-3 y C-2, respectivamente. En consecuencia, el compuesto 1 se dilucidó como butil 4- -D-glucopiranosa-(S)-3-hidroxi-(R)-2-metilbutanoato y se denominó tulipán lado H.
El compuesto 2, lado tulipán I, dio la fórmula molecular, C15H28O8, establecida por HRESIMS (m/z 359,1686 [M más Na] más, calculado para 359,1682). Los espectros de RMN 1D de 2 también fueron similares a los de 1, excepto por el hecho de que los cambios químicos de la señal de metileno δH 1.65 (sext, J=7.0 Hz) y 1.96 (sext, J=7.0 Hz)/δC 34,6 en lugar de un metino en C-3 de 1 (Tabla 1). Según los datos de COSY y HMBC (Figura 2), se postuló que el compuesto 2 estaba compuesto por un isoprenoide, una glucosa y los grupos n-butilo también. Las correlaciones HMBC 3 J de H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) con C-1 (δ 178.5) y H-10 (δ 4.19, d, J=8.0 Hz/δC 104.4) con C-4 (δ 68.4) sugirieron que el grupo n-butilo y una -glucosa el resto [8] se conectaron en C-1 y C-4, respectivamente (Figura 2). Las correlaciones clave de HMBC y COSY se muestran en la Figura 2. La configuración R de H3-5 en C-2 de 2 se determinó mediante hidrólisis ácida de 2 para ofrecer el compuesto de tulipalina correspondiente, 3-metildihidrofurano-2(3H)-ona (Figura S28) [8] con una rotación óptica positiva ([ ] 23 D más 18,7, CH2Cl2) (R: [ ] 25 D más 14,7, CHCl3) [10]. La estructura del compuesto 2 se identificó como butil 4- -D-glucopiranosa-(R){{ 81}}butanoato de metilo.
La fórmula molecular de 3 se dedujo como C11H20O8 debido a la aparición de un ion [M más Na] más en m/z 303,1049 (calculado para 303,1050) en el HRESIMS. Once señales de carbono, incluido un metilo (δ 17,6), tres metilenos (δ 34,7, 62,8 y 68,6), seis metinos (δ 37,6, 71,6, 75,1, 77,9, 78,0 y 104,4) y un carbono cuaternario (δ 180,6) , se observaron en los espectros de RMN 1D de 3 (Tabla 1). El carbono cuaternario se identificó como un carbono carbonilo basado en el desplazamiento químico del carbono en δ 180,6. Además, el compuesto 3 mostró datos espectroscópicos similares a los del 2, excepto por las señales de n-butilo. En el espectro HMBC (Figura S15), el protón anomérico en δ 4.23 (d, J=8.0 Hz) exhibió una interacción de 3 J con C-4 (δ 68.6) que conduce a la -glucosa ubicada en C-4. Las conexiones clave de HMBC y COSY se muestran en la Figura 2. El compuesto 3 no se aisló en una cantidad suficiente para determinar la configuración absoluta en C-2. Finalmente, el lado del tulipán J (3), 4- -D-glucopiranosa-(R)-2-ácido metilbutanoico, se identificó debido a las elucidaciones estructurales mencionadas anteriormente de 1 y 2 en este estudio.
Los compuestos 1–3 son tulipanes, un tipo de producto especializado que consiste en 4-hidroxi2-ácido butanoico de metileno (HMBA) y/o (3S)-3,4-dihidroxi -2-grupos de ácido metileno butanoico (DHMBA) acilados en las posiciones C-1 y/o C-6 de una -D-glucosa (Glc) que se encuentra principalmente en el género Tulipa [8,11] . Hasta ahora, los análogos del lado del tulipán, incluidos el 1-lado del tulipán A, el 6-lado del tulipán A, el 1-lado del tulipán B, el 6-lado del tulipán B y los lados del tulipán D-G , se han aislado de Tulipa [8, 11]. Sin embargo, la estructura del lado C del tulipán no se ha informado y podría faltar en la literatura anterior [11]. Las tulipalinas, como la tulipalina A y la (-)-tulipalina B, son las porciones de aglicona de los lados de los tulipanes, que se convierten en lactonas espontáneamente después de liberar los grupos HMBA y/o DHMBA por las enzimas de conversión del lado de los tulipanes [8,11]. En este estudio, los compuestos 1–3 denominados lados de tulipán H–J pertenecen a lados de tulipán, pero sus dobles enlaces en C-2 se redujeron y los grupos -D-glucosa se unieron a C-4 (oximetileno ), en lugar de C-1 (funcionalidad O-acyl) en HMBA o DHMBA (Figura 1). Además, el compuesto 10 (2S,3S) es tulipalina pero no se pudo metabolizar a partir del 1 (2R,3S) debido a las diferentes configuraciones en C-2. Las posibles biosíntesis de los lados del tulipán 1–3 se muestran en la Figura S29 [8,11].
