El NGF modula el metabolismo del colesterol y estimula la secreción de ApoE en las células gliales, lo que confiere neuroprotección contra el estrés oxidativo, parte 2

2.6. La secreción de ApoE mediada por NGF por U373 protege las células neuronales del insulto oxidativo

La evidencia acumulada destaca que la ApoE aumenta la resiliencia neuronal a las agresiones oxidativas, previniendo así la apoptosis y la neurodegeneración [17,18,37]. En este contexto, evaluamos si la secreción de ApoE inducida por NGF por parte de las células U373 podría proteger a las neuronas N1E-115 del estrés oxidativo. Los N1E-115 completamente diferenciados se trataron previamente con rotenona, que induce estrés oxidativo al inhibir el complejo mitocondrial I.

La apoptosis es un proceso de autodestrucción y es una forma importante para que las células mantengan la homeostasis del cuerpo mediante la autodestrucción programada bajo determinadas circunstancias. La apoptosis juega diferentes roles en diferentes etapas de la vida.

Estudios recientes han demostrado que existe una cierta relación entre la apoptosis y la memoria. Ya sabemos que la memoria es un proceso neuronal complejo en el cerebro que implica conexiones y coordinación entre múltiples regiones del cerebro. La apoptosis puede desempeñar un papel en este proceso neuronal.

Por un lado, la apoptosis puede estabilizar la estructura de la red de las neuronas al eliminar neuronas y sinapsis innecesarias, refinando las conexiones de las neuronas y mejorando así la calidad y eficiencia de la memoria. Por otro lado, una apoptosis excesiva también puede conducir a una reducción en el número de células cerebrales, lo que puede afectar negativamente al almacenamiento y captura de recuerdos.

Por tanto, manteniendo niveles adecuados de apoptosis, podemos mejorar la memoria a través de una serie de conductas y habilidades, como leer, aprender, hacer ejercicio y ajustar nuestra mentalidad. Estos comportamientos y habilidades pueden promover el crecimiento y la conexión de las células cerebrales y mejorar la calidad y eficiencia de la memoria al estimular las conexiones y la coordinación entre las neuronas cerebrales.

En conclusión, la relación entre apoptosis y memoria es compleja. Sólo manteniendo una apoptosis adecuada podemos estimular nuestro cerebro y mejorar nuestra memoria a través de una variedad de comportamientos y habilidades. Desde este punto de vista, necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche deserticola puede ayudarnos significativamente a mejorar nuestra memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son importantes para la memoria. Es muy importante para aprender y aprender. Además, la carne obtenida de la carne también puede mejorar la fluidez de la sangre y promover el transporte de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Después de 16 h de exposición a rotenona, se cultivaron neuronas N1E-115 en medio fresco (Ctrl), medio condicionado de células U373 (U373-Ctrl), medio condicionado de U373 pretratado con NGF durante 48 h. (U373-NGF), o medio condicionado de U373 silenciado con ApoE pretratado con NGF durante 48 h (U373-NGF ApoE siRNA). El tratamiento previo con rotenona disminuyó considerablemente la cantidad de N1E-115 cultivadas en el medio de control, lo que indica que la administración de este pesticida afecta gravemente la supervivencia de N1E-115.

La citotoxicidad de la rotenona también determinó una intensa retracción de las neuritas, como se observa por la longitud de las neuritas. El daño a las neuritas provocado por el tratamiento con rotenona fue particularmente evidente tras la evaluación de las células portadoras de neuritas, ya que el número de N1E-115 con neuritas disminuyó al 50 %. Se obtuvieron resultados similares cuando se cultivaron células N1E-115 en medio condicionado U373-Ctrl, lo que sugiere que la presencia de sobrenadante derivado de astrocitos no estimulados no es suficiente para proteger las células neuronales de la toxicidad mediada por rotenona. Por desgracia, la aplicación de medio condicionado derivado de U373 tratado con NGF previno eficazmente la muerte neuronal, así como la reducción de las células portadoras de neuritas y la longitud de las neuritas causada por la administración de rotenona (Figura 5).

Más importante aún, el medio condicionado derivado de células U373 silenciadas con ApoE perdió por completo los efectos beneficiosos inducidos por el medio condicionado U373-NGF, lo que indica que la neuroprotección está impulsada por la liberación de ApoE mediada por NGF en el medio de cultivo. En particular, el medio condicionado de U373 tratado con NGF y transfectado con ARNip revuelto retuvo completamente los efectos protectores ejercidos por el medio condicionado con U373-NGF, lo que demuestra que la pérdida de neuroprotección observada en el medio condicionado de células silenciadas con ApoE depende efectivamente de ApoE. regulación a la baja (Figura S3C).

