Efecto neuroprotector del extracto de Bu-Shen-Huo-Xue contra la apoptosis inducida por glucosa alta en células PC12

Para más información:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Estudio de Investigación de Integración de la Medicina Tradicional y Occidental, Primer Hospital, Universidad de Pekín, Pekín, China.

2Laboratorio Estatal Clave de Medicamentos Naturales y Biomiméticos, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Pekín, Pekín, China.

Reflejos

La neurotoxicidad inducida por glucosa alta (HG) está implicada en la patología dediabéticoencefalopatía (DE). En nuestro estudio, el extracto de Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), una fórmula poliherbal, exhibeneuroprotectorla actividad en las células PC12 inducidas por HG y los posibles mecanismos pueden estar asociados con la supresión de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como con las vías de señalización de caspasa y JNK/p38 MAPK mediadas por mitocondrias. Este estudio proporciona un agente prometedor para el tratamiento de DE en aplicaciones clínicas.

Haga clic para obtener beneficios del extracto de cistanche y cistanche para el riñón

Cistanchees una conocida hierba tónica que puede nutrir y proteger elriñones. En la teoría de la medicina tradicional china,Cistanchees la mejor hierba parariñones.Cistanchees rico en echinacoside, acteoside y flavonoides. Estos ingredientes efectivos enCistanchepuede reducirriñónapoptosis celular y aumentoriñónproliferación celular. Por lo tanto,Cistanchees unsuplemento renal natural.

Resumen

Objetivo: Investigar el efecto neuroprotector del extracto de Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), una fórmula poliherbal, contra la neurotoxicidad inducida por glucosa alta (HG) en células PC12. Métodos: ensayo de viabilidad celular, ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH), detección de especies reactivas de oxígeno (ROS), Hoechst 33258, tinción doble con naranja de acridina (AO)/bromuro de etidio (EB) y ensayo de potencial de membrana mitocondrial (MMP). Además, Bax, Bcl-2, caspasa-3, caspasa escindida-3, PARP, PARP escindida, citocromo c y proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) se detectaron mediante western blot. Resultados: el extracto de BSHX aumentó la viabilidad celular y disminuyó la fuga de LDH de manera dependiente de la concentración en células PC12 inducidas por HG. Además, el extracto de BSHX disminuyó el nivel de ROS intracelular, aumentó el potencial de la membrana mitocondrial, reguló las expresiones de Bax y Bcl-2 e inhibió la liberación de citocromo c de las mitocondrias. Además, el extracto de BSHX atenuó la activación de caspasa-3 y PARP e inhibió las fosforilaciones de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y p38 MAPK. Conclusión: el extracto de BSHX exhibió un efecto neuroprotector significativo sobre la apoptosis inducida por HG en células PC12. Este efecto puede estar asociado con la supresión de la generación de ROS, así como con las vías de señalización de caspasa mediada por mitocondrias y JNK/p38 MAPK.

Palabras clave:encefalopatía diabética, medicina tradicional china, extracto de Bu-Shen-Huo-Xue,neuroprotector, glucosa alta

Abreviatura: AO: naranja de acridina; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Encefalopatía Diabética; DM: Diabetes Mellitus; DMSO: sulfóxido de dimetilo; EB: bromuro de etidio; ERK: Proteína Quinasa Regulada Extracelularmente; HG: glucosa alta; JNK: cinasa N-terminal c-Jun; LDH: Lactato Deshidrogenasa; MAPK: proteínas quinasas activadas por mitógenos; MWP: Prescripción de Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il] 2, bromuro de 5-difeniltetrazolio; PBS: tampón de fosfato salino; PBST: solución salina tamponada con fosfato, 0,1 por ciento de Tween 20; ROS: especies reactivas de oxígeno; DM2: Diabetes Mellitus Tipo 2; MTC: Medicinas Tradicionales Chinas

Fondo

En los últimos años, la Encefalopatía Diabética (DE), una complicación de la Diabetes Mellitus (DM) que ocurre en el Sistema Nervioso Central (SNC), ha recibido una atención generalizada. La DE puede estar asociada con varios factores de riesgo, como la edad, la duración y el control glucémico de la diabetes [1, 2]. Las manifestaciones clínicas de la DE son cambios morfológicos y fisiológicos en el cerebro y la disfunción cognitiva resultante. La hiperglucemia, el estrés oxidativo y la inflamación crónica pueden ser las causas patogénicas importantes de la DE [3]. Aunque un número cada vez mayor de experimentos ha demostrado que la hiperglucemia sostenida a largo plazo puede acelerar el envejecimiento cerebral, la patogenia precisa de la DE aún no se ha explorado.