Además, se identificaron 11 compuestos conocidos, incluidos tres análogos del ácido piroglutámico (4–6), tres derivados del ácido cítrico (7–9), dos furanona (10–11), un furano (12) y dos esteroides (13–14). aislado de A. edulis por primera vez. Los compuestos 1–9 y 10–14 se obtuvieron de las fracciones crudas de TEB y TEE, respectivamente. Se identificaron como ( más )-ácido piroglutámico (4) [12], ( más )-5-oxopirrolidina-2-carboxilato de metilo (5) [12], ( más )-butilo {{23 }}oxopirrolidina-2-carboxilato (6) [12], 1-citrato de butilo (7) [13], 1,10 -dibutil5-citrato de metilo (8) [ 13], citrato de tributilo (9) [13], (–)-3-hidroxi-2-metil butirolactona (10) [14–16], (–)-metil 3-hidroxi{{ 44}}oxotetrahidrofurano-3-carboxilato (11) [17], 5-(hidroximetil)furfural (12) [18], sitosterol (13) [19] y sitosterol-3- -D -glucosa (14) [20] a partir de los datos espectroscópicos y en comparación con la literatura.
2.2. Componentes químicos Elucidación de TEW
Los espectros de RMN de 1H y 13C de TEW, una fracción cruda soluble en agua del extracto de TEM, se mostraron muy similares a los de los carbohidratos (Figuras S16 y S17). Se ha informado que los polisacáridos preparados a partir de esta especie poseen ramnosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, glucosa y fructosa después del análisis de monosacáridos [3,8]. Los datos espectroscópicos de RMN y el factor de retención de TLC (cromatografía de capa fina) de TEW en comparación con los de los estándares de azúcar (Figuras S18–S23) sugirieron que la D-glucosa y la D-fructosa eran los componentes principales en los extractos de TEW.
2.3. Efectos de extractos y aislados sobre la melanogénesis
El extracto de MeOH (TEM) de esta especie se separó en fracciones crudas de TEE, TEB y TEW, y se evaluó la citotoxicidad y los efectos de melanogénesis de los cuatro extractos mencionados anteriormente en células de melanoma B16 en concentraciones de 12,5 a 200 µg/mL (Figura S24) . TEE mostró una citotoxicidad obvia hacia B16 a 200 µg/mL y TEB así como TEW tuvieron actividades citotóxicas en concentraciones de 12.5 a 200 µg/mL (Figura S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). En el bioensayo, se usó la hormona estimulante de melanocitos (-MSH) para activar las células B16 para sintetizar más melanina, y TEM pudo estimular moderadamente la melanogénesis (Figura S24A-2).
La mayoría de todos los aislamientos (Figura 1), excluyendo 13 y 14, se analizaron adicionalmente para la regulación de los efectos de la melanogénesis en concentraciones de 10 a 40 µM, con arbutina utilizada como control positivo (Figura 4). Como se muestra en la Figura 4, el compuesto 9 inhibió obviamente y de forma dependiente de la dosis la producción de melanina que resultó de la citotoxicidad hacia las células B16 con un valor IC50 (la mitad de la concentración inhibitoria máxima) de 81,9 µM (Figura S25). Los aislamientos 4, 6, 10 y 12 aumentaron el contenido de melanina de forma dependiente de la dosis hasta los porcentajes máximos de 11,9 %, 29,8 %, 27,2 % y 17,6 %, respectivamente, a 40 µM sin toxicidad celular. La tirosinasa juega un papel clave en los dos primeros pasos de la melanogénesis [6]; por lo tanto, se evaluaron adicionalmente los efectos de los compuestos 4, 6, 10 y 12 sobre la tirosinasa intracelular. -MSH aumentó la actividad de la tirosinasa hasta un 254,3–305,5 por ciento en comparación con el grupo de control (100 por ciento) (Figura 5 y Tabla S1).