Figura 5. Efectos del medio condicionado U373 sobre el estrés oxidativo en las neuronas. Imágenes representativas en campo brillante y evaluación cuantitativa de la morfología neuronal de N1E-115. Las células se trataron previamente (+) o no (-) con rotenona (0.1 µM) durante 16 h, y luego se cultivaron en DMEM fresco (Ctrl), en un medio condicionado derivado del control U373 (U{{ 9}}Ctrl), U373 pretratado con NGF (U373-NGF) y U373 pretratado con NGF silenciado para apoE (U373-NGF ApoE siRNA) durante 48 h. n=5 experimentos diferentes. Los datos representan medias ± DE. El análisis estadístico se evaluó mediante ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Tukey. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Para reforzar los resultados obtenidos del medio condicionado, realizamos cocultivos U373/N1E115. Para empezar, las células U373 fueron pretratadas o no con NGF durante 48 h. Además, las células N1E-115 diferenciadas se trataron previamente o no con rotenona durante 16 h. Posteriormente, el medio U373 se reemplazó con medio nuevo que contenía 0.5 % de FBS, y se transfirieron cubreobjetos sembrados con N1E-115 a la capa U373 para preparar cocultivos (Figura 6A).

El daño oxidativo provocado por el tratamiento con rotenona afectó considerablemente a las células portadoras de viabilineuritas y a la longitud de las neuritas de control N1E-115 y N1E-115 cocultivadas con astrocitos U373-Ctrl (Figura 6B). De acuerdo con los experimentos en medio condicionado, las células N1E-115 cocultivadas con células U373-NGF se protegieron del daño oxidativo, mientras que el silenciamiento de ApoE en U373 abolió la neuroprotección sostenida por NGF.

Figura 6. La secreción de ApoE por células U373 tratadas con NGF proporciona neuroprotección contra el estrés oxidativo. (A) Esquema representativo de cocultivos de astrocitos y neuronas configurados como se describe en la Sección de Materiales y Métodos. Las células portadoras de neuritas, la longitud de las neuritas y el número de células se evaluaron horas después del establecimiento del cocultivo. (B) Imágenes representativas en campo brillante y evaluación cuantitativa de la morfología neuronal de células N1E-115, previamente tratadas (+) o no (-) con rotenona (0.1 µM) durante 16 h.

Luego se mantuvieron N1E-115 en DMEM fresco (Ctrl) o se cultivaron conjuntamente con el control U373 (U373-Ctrl), U373 pretratado con NGF (U373-NGF) y U373 pretratado con NGF silenciado para ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) durante 48 h. n=5 experimentos diferentes. Los datos representan medias ± DE. El análisis estadístico se llevó a cabo mediante ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

3. Discusión

Los desequilibrios en las vías de señalización de las neurotrofinas, así como las alteraciones en el metabolismo del colesterol en el cerebro, están fuertemente asociados con enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, como el síndrome de Rett, la EH, la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) [2,38,39]. . En este contexto, la investigación fundamental sobre la actividad biológica de las neurotrofinas es fundamental para analizar los mecanismos moleculares que vinculan el metabolismo del colesterol y la fisiopatología cerebral. Durante los últimos años, un interesante estudio informó sobre el papel del BDNF en la regulación del metabolismo del colesterol en los astrocitos [38].

A pesar de esta idea, no hay información disponible sobre la supuesta participación del NGF en la regulación del colesterol astrocítico. Por tanto, en este trabajo nos centramos en el papel prospectivo que ejerce el NGF en la regulación del metabolismo del colesterol, con especial referencia a la influencia de la secreción de ApoE en la diferenciación y supervivencia neuronal. U373, la línea celular de astrocitoma utilizada como modelo experimental de astrocitos humanos, conserva el potencial de responder completamente al NGF, ya que expresa niveles apreciables tanto de TrkA como de p75NTR.