La apoptosis es una muerte celular programada controlada por genes para mantener la estabilidad del microambiente. Las proteínas involucradas en la apoptosis incluyen la familia Bcl-2, caspasas, p53, etc. La familia Bcl-2 se divide en dos categorías, una que promueve la muerte celular, como Bax, y la otra que resiste la apoptosis, como Bcl-2. Pueden regular la apoptosis a través de la vía de señalización de la caspasa, que es una reacción de amplificación en cascada del sustrato de hidrólisis finita irreversible de la caspasa [4-6]. Además, los estudios han demostrado que la apoptosis inducida por niveles altos de glucosa (HG) se asocia con disfunción mitocondrial, daño en el ADN y producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) [7]. Un estudio de ratones diabéticos mostró que la proteína quinasa activada por adenosina 5'-monofosfato (AMP) (AMPK), un receptor intracelular de energía y estrés, podría inhibir la apoptosis mediada por ROS. Además, la creciente evidencia ha demostrado que la inhibición de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) podría ser beneficiosa para la inhibición de la apoptosis neuronal. Otro informe mostró que la quinasa N-terminal c-Jun (JNK), las proteínas quinasas reguladas extracelulares (ERK) y las vías de señalización p38 MAPK pueden potencialmente regular la apoptosis neuronal [8,9].

Basado en la teoría de la medicina tradicional china,riñónLa deficiencia de esencia y la estasis sanguínea se consideran como patogenia básica de la DE. Por lo tanto, la estrategia de nutrirriñonesy la sangre activadora se usa comúnmente en aplicaciones clínicas para DE. Estudios previos podrían confirmar que la prescripción modificada de Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), una prescripción destinada a nutrirriñones, puede mejorar el deterioro cognitivo y proteger las neuronas al reducir la toxicidad A [10, 11]. La prescripción Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), en la que se agrega sanguijuela en función de MWP, está formulada específicamente paranutrirriñonesy activar la sangre. Estudios recientes han demostrado que la prescripción de BSHX puede mejorar el síndrome de deterioro de la memoria de los pacientes con DM, lo que sugiere poderosas propiedades neuroprotectoras [12]. Sin embargo, el mecanismo farmacológico detallado para BSHX sigue sin estar claro. En este estudio, nuestro objetivo es observar el efecto protector del extracto de BSHX en las células PC12 inducidas por HG y explorar posibles mecanismos moleculares.

Métodos

Materiales y reactivos

Todas las hierbas fueron adquiridas de Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Beijing, China) y autenticadas por el Dr. PF Tu, farmacognosista, de acuerdo con la Farmacopea China (Comisión de Farmacopea de la República Popular China, 2010). El bromuro de 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolio (MTT) era de Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, EE. UU.). Se adquirió un kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) del Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, China). El kit de tinción doble con naranja de acridina (AO)/bromuro de etidio (EB) y Hoechst 33258 se obtuvieron de Solar Co., Ltd. (Beijing, China). Se adquirió un kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1, 2, 7-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) del Instituto de Biotecnología Beyotime (Shanghai, China). Anticuerpos primarios para caspasa-3, caspasa escindida-3, PARP, PARP escindida, citocromo C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK y -tubulina se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Boston, MA, EE. UU.).

Preparación del extracto de BSHX

BSHX consta de siete componentes medicinales (Tabla 1). Para la preparación del extracto BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) y Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) se mezclaron en la proporción de 8:8:4:1:2:1:8 y se sumergieron en un volumen total de 10 veces (v/p) de agua destilada durante 30 min. , luego se hirvió durante 1 h y se volvió a hervir durante 1 h en un volumen total de 5 veces (v/p) agua destilada. Los sobrenadantes se combinaron y secaron por liofilización. El extracto seco final fue el 25 por ciento (p/p) del peso de las hierbas crudas y se depositó un espécimen de prueba en el Centro de Investigación Moderna para la Medicina Tradicional China, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín, Beijing, China.