En consecuencia, 4 (14,1–21,9 %), 6 (15,8–21,9 %), 10 (8,5–13,1 %) y 12 (7,5–11,8 %) aumentaron moderadamente la actividad de la enzima tirosinasa de forma dependiente de la dosis. en concentraciones de 10 a 40 µM, en comparación con el grupo -MSH (Figura 5 y Tabla S1). En la Figura S26 se muestra un gráfico de correlación entre los contenidos de melanina celular y los efectos sobre la tirosinasa de los compuestos 4, 6, 10 y 12. Además, para confirmar los efectos inductores de melanogénesis de 4, 6, 10 y 12, se añadió cada compuesto en células B16 sin -MSH cotratado que se usó como control positivo en este ensayo (Figura S27). En consecuencia, los individuos 4, 6, 10 y 12 no aumentaron la producción de melanina por sí solos (Figura S27) de forma similar a los que se muestran en la Figura 4. Se sugirió que los cuatro compuestos mencionados anteriormente simplemente podrían mejorar los efectos de melanogénesis de -MSH. En consecuencia, otras vías de señalización en la melanogénesis, como la proteína relacionada con tirosinasa-1 (TRP-1), TRP-2, factor de transcripción asociado a microftalmía, receptor de melanocortina 1, monofosfato de adenosina cíclico, proteína cinasa A, proteína de unión al elemento cAMPresponse, cinasas N-terminales c-Jun, cinasa regulada por señales extracelulares, p38 y fosfoinositida 3-cinasa/proteína cinasa B [7,21], deben analizarse y confirmarse esos componentes activos.
3. Materiales y Métodos
3.1. Procedimientos Experimentales Generales
Los espectros de RMN se midieron en un instrumento Bruker Avance III de 500 MHz (BrukerBillerica, América) para 1H y 125 MHz para 13C-NMR. Los valores de desplazamiento químico (0) estaban en ppm, y las constantes de acoplamiento () estaban en Hz con CD; Se utilizaron como disolventes OD, CDCl y/o D, O. Las rotaciones ópticas se obtuvieron en un polarímetro JASCO-P-2000 (JASCO, TokyoJapan) (longitud de celda 10 mm). Los espectros IR se registraron en un espectrómetro PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). La espectrometría de masas de ionización por electropulverización ESIMS de baja y alta resolución) se midieron en un espectrómetro de masas de trampa de ultra alta capacidad Bruker Daltonics EsquireHCT y un espectrómetro de masas Orbitrap (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific), respectivamente. La TLC se realizó en placas recubiertas con Kieselgel60 F254 (0,25 mm; Merck) y/o RP-18 F254S (0,25 mm; Merck) y luego se tiñeron rociándolas con sulfúrico al 5 por ciento (o/u). ácido en una solución de MeOH y calentamiento en una placa caliente. Gel de sílice (Silicycle: 70 230 y malla 230 400), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE episodio 0 pe abierto con Bre aplicado para SupelcoTM, Bellefonte) y MCI CHP20P (SupelcoTcromatografía en columna. Una bomba Shimadzu LC-20AT y un detector de índice de refracción Shimadzu RID-10A (Shimadzu Inc, Kyoto, Japón), junto con un Cosmosil 5C18-MS-II ( Se utilizaron columnas de 250 x 10 mm de d.i., 5 um) a un caudal de 2,0 ml/min para HPLC Se utilizaron reactivos de azúcar, incluidos D-glucosa (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, Francia) y D-fructosa (TCI, Tokyoapan). Se utiliza para el análisis de fracción cruda soluble en agua (TEW).
3.2. Material vegetal
Los bulbos secos de A. edulis (anteriormente T. edulis) se compraron en una farmacia de medicina tradicional china en Taichung, Taiwán, en septiembre de 2018 y fueron identificados por el autor, el Prof. Chang. Se depositó un espécimen de prueba (TE201809) en el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicina China, CMUH Taiwán.