Los principales resultados indicaron que el NGF regula positivamente los niveles de las principales proteínas involucradas en la biosíntesis del colesterol (HMGCR), el tráfico intracelular (NPC1) y la secreción (ABCA1). Estos eventos van acompañados de un aumento simultáneo de ApoE y colesterol lein en el medio de cultivo, lo que sugiere que el NGF aumenta la biosíntesis y extrusión de colesterol de las células gliales. Se ha informado que el NGF induce la expresión de la proteína ApoE aumentando su transcripción [40]. Sin embargo, no observamos ningún cambio significativo en la expresión de ApoE intracelular. Esta aparente inconsistencia puede explicarse porque la acumulación de ApoE no puede apreciarse debido a su mayor flujo de salida de la UIn tratada con NGF.
En un intento de analizar mejor los mecanismos moleculares, tratamos a U373 con LM11A-31 y descubrimos que el modulador p75NTR solo podía imitar el aumento en la expresión de HMGCR mediado por NGF. La participación de p75NTR en la modulación de los niveles de HMGCR es consistente con datos previos obtenidos en otros tipos de células, lo que demuestra que este receptor controla la transcripción de enzimas colesterógenas [41]. Sin embargo, LM11A-31 no indujo ningún cambio ni en las otras proteínas analizadas en este estudio, incluida ABCA1, ni en los niveles de colesterol y ApoE en el medio de cultivo, lo que indica que la modulación selectiva de p75NTR no es suficiente para promover el colesterol. extrusión a través de partículas ricas en ApoE observada en células tratadas con NGF. Estos resultados nos llevan a plantear la hipótesis de que el NGF gobierna el metabolismo del colesterol en las células gliales mediante la participación de los receptores p75NTR y TrkA.

Es bien sabido que la unión de neurotrofina a los receptores Trk activa ERK1/2, regulando así varias vías implicadas en la diferenciación, proliferación y supervivencia celular [2,38]. Curiosamente, se ha observado que la activación de ERK1/2 también regula la expresión de ABCA1 y ApoE en diferentes tipos de células [38,42,43]. Estos hallazgos, junto con la evidencia de que el eje BDNF/TrkB/ERK promueve la extrusión de ApoE y la expresión de ABCA1 en células gliales [38], sugieren que una vía de transducción de señales que involucra al eje TrkA/ERK puede explicar parte de los efectos ejercidos por NGF. en nuestro estudio.

Si bien no se observaron cambios en el crecimiento de neuritas, el empleo de medio condicionado U373- y el establecimiento de experimentos de cocultivo indicaron que el aumento de la secreción de ApoE de las células gliales mediada por NGF es determinante para prevenir los resultados perjudiciales inducidos por la oxidación. estrés en las células neuronales. Para inducir la citotoxicidad, empleamos rotenona, un pesticida comúnmente utilizado en la investigación preclínica para inducir especies reactivas de oxígeno (ROS) derivadas de las mitocondrias y la posterior apoptosis [44].

Nuestros resultados resaltan que el NGF estimula la secreción de ApoE por las células gliales, lo cual es necesario para garantizar los efectos neuroprotectores contra la administración de rotenona en células N1E-115 diferenciadas. El papel de la ApoE en la prevención del estrés oxidativo está bien documentado. Por ejemplo, el agotamiento de ApoE en modelos de ratón exacerba la lesión oxidativa en el tejido cerebral [45,46]. En consecuencia, la administración de ApoE exógena protege contra el daño oxidativo irreversible del tratamiento con peróxido de hidrógeno al contrarrestar la toxicidad secundaria del glutamato [18]. Además, las lipoproteínas que contienen ApoE son eficaces para atenuar la apoptosis inducida por la retirada del soporte trófico en las neuronas ganglionares de la retina [47].

En nuestro estudio, el empleo de rotenona sugiere que la neuroprotección mediada por ApoE, promovida por células gliales estimuladas por NGF, puede ser relevante en el contexto de enfermedades neurodegenerativas como la EP. En particular, la rotenona reproduce la degeneración neuronal dopaminérgica similar a la observada en la EP, tanto en modelos animales como en cultivos celulares, incluidas las neuronas derivadas de N1E-115- [48-50]. De manera coherente, nuestros resultados respaldan la evidencia previa que muestra que la ApoE provoca neuroprotección tras la administración de 6-hidroxidopamina (6-OHDA), otra neurotoxina capaz de inducir un fenotipo similar a la EP [51]. En conjunto, nuestro estudio demuestra que el NGF es un modulador crucial del metabolismo del colesterol y la extrusión de ApoE de las células gliales. Lo más importante es que se requiere la mejora de la secreción de ApoE promovida por esta neurotrofina para asegurar la neuroprotección contra la citotoxicidad de la rotenona.

BDNF es la neurotrofina más abundante en el cerebro adulto. A pesar de esta evidencia, se ha demostrado que el NGF puede desempeñar un papel crucial no sólo durante el desarrollo sino también en el sistema nervioso central del adulto. Por ejemplo, el NGF influye en la actividad del hipocampo y, como consecuencia, en la memoria espacial y el aprendizaje [52]. Otros hallazgos sugieren que el NGF exhibe un efecto neuroprotector sobre las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales y que esta actividad puede sentar las bases para nuevos enfoques terapéuticos basados ​​en NGF para la EP [53].