Cultivo de células

Las líneas celulares de feocromocitoma de rata (células PC12) se obtuvieron del Peking Union Medical College Cell Bank (Beijing, China) y se cultivaron en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Beijing, China) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (Biowest, Francia). ) y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina (100x, Macgene, Beijing, China) en una incubadora humidificada que contiene 95 por ciento de aire y 5 por ciento de CO2 a 37 grados.

Tratamiento de muestra

En la prueba preliminar, las células PC12 se trataron con extracto de BSHX (20, 50, 100 mg/l) solo durante 48 h para evaluar la citotoxicidad. Para el análisis del efecto neuroprotector del extracto de BSHX frente a la neurotoxicidad inducida por glucosa alta (HG), las células PC12 se cotrataron con extracto de BSHX (20, 50, 100 mg/l) y HG (75 mM) durante 48 h, seguido de un ensayo de MTT para la viabilidad celular. Todos los demás ensayos se realizaron en las mismas condiciones con el rango de concentración de extracto de BSHX de 20 a 100 mg/L.

Ensayo de viabilidad celular

Las células PC12 se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 3,5 × 103 células por pocillo. Después de la incubación con extracto de BSHX (con o sin HG) durante 48 h, se eliminó el sobrenadante y se agregó solución de MTT (0,5 mg/mL). Después de la incubación a 37 grados durante 4 h, la solución de MTT se eliminó y las células se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) para agitar durante 5 min. La densidad óptica (DO) se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas. Viabilidad celular (porcentaje)=[OD (tratamiento) – OD (en blanco)]/ [OD (control sin tratar) – OD (en blanco)] × 100 por ciento.

ensayo LDH

Las células PC12 se cultivaron y se estimularon con un tratamiento de extracto de HG y BSHX como se describió anteriormente. Luego, la LDH liberada de las células se detectó utilizando un kit de LDH comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 450 nm. LDH (U/L)=[OD (tratamiento) – OD (en blanco)] / [OD (estándar) – OD (en blanco)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Tinción Hoechst 33258 y tinción AO/EB

Para la tinción con Hoechst 33258, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 por ciento durante 30 min. Luego, las células se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) 3 veces y se incubaron con solución de trabajo Hoechst 33258 (1 ug/mL) en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia (IX73, Olympus, Japón) con una longitud de onda de excitación de 352 nm/longitud de onda de emisión de 461 nm. Para la tinción de AO/EB, retire el medio de 96-placas de pocillos y agregue la mezcla de AO/EB (100 ug/mL de AO y 100 ug/mL de EB mezclados) durante 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron con PBS 3 veces. Las células se visualizaron usando un microscopio de fluorescencia bajo una longitud de onda de excitación de 490 nm/longitud de onda de emisión de 530 nm para la tinción con AO y una longitud de onda de excitación de 520 nm/longitud de onda de emisión de 590 nm para la tinción con EB.

Detección de ROS intracelular

Para la detección de ROS intracelular, se sembraron células PC12 en 6-placas de pocillos a una densidad de 5 × 105 y se sometieron a tratamiento con extractos de HG y BSHX durante 24 h. Después de 24 h de incubación, las células PC12 se lavaron con medio Eagle modificado de Dulbecco sin suero durante 3 veces y se añadieron a 10 μΜ de diacetato de 2', 7'-diclorofluoresceína (DCF-DA), que se oxida a 2', 7'-diclorofluoresceína fluorescente. (DCF) por hidroperóxidos, a 37 grados durante 30 min en la oscuridad. Luego, las células se lavaron con PBS frío 3 veces y se resuspendieron en PBS. El nivel intracelular de ROS se detectó midiendo la intensidad de fluorescencia media mediante citometría de flujo (BD FACSCaliburTM, EE. UU.). Las longitudes de onda de excitación/emisión fueron de 488/525 nm. Se contó un mínimo de 10000 eventos por muestra. Los valores se expresaron como la absorbancia media normalizada al porcentaje del valor de control.