3.3. Extracción y Aislamiento
Los bulbos de A. edulis (5,0 kg) se extrajeron ocho veces con MeOH (8,0 L cada una) a temperatura ambiente para obtener un extracto crudo. El extracto de MeOH (TEM, 525,0 g) se repartió tres veces entre acetato de etilo (EtOAc) y H2O (1500:1500, v/v) para dar un EtOAc -fracción soluble (TEE, 45,0 g) y una fase acuosa, que se repartió adicionalmente con n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3), y luego se separó en n-BuOH soluble (TEB, 53,6 g ) y fracciones solubles en H2O (TEW, 410,0 g).
El TEE se sometió a cromatografía en columna abierta en gel de sílice ({{0}}.063–0.200 mm, columna: 7 × 26 cm, diámetro × longitud), usando gradientes de hexano–EtOAc–MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) y dio 14 subfracciones (TEE1–TEE14). El precipitado 14 (249,0 mg; rendimiento de aislamiento: 0,{{100}}0498 por ciento) obtenido de la subfracción TEE12 (2,2 g) se filtró y se lavó con MeOH. TEE9 (3,6 g) se fraccionó en siete subfracciones (TEE9-1 a 9-7) mediante gel de sílice (columna: 5 × 24 cm; CH2Cl2–MeOH, 7:1; 1:1; 0:1 , v/v), con la subfracción TEE9-4 (1,1 g), y luego se sometió a cromatografía en columna Sephadex LH-20 (columna: 5 × 54 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1 a 0: 1, v/v), para dar siete subfracciones (TEE9-4-1 a 9-4-7). Se combinaron TEE9- 4-5 y TEE9-4-6 (total 551,7 mg) y se purificaron repetidamente mediante RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55; 20:80, v/v) para dar 12 (21,0 mg ; tR=13 min; rendimiento de aislamiento: 0,00042 por ciento) y un licor madre (131,2 mg), que se sometió además a RP-HPLC (MeOH–H2O; 10:90, v/v) para dar los compuestos 10 ( 35,5 mg; tR=13 min; rendimiento de aislamiento: 0,00071 por ciento) y 11 (1,2 mg; tR=15 min; rendimiento de aislamiento: 0,000024 por ciento). La fracción TEE6 (2,7 g) se aisló mediante Sephadex LH-20 (columna: 2,5 × 45 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1; 0:1, v/v) para obtener 13 (6,8 mg; rendimiento del aislamiento: 0,000136 por ciento).
El TEB se cromatografió sobre una columna Diaion HP{{0}} (6 × 60 cm; H2O–MeOH–acetona, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} }0}}:0:100, v/v/v) para dar seis subfracciones (TEB1–TEB6). La subfracción TEB5 (502,0 mg) se purificó mediante RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, v/v) para obtener los compuestos 8 (9,3 mg; tR {{34} } min; rendimiento de aislamiento: 0.000186 por ciento) y 9 (144,2 mg; tR {{4{{2{{2{{218} }9}}3}}}} min; rendimiento de aislamiento: 0,002884 por ciento). La fracción TEB3 (5,5 g) se sometió a cromatografía RP-18 (columna: 7 × 25 cm; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, v/v), y la subfracción TEB3-6 ( 1,0 g) se aisló adicionalmente mediante Sephadex LH-20 (columna: 5 × 54 cm; MeOH) para obtener siete subfracciones (TEB3-6-1 a 3-6-7). TEB3-6-4 (377,1 mg) se separó mediante cromatografía en gel MCI (columna: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) para dar siete subfracciones (TEB3-6-4-1 a 3-6-4-7). TEB3-6-4-4 (38,1 mg) se purificó mediante RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55 en ácido fórmico al 0,1 %, v/v) para producir 1 puro (12,2 mg; tR=17 min; rendimiento de aislamiento: 0,000244 por ciento). Además, se realizó TEB3-6-4-6 (31,0 mg) con RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 en ácido fórmico al 0,1 %, v/v) para producir 6 (7,1 mg; tR=28 min ; rendimiento de aislamiento: 0,000142 por ciento). TEB3-6-5 (410,7 mg) se aisló mediante cromatografía en gel MCI (columna: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, v/v) para dar ocho subfracciones (TEB3-6-5-1 a 3-6-5-8). TEB3-6-5-3 (75,1 mg) se purificó mediante cromatografía en gel MCI (columna: 1 × 20 cm; H2O-MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, v/v) para producir los compuestos 4 (59,3 mg; rendimiento de aislamiento: 0,001186 por ciento) y 5 (10,2 mg; rendimiento de aislamiento: 0,000204 por ciento). La subfracción TEB3-6-5-4 (97,0 mg) se purificó mediante RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 en ácido fórmico al 0,1 %, v/v) para obtener 7 (46,4 mg; tR=18 min; rendimiento de aislamiento: 0,000928 por ciento). TEB3-10 (925,4 mg) se cromatografió sobre una cromatografía en gel MCI (columna: 2,5 × 28 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30 :70; 10:90; 0:100, v/v) para dar ocho subfracciones (TEB3-10-1 a 3-10-8) y 2 puro (393,4 mg; rendimiento de aislamiento: 0,007868 por ciento). El compuesto 3 (6,3 mg; tR=8 min; rendimiento de aislamiento: 0,000126 por ciento) se obtuvo a partir de TEB3-10-2 (20,9 mg) mediante purificación por RP-HPLC (MeOH–H2O, 30:70 en fórmico al 0,1 por ciento). ácido, v/v).