Ensayo de potencial de membrana mitocondrial

La despolarización mitocondrial se evaluó utilizando un kit de ensayo comercial JC-1. Después de ser tratadas con extracto de HG y BSHX, las células se incubaron con solución de trabajo JC-1 (1 ×) a 37 grados durante 15 min en la oscuridad. Luego, retire el sobrenadante y lave las células 2 veces con solución tampón JC-1 (1 ×). Las células se visualizaron usando un microscopio de fluorescencia bajo una longitud de onda de excitación de 460 nm/longitud de onda de emisión de 530 nm para el monómero JC-1 (detectado en células con mitocondrias despolarizadas), y una longitud de onda de excitación de 520 nm/longitud de onda de emisión de 590 nm para JC{{13 }} polímero (presente en las mitocondrias polarizadas). Se consideró que las células con fluorescencia verde (monomérica) tenían mitocondrias despolarizadas; se consideró que las células con fluorescencia roja (polimérica) tenían mitocondrias normales.

Análisis de Western Blot

Las células PC12 se recolectaron y lisaron en tampón RIPA frío con un inhibidor de proteasa combinado 1X. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación de alta velocidad a 12,000 rpm durante 10 min a 4 grados. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de Bradford. Las fracciones enriquecidas en mitocondrias y citosol se aislaron con el kit de aislamiento de mitocondrias (Pierce, Rockford, EE. UU.) para el análisis de citocromo c. Para otras proteínas, los lisados ​​celulares totales se separaron mediante SDS-PAGE (10 por ciento -15 por ciento) y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas de fluoruro de polivinilideno se bloquearon luego con leche descremada al 5 por ciento y se incubaron con los anticuerpos primarios indicados a 4 grados durante la noche. Las membranas se lavaron con PBST (solución salina tamponada con fosfato, Tween 20 al 0,1 por ciento) tres veces y se incubaron con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 2 h. Luego, las membranas se lavaron con PBST otras tres veces y se visualizaron usando un sustrato quimioluminiscente mejorado, y se escanearon con el Sistema de imágenes digitales Kodak (Gel Logic 2200Pro, Kodak, EE. UU.).

análisis estadístico

Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar (DE). La importancia de las diferencias entre los valores medios se determinó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) utilizando el paquete estadístico para ciencias sociales (SPSS 16.0 software). P < 0.05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control="" se="" consideró="" estadísticamente="">

Resultados

El extracto de BSHX protege las células PC12 contra la lesión celular inducida por HG

Para investigar si el extracto de BSHX podría proteger a las células PC12 del insulto de HG, tratamos las células PC12 con un rango de concentraciones de extracto de BSHX (20, 50 y 100 mg/l) durante 48 h en condiciones de HG (75 mM). La evaluación de la viabilidad celular mediante el ensayo MTT mostró que la agresión de HG causó una disminución significativa en la viabilidad de las células PC12 (la viabilidad celular fue de aproximadamente 56,9 ± 6,7 por ciento) y que el tratamiento con extracto de BSHX evitó significativamente la muerte celular de una manera dependiente de la concentración. La viabilidad celular aumentó a 87,8 ± 9,2 por ciento cuando las células se cotrataron con extracto de BSHX (100 mg/L) (Figura 1A). La lactato deshidrogenasa (LDH) se libera de las células dañadas y, por lo tanto, también se puede utilizar como indicador de toxicidad celular. De acuerdo con los resultados del ensayo MTT, encontramos que el insulto de HG aumentó significativamente la liberación de LDH de las células PC12 y que el tratamiento con extracto de BSHX evitó la liberación de LDH de una manera dependiente de la concentración (Figura 1B). Estos resultados sugieren que el extracto de BSHX aumenta la viabilidad celular. en células PC12 inducidas por HG.

El extracto de BSHX inhibe la apoptosis de las células PC12 a través de la vía dependiente de caspasa-9/3-

Para determinar el efecto del extracto de BSHX en la apoptosis celular, utilizamos colorante de ADN Hoechst 33258 como ensayo sensible para la apoptosis. Los núcleos de las células normales teñidas con Hoechst 33258 mostraron una fluorescencia azul uniforme, mientras que las células apoptóticas con picnosis de nube de cromatina nuclear mostraron partículas hipercromáticas y fluorescentes densas. El porcentaje de apoptosis se calculó en función del número de células apoptóticas frente al número total de células. Nuestros datos revelaron que el insulto de HG (75 mM) aumentó drásticamente la proporción de células apoptóticas (51,7 ± 4,3 por ciento) y el tratamiento con extracto de BSHX protegió significativamente contra la apoptosis inducida por HG en células PC12 (Figura 2A). Estos resultados fueron respaldados adicionalmente por el análisis de doble tinción AO/EB. AO ingresa tanto a las células normales como apoptóticas y emite fluorescencia verde, mientras que EB solo ingresa a las células apoptóticas y emite fluorescencia roja [13]. El ensayo AO/EB mostró que el porcentaje de células apoptóticas aumentó significativamente después de la agresión con HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 por ciento) y disminuyó con el tratamiento con extracto de BSHX en células PC12 (Figura 2B), lo que sugiere que el extracto de BSHX podría inhibir la apoptosis de las células PC12 inducida por HG.