3.3.1. Tulipósido H (1)
[ ] 23D-23,1 (c0,12, MeOH); IR (puro) νmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 1075, 1041 (C–O– C), 926, 900, 632, 521 cm−1; datos espectroscópicos de RMN de 1H y 13C, véase la Tabla 1; HRESIMS m/z 351,1652 [M − H]− (calculado para C15H27O9, 351,1655).
3.3.2. Tulipósido I (2)
[ ] 23D-25,8 (c0,2, MeOH); IR (puro) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 1077, 1036 (C–O– C), 897, 736, 625, 517 cm−1; datos espectroscópicos de RMN de 1H y 13C, véase la Tabla 1; HRESIMS m/z 359,1686 [M más Na] más (calcd para C15H28O8Na, 359,1682).
3.3.3. Tulipósido J (3)
[ ] 23 D más 9.0 (c 0.1, MeOH); IR (puro) νmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 1182, 1120 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm−1; datos espectroscópicos de RMN de 1H y 13C, véase la Tabla 1; HRESIMS m/z 303,1049 [M más Na] más (calcd para C11H20O8Na, 303,1050).
3.4. (R)- y (S)-MTPA Derivados de 1
La preparación del derivado de éster de (S)-MTPA de 1 se llevó a cabo mediante un conveniente procedimiento de éster de Mosher [22,23]. El compuesto 1 (3,4 mg, 0,01 mmol) se transfirió a un tubo NMR limpio y luego se secó completamente al vacío antes de llenarlo con nitrógeno. Además, C5D5N ({{20}}.5 mL) y (R)-(-)- -metoxi- -(trifluorometil)-fenil-acetil cloruro (cloruro de MTPA, 12.2 mg, 0,05 mmol) se añadieron inmediatamente al tubo de RMN sellado que se agitó con cuidado para mezclar la muestra y el cloruro de MTPA. Se registraron los espectros 1H RMN y 1H-1H COSY de la mezcla después de reaccionar durante 24 ha temperatura ambiente. El éster de (R)-MTPA de 1 también se preparó de manera similar mediante el proceso mencionado anteriormente. Compuesto 1: RMN 1H (C5D5N, 500 MHz) δ 0,78 (H-400, t), 1,26 (H-300, sexto), 1,28 (H3-5, d), 1,52 ( H-200, quintil), 3,08 (H-2, quintil), 3,95 (H-50, m), 4,03 (H-4a, dd), 4,05 (H -20, superposición), 4,15 (H-100, t), 4,23 (H-30, superposición), 4,23 (H-40, superposición), 4,36 (H{{ 68}}a, dd), 4,39 (H-3, superposición), 4,43 (H-4b, dd), 4,53 (H-60b, d) y 4,95 (H -10, d).
3.4.1. (S)-MTPA Éster de 1 (1a)
RMN 1H (C5D5N, 500 MHz) δ 0,77 (H-400, t), 1,17 (H-300, sexto), 1,21 (H3-5, d) , 1,37 (H-200, quintil), 3,18 (H-2, quintil), 3,92 (H-100, t), 3,97 (H-4a, dd), 4,33 (H-50 , m), 4,39 (H-30 , t), 4,49 (H-4b, brd), 4,64 (H-60a, dd), 4,96 (H-10 , d), 5,05 (H-60b, d), 5,70 (H-20 , t), 5,76 (H-40 , t) y 5,82 (H-3, m).