Luego, investigamos el efecto del extracto de BSHX en la vía caspasa-3/PARP, una vía importante para la apoptosis relacionada con las mitocondrias [14]. Western blot reveló que el insulto de HG (75 mM) aumentó significativamente las expresiones de formas activas de caspasa-3 y PARP y disminuyó las expresiones de caspasa total-3 y PARP en células PC12, y este efecto se revirtió notablemente por el tratamiento con extracto de BSHX (Figura 2C), lo que sugiere que el extracto de BSHX protegió eficazmente a las células PC12 contra la apoptosis a través de la regulación de la ruta de caspasa-3/PARP dependiente de mitocondrias.

El extracto de BSHX inhibe la producción de ROS intracelular en células PC12 inducidas por HG

Dado que HG podría mejorar la formación de ROS intracelular [15], probamos el nivel de ROS intracelular para determinar si el extracto de BSHX podría inhibir la generación de ROS. Se observó un aumento de 3.23-veces en la intensidad media de fluorescencia en las células PC12 que se expusieron a 75 mM de HG durante 48 h en comparación con el control. Por el contrario, el cotratamiento con extracto de BSHX redujo significativamente la intensidad de fluorescencia media a aproximadamente 0.76-, 0.{{10}} y 0.{ {12}} veces del grupo modelo, respectivamente, lo que indica que el extracto de BSHX podría inhibir la producción de ROS inducida por HG (Figuras 3A, B).

El extracto de BSHX mantiene la homeostasis mitocondrial en las células PC12 inducidas por HG mediante la regulación de la expresión de Bax y Bcl-2

El potencial de membrana mitocondrial es un parámetro importante de la función mitocondrial que se utiliza como indicador de la salud celular. JC-1 es un tinte catiónico lipofílico que puede entrar selectivamente en las mitocondrias y cambiar de color reversiblemente de verde a rojo a medida que aumenta el potencial de membrana. En células sanas con alto potencial de membrana mitocondrial, JC-1 forma espontáneamente complejos conocidos como agregados J con una intensa fluorescencia roja. Por otro lado, en células apoptóticas con bajo potencial de membrana mitocondrial, JC-1 permanece en la forma monomérica, que muestra solo fluorescencia verde [16, 17]. Por lo tanto, la proporción de fluorescencia verde a fluorescencia roja puede reflejar la despolarización mitocondrial. En nuestro estudio, el número de células con mitocondrias despolarizadas (fluorescencia verde) aumentó significativamente después de HG (75 mM) durante 48 h, y este aumento se revirtió mediante el tratamiento con extracto BSHX de manera dependiente de la concentración (Figura 4A).

A continuación, detectamos las distribuciones mitocondriales y citoplasmáticas del citocromo c, un actor clave en la vía de activación de la apoptosis dependiente de caspasa. Encontramos que el insulto de HG (75 mM) durante 48 h indujo una translocación dramática del citocromo c de las mitocondrias al citoplasma, y ​​esta reubicación fue prevenida significativamente por el tratamiento con extracto de BSHX (Figura 4B), lo que indica que el extracto de BSHX podría inhibir la liberación de citocromo c de las mitocondrias.

Además, las proteínas de la familia Bcl-2 son reguladores importantes de varias vías apoptóticas. Bcl-2 puede inhibir la apoptosis celular causada por una variedad de factores citotóxicos y es el inhibidor de la liberación de citocromo c de las mitocondrias al citoplasma. Sin embargo, Bax, como miembro de la familia Bcl-2, es un factor pro-apoptosis. Cuando se induce la apoptosis, Bax migra del citoplasma a la mitocondria y destruye la integridad mitocondrial [5, 18]. En nuestro estudio, el nivel de proteína de Bcl-2 se reguló a la baja y Bax se reguló al alza por la agresión de HG (75 mM) durante 48 h, este efecto se revirtió de forma dependiente de la concentración mediante el extracto de BSHX (Figura 4C). Todos estos resultados anteriores sugirieron que el extracto de BSHX protegía a las células PC12 contra la despolarización mitocondrial inducida por HG mediante la regulación de la expresión de Bax y Bcl-2.

Efecto del extracto de BSHX sobre la apoptosis celular a través de las vías de señalización JNK/p38 MAPK

Algunos estudios han demostrado que el aumento de la producción de ROS se ha asociado con la activación de las vías MAPK para desencadenar la apoptosis celular9 [19, 20]. Así que investigamos el efecto del extracto de BSHX en la vía de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) para determinar si el extracto de BSHX podría atenuar la apoptosis inducida por HG. Como se muestra en la Figura 5, el insulto de HG (75 mM) durante 48 h aumentó las fosforilaciones de c-Jun NH2-terminal quinasa (JNK) y p38 en células PC12, que fueron significativamente inhibidas por el extracto de BSHX en una concentración- manera dependiente. Sin embargo, no se observó un resultado similar con la proteína quinasa extracelular regulada (ERK) MAPK. Los resultados sugieren que el extracto de BSHX podría inhibir la apoptosis celular inducida por HG a través de las vías de señalización JNK/p38 MAPK.

Discusión

La encefalopatía diabética (DE) es una complicación frecuente de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Puede causar deterioro cognitivo del cerebro y es un importante factor de riesgo de mortalidad y discapacidad en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 en todo el mundo [3]. Por lo tanto, es fundamental estudiar el mecanismo de la DE, así como sus estrategias de prevención y tratamiento.

En China, las medicinas tradicionales chinas (MTC) se han utilizado para el tratamiento de la DM durante muchos años y han mostrado un efecto curativo. Algunos estudios clínicos sugieren que la medicina tradicional china basada en la nutrición de los riñones y la activación de estrategias sanguíneas puede regular a la baja la glucosa en la sangre, promover la circulación y mejorar la disfunción cognitiva del cerebro. La prescripción BSHX es un representante de estos TCM. Nuestro estudio clínico preliminar mostró que la prescripción de BSHX podría mejorar eficazmente la glucosa en sangre, la homocisteína (HCY) y la proteína C reactiva de alta sensibilidad (hs-CPR) en suero, y mejorar la función cognitiva de los pacientes diabéticos con deterioro cognitivo leve (MCI) [12]. Sin embargo, hay una falta de evidencia para probar la eficacia y el mecanismo farmacológico hasta el momento.

En este estudio, encontramos que el extracto de BSHX podría atenuar la reducción de la viabilidad celular inducida por HG, según lo medido por el ensayo MTT, LDH. Para explorar más a fondo el efecto protector del extracto de BSHX sobre la viabilidad celular, estudiamos la apoptosis mediante el análisis de tinción Hoechst 33258 y AO/EB. Los resultados mostraron que el extracto de BSHX podría reducir significativamente la apoptosis inducida por HG. Como marcador de apoptosis, la caspasa-3 y la PARP aumentaron significativamente después del tratamiento con HG, pero la activación de estos factores proapoptóticos fue inhibida por el extracto de BSHX de manera dependiente de la concentración. Los resultados anteriores indicaron que el extracto de BSHX tuvo un efecto protector sobre el daño celular PC12 inducido por HG.

Las ROS se forman durante el proceso de fosforilación oxidativa de las células, y su aumento en la producción o el daño de los sistemas antioxidantes puede provocar estrés oxidativo en las células [21]. Los estudios han demostrado que la glucosa alta podría dar lugar a la acumulación de ROS intracelulares y, finalmente, a una vía de señalización apoptótica activa. Y el mecanismo común de las complicaciones diabéticas es el estrés oxidativo [22, 23]. Nuestros resultados mostraron que la glucosa alta podría conducir al aumento de ROS en las células PC12, lo cual fue consistente con estudios previos [24]. Se especula que la toxicidad de la glucosa alta para las células puede lograrse a través de la apoptosis inducida por ROS. Las mitocondrias son los principales sitios de producción de ROS intracelulares y también el principal órgano diana para el ataque de ROS [25]. En condiciones patológicas, el rápido aumento de ROS puede dar lugar a una disfunción mitocondrial, al colapso del potencial de la membrana mitocondrial y, finalmente, a la apoptosis celular [26]. Entonces detectamos la integridad de las mitocondrias. Nuestros resultados mostraron que la glucosa alta disminuyó significativamente el potencial de la membrana mitocondrial, aumentó la proporción de Bax/Bcl-2 que controlaba el cambio del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP) y promovió la fuga de citocromo c, mientras que el extracto de BSHX podría revertir estos cambios. Estos sugieren que el neuroprotector del extracto de BSHX contra las células PC12 inducidas por HG puede resultar del mantenimiento de la integridad de las mitocondrias.