3.4.2. (R)-MTPA Éster de 1 (1b)
RMN 1H (C5D5N, 500 MHz) δ 0,79 (H-400, t), 1,26 (H-300, sexta), 1,30 (H3-5, d) , 1,50 (H-200, quintil), 3,33 (H-2, quintil), 3,60 (H-50 , m), 3,94 (H-4a, dd), 4,11 (H-100, t), 4,12 (H-30 , t), 4,13 (H-60a, dd), 4,50 (H-4b, brd), 4,70 (H-10 , d), 4,85 (H-60b, d), 5,56 (H-20 , t), 5,66 (H-40 , t) y 5,81 (H-3, metro).
3.5. Hidrólisis ácida de tulipósido I (2)
El aislado 2 (78,6 mg) se hidrolizó en HCl 1 M (1,5 ml) a 100 ◦C durante 2 h [8]. Después de enfriar, la mezcla de reacción se extrajo con CH2Cl2 (2,0 ml × 3) para ofrecer el análogo de tulipalina, 3-metildihidrofurano-2(3H)-ona (11,1 mg). [ ] 23 D más 18,7 (c 1,1, CH2Cl2); RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 1,30 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,94 (m), 2,45 (m), 2,61 (m), 4,20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 Hz), 4.33 (ddd, J=8.8, 8.8, 2.8 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 15,2, 30,7, 34,1, 66,2, 180,1 (Figura S28); ESIMS m/z 101.06 [M más H] más .
3.6. Cultivo de células
Las células de melanoma murino B16 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; GIBCO Invitrogen corporation, Nueva York, NY, EE. ◦C en una incubadora de CO2 al 5 por ciento.
3.7. Medición de la viabilidad celular B16
La citotoxicidad de las células B16 para los compuestos de prueba se midió mediante MTT con un protocolo descrito previamente con ligeras modificaciones [6]. Las células se sembraron en 96-placas de pocillos (1 × 103 células/pocillo) y se cultivaron durante 24 h antes de tratarlas con compuestos durante otras 72 h. Posteriormente, se retiró el medio, se añadieron a cada pocillo 100 µL de reactivo MTT (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) (a la concentración final de 0,5 mg/mL) y luego se incubó a 37 ◦C durante 1 h. El cristal de formazán se disolvió en 100 µl de DMSO y la densidad óptica se midió usando un lector de microplacas (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania) a 570 nm.
3.8. Medición del contenido de melanina en células B16
El contenido de melanina en las células B16 se analizó de acuerdo con un método descrito previamente con ligeras modificaciones [6]. Las células se sembraron a una densidad de 5 × 103 células/pocillo en 24-placas de pocillos durante 24 h. El medio se reemplazó por 500 µL de medio de cultivo fresco que contenía 0,5 µM -MSH con o sin compuestos durante 72 h. Se usó arbutina (1 mM) como control positivo. Posteriormente, se retiró el medio y se lavó dos veces con PBS (pH 6,8). Las células se recogieron con NaOH (200 µL, 2 N) y luego se calentaron a 85 ◦C durante 30 min. Después de enfriar a temperatura ambiente y centrifugar, se midió la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplacas.
3.9. Actividad de tirosinasa intracelular
El ensayo de actividad de tirosinasa intracelular se realizó mediante un método ligeramente modificado, que se informó anteriormente [6]. Las células se sembraron en 24-placas de pocillos a una densidad de 5 × 103 células/pocillo durante 24 h. Las células se trataron en DMEM que contenía 0,5 µM -MSH con o sin compuestos durante 72 h. Después de retirar el medio, las células se lavaron dos veces con PBS frío (pH 6,8). Las células se lisaron con 100 µL de tampón de lisis (1 por ciento de tritón X-100 en PBS) y se congelaron a -80 ◦C durante 15 min.
A continuación, los lisados celulares se centrifugaron a 13.200 × g a 4 ◦C durante 30 min para obtener el sobrenadante. El contenido de proteína total del sobrenadante se cuantificó mediante el ensayo de proteína BCA. A continuación, cada lisado cuantificado (30 µg/90 µL) se mezcló con 10 µL de L-DOPA (15 mM) en una placa 96-bien y luego se incubó a 37 ◦C durante 1 h y se midió la absorbancia. a 405 nm utilizando un lector de microplacas.
4. Conclusiones
En general, se aislaron de A. edulis 14 compuestos puros, incluidos tres nuevos glucósidos isoprenoides y lados de tulipán H–J (1–3). El derivado del ácido cítrico 9, el citrato de tributilo, tuvo una actividad antimelanogénica significativa, pero mostró citotoxicidad hacia las células de melanoma B16 que podrían investigarse más a fondo para obtener medicamentos contra el melanoma. Mientras que los análogos del ácido piroglutámico 4 y 6, la furanona 10 y el furano 12 aumentaron el contenido de melanina de forma dependiente de la dosis y activaron la tirosinasa, lo que podría estudiarse más a fondo para la enfermedad de la piel por vitíligo o los agentes anti-blanqueamiento y anti-hipopigmentación para el cabello. Sin embargo, es necesario investigar con más detalle los mecanismos in vitro y/o los estudios in vivo para verificar la eficacia de los componentes activos.
Materiales complementarios:
Los siguientes están disponibles en línea, Figuras S1–S5: datos espectrales de RMN del compuesto 1, Figuras S6–S10: datos espectrales de RMN del compuesto 2, Figuras S11–S15: datos espectrales de RMN del compuesto 3, Figuras S16–S22: datos espectrales de RMN de TEW, Figura S23: Análisis TLC de TEW, Figura S24: Citotoxicidad y regulación de los efectos de la melanogénesis de TEM, TEE, TEB y TEW, Figura S25: Datos de citotoxicidad de los compuestos 1–12, Figura S26: Un gráfico de correlación entre el contenido de melanina celular y los efectos sobre la tirosinasa de los compuestos 4, 6, 10 y 12, Figura S27: Efectos de la melanogénesis de los compuestos 4, 6, 10 y 12 solos sin -MSH, Figura S28: Datos de rotación óptica y espectral de RMN del producto obtenido de la hidrólisis ácida del compuesto 2, Figura S29: Posible biosíntesis de los compuestos 1−3, Tabla S1: Efectos de la actividad tirosinasa de los compuestos 4, 6, 10 y 12.
Contribuciones de autor:
Conceptualización, C.-LL; identificación de material vegetal, Y.-SC; conducta de aislamiento y purificación, C.-LL y Z.-AG; realización de los bioensayos, Y.-LJ; todos los análisis espectrales y determinación de estructuras, C.-LL y C.-JC; redacción del borrador original preparación, C.-LL Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.
Fondos:
Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 108-2320-B039-035-) y la Universidad Médica de China (CMU108-MF-84), Taiwán. El APC fue financiado por el "Centro de Investigación de Medicina China, Universidad Médica de China" del Programa del Centro de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Sprout de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE) en Taiwán (CMRC-CHM{{5} }).
Declaración de la Junta de Revisión Institucional:
No aplica.
Declaración de consentimiento informado:
No aplica.
Declaración de disponibilidad de datos:
No aplica.
Expresiones de gratitud:
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 108-2320-B-039-035-) y la Universidad Médica de China (CMU108-MF-84), Taiwán, así como el "Centro de Investigación de Medicina China, Universidad Médica de China" del Programa del Centro de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Sprout de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE) en Taiwán (CMRC-CHM-1) otorgado a C .-LL
Conflictos de interés:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Disponibilidad de muestras:
Las muestras de los compuestos 1 a 14 están disponibles a través de los autores.
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3 Centro de Investigación de Medicina China, Universidad Médica de China, Taichung 40402, Taiwán.
4 Departamento de Ciencias Farmacéuticas Chinas y Recursos de Medicina China, Universidad Médica de China, Taichung 40402, Taiwán.
5 Instituto de Graduados de Medicina Integrada, Universidad Médica de China, Taichung 40402, Taiwán.
6 Laboratorio central de proteómica, Departamento de Investigación Médica, Hospital Universitario Médico de China, Taichung 40402, Taiwán.
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