La vía de señalización de MAPK también juega un papel importante en la apoptosis celular. JNK, ERK y p38 MAPK son los miembros más estudiados de la familia MAPK. Su principal forma de acción es fosforilar sus sitios específicos, regulando así la apoptosis celular [8, 27, 28]. Además, los estudios han demostrado que la producción excesiva de ROS puede desencadenar la fosforilación de p38MAPK [29-31], y las ROS pueden inducir o mediar en la activación de las vías MAPK [32]. Varios estímulos celulares que inducen la producción de ROS también en paralelo pueden activar las vías MAPK en múltiples tipos de células [32, 33]. Los mecanismos potenciales para la activación de MAPK por ROS pueden incluir la inactivación y degradación de las fosfatasas de MAPK que mantienen la vía en un estado inactivo [19]. Por otro lado, para confirmar aún más si las vías de MAPK se activaron mediante la generación de ROS, las células se trataron previamente con antioxidantes (p. ej., NAC, un eliminador de ROS) para evitar la acumulación de ROS. Y los resultados mostraron que la activación de MAPK casi se inhibió después de la estimulación celular con estímulos celulares [32, 33], lo que indica la participación de la inactivación de ROS en las vías de MAPK. Además, los estudios demostraron que cuando las células se trataban con el inhibidor específico de JNK SP600125, la apoptosis inducida por la cardiotoxina III podía bloquearse [34]. Nuestro estudio anterior encontró que la prescripción modificada de Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) podría inhibir la activación de ERK/p38 MAPK en la microglía BV2 activada por A [10]. Sin embargo, en este estudio encontramos que el extracto de BSHX podía inhibir la fosforilación de JNK y p38 MAPK y no logramos el mismo resultado con p-ERK. Especulamos que las sanguijuelas juegan un papel diferente en el extracto BSHX. Los resultados sugieren que otro mecanismo protector del extracto de BSHX contra la apoptosis en células PC12 inducidas por HG puede ser a través de la regulación de las vías de señalización de JNK/p38 MAPK.

Conclusión

El extracto de BSHX, una fórmula poliherbal, muestra efectos neuroprotectores en las células PC12 contra la agresión de HG. El extracto de BSHX inhibió eficazmente la apoptosis de las células PC12 inducida por HG al disminuir la generación de ROS intracelular, mantener la integridad de la membrana mitocondrial y bloquear las vías de señalización de caspasa-3 y JNK/p38 MAPK (Figura 6). En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que el extracto de BSHX es un agente prometedor para el tratamiento de la DE en aplicaciones clínicas.

Contribuciones de autor

Concibieron y diseñaron los experimentos: Zeng KW, Wang XM. Llevó a cabo el experimento: Zhao SY. Analizó los datos: Zhao SY, Zeng KW y Wang XM. Reactivos/materiales/herramientas de análisis contribuidos: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW y Wang XM. Escribió el padre: Zhao SY.

Referencias

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. El cerebro diabético y la cognición. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Lesión cerebral con diabetes mellitus: evidencia, mecanismos e implicaciones del tratamiento. Experto Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. La Teoría de la "Memoria Metabólica" y el Tratamiento Temprano de la Hiperglucemia en la Prevención de Complicaciones Diabéticas. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. El potencial de membrana mitocondrial (Δψm) en la apoptosis; una actualización. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Conexión de la dinámica mitocondrial y los eventos de vida o muerte a través de las proteínas de la familia Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitocondrias y muerte celular. Aspectos mecanicistas y cuestiones metodológicas. febrero J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et al. 1,25-(OH)2D3 inhibe la apoptosis inducida por glucosa alta y la producción de ROS en células mesoteliales peritoneales humanas a través de la vía MAPK/P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. El pretratamiento con factor de crecimiento nervioso atenúa la activación de la cinasa 1 amino-terminal c-Jun inducida por la privación de oxígeno y glucosa y la activación de las cinasas p38 y p38 activadas por estrés y confiere neuroprotección en el modelo de feocromocitoma PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, et al. Participación de la caspasa-3 y la proteína quinasa activada por mitógeno p38 en la apoptosis inducida por cloruro de cobalto en células PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Efectos antineuroinflamatorios de la prescripción modificada de Wu-Zi-Yan-Zong en microglía BV2 estimulada con amiloide a través de las vías de señalización NF-κB y ERK/p38 MAPK. Compl basado en Evid Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. La prescripción modificada de Wu-Zi-Yan-Zong, una fórmula poliherbal china tradicional, suprime los procesos neuroinflamatorios inducidos por lipopolisacáridos en astrocitos de rata a través de las vías de señalización NF-κB y JNK/p38 MAPK. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. Efecto de la prescripción de Bushen Huoxue en el tratamiento del deterioro cognitivo leve de la diabetes tipo 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Análisis de la apoptosis inducida por cicloheximida en leucocitos humanos: microscopía de fluorescencia utilizando anexina V/yoduro de propidio frente a naranja de acridina/bromuro de etidio. Biol celular. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Las caspasas conectan la señalización de muerte celular con la homeostasis del organismo. Inmunidad 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Óxido nítrico: un factor clave detrás de la disfuncionalidad de las células progenitoras endoteliales en la diabetes mellitus tipo-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: Las longitudes de onda de excitación alternativas facilitan la citometría del potencial de membrana mitocondrial. Muerte celular Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Sondas de potencial de membrana mitocondrial y el gradiente de protones: una guía práctica de uso. Biotecnología 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green DR. ¿Cómo inducen las proteínas BCL-2 la permeabilización de la membrana externa mitocondrial? Tendencias Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Proteínas quinasas activadas por mitógenos y especies reactivas de oxígeno: ¿cómo pueden las ROS activar las vías MAPK? Transductor de señal J 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Los ésteres heterocíclicos aromáticos de podofilotoxina ejercen actividad anti-MDR en células de leucemia humana K562/ADR a través de la vía de señalización ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Dirigirse a la glucógeno sintasa quinasa-3 para el beneficio terapéutico contra el estrés oxidativo en la enfermedad de Alzheimer: participación de la vía Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. El papel del estrés oxidativo en la neuropatía diabética: generación de especies de radicales libres en la reacción de glicación y polimorfismos genéticos que codifican enzimas antioxidantes para la susceptibilidad genética a la neuropatía diabética en la población de pacientes diabéticos tipo I. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Muerte celular, especies reactivas de oxígeno (ROS) y complicaciones diabéticas. Muerte celular Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, et al. Ginkgolide B inhibe la apoptosis en células endoteliales de vena umbilical humana estimuladas con glucosa alta. Boletín farmacológico chino 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Papel deletéreo de la superóxido dismutasa en el espacio intermembrana mitocondrial. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Piso KB. Proteínas quinasas activadas por mitógenos: nuevas vías de señalización que funcionan en las respuestas celulares al estrés ambiental. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, et al. MiR-125b actúa como un oncogén en las células de glioblastoma e inhibe la apoptosis celular a través de vías independientes de p53 y p38MAPK. Brit J Cáncer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, et al. Los productos finales de glicación avanzada inducen la apoptosis de las células epiteliales de la córnea humana a través de la generación de especies reactivas de oxígeno y la activación de las vías JNK y p38 MAPK. Más Uno 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, et al. La grelina inhibe la apoptosis en las células neuronales hipotalámicas durante la privación de oxígeno y glucosa. Endocrinología 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A altera las proteínas reguladoras del ciclo celular e induce la apoptosis a través de la activación de p38MAPK dependiente de especies reactivas de oxígeno en la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7. Biología Tumoral 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. Lesión oxidativa inducida por ROS involucrada en la patogénesis de la queratitis fúngica a través de la activación de p38 MAPK. Informe científico 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Activación inducida por especies reactivas de oxígeno de las vías de señalización de la MAP quinasa. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Señalización redox y las vías de la quinasa MAP. Biofactores 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. La cardiotoxina III induce la apoptosis dependiente de la quinasa N-terminal c-jun en células de leucemia humana HL-60. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.