Según esta noción, se ha demostrado que la producción de NGF está profundamente regulada en los astrocitos durante la edad adulta y ejerce acciones moduladoras sobre la neuroinflamación, la lesión cerebral y la neurodegeneración [54-56]. En este contexto, sería interesante evaluar, en futuros estudios, si estos efectos podrían estar mediados, al menos en parte, por la modulación del colesterol glial promovida por el NGF. El presente trabajo presenta algunas limitaciones que deberán ser superadas en las próximas investigaciones experimentales; por ejemplo, sería importante analizar mejor los mecanismos moleculares que vinculan el tratamiento con NGF y el metabolismo del colesterol en las células gliales.

Una comprensión amplia es útil para identificar objetivos moleculares específicos susceptibles de manipulación farmacológica que podrían emplearse en contextos neurodegenerativos. Además, aunque las células U373 y N1E-115 se utilizan ampliamente como líneas celulares manejables para reproducir características astrocíticas y neuronales respectivamente [27–29,57], estos hallazgos deberían confirmarse aún más en cultivos celulares primarios. Aunque se deben hacer más esfuerzos para fortalecer la participación de la señalización de neurotrofinas en la homeostasis del colesterol cerebral, este trabajo demuestra por primera vez que el NGF puede ejercer indirectamente una neuroprotección al influir en el metabolismo del colesterol glial.

4. Material y métodos

4.1. Cultivo de células

Se cultivaron células de neuroblastoma N1E-115 y células U373 con CO2 al 5 % en DMEM con un alto contenido de glucosa (Merck Life Science, Milán, Italia), con suero bovino fetal (FBS) al 10 % (v/v) (Merck Life Science , Milán, Italia) y se añadió una solución de penicilina/estreptomicina.

Para inducir la diferenciación neuronal, se sembraron células N1E-115 con una confluencia del 30% y se cambiaron a DMEM con FBS al 0,5% durante 96 h.

Para inducir la diferenciación neuronal, se sembraron células N1E-115 con una confluencia del 30% y se cambiaron a DMEM con FBS al 0,5% durante 96 h.

Los cocultivos de astrocitos y neuronas se establecieron según el protocolo descrito por Ioannou y colegas, con modificaciones [59]. Se presionaron espaciadores de parafina sobre cubreobjetos para asegurar la adherencia; Utilizamos espaciadores en cubreobjetos neuronales para prevenir eficazmente el daño mecánico cuando las células se colocaron una frente a otra. Luego se esterilizaron los cubreobjetos en etanol y se recubrieron con poli-D-lisina (Merck Life Science, Milán, Italia). Se sembraron N1E-115 en los cubreobjetos recubiertos a la densidad deseada y, una vez listos para el cocultivo, se utilizaron pinzas estériles para levantar los cubreobjetos con neuronas N1E-115 y colocarlos boca abajo en { {10}}pocillos sembrados con astrocitos U373.

Los tratamientos previos en células N1E-115 se llevaron a cabo administrando 0.1 µM de rotenona (Sigma-Aldrich, Milán, Italia, R8875) durante 16 h. Las células de control recibieron DMSO (dilución 1:1000 en medio de cultivo celular) como vehículo. Las células U373 se trataron con NGF (Alomone Labs, Jerusalén, Israel, N-245) a una dosis de 100 ng/ml durante 48 h en todos los experimentos.

4.2. Preparación de lisado y análisis de transferencia Western

Se sonicaron células U373 (ciclo de trabajo 20%, salida 3) en tampón de muestra (Tris-HClisHCl 0,1 que contiene SDS al 10%, cóctel inhibidor de proteasa, pH 6,8) para obtener un lisado total, como se describió anteriormente [ 60,61]. Se añadió tampón Laemmli y las muestras se desnaturalizaron a 95 ◦C durante 5 min. Los extractos de proteínas (veinte microgramos de proteínas) se resolvieron en SDS-PAGE y la transferencia a una membrana de nitrocelulosa se realizó utilizando un sistema de transferencia turbo trans-blot (Biorad Laboratories, Milán, Italia), como se informó anteriormente [62].

Posteriormente, la membrana se incubó a temperatura ambiente durante 1 h con leche en polvo descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris (Tris-HCl 25 mM, NaCl 138 mM, KCl 27 mM, 0.05% Tween{ {10}}, pH 6,8) y se sondaron durante la noche a 4 ◦C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-271708, dilución 1:500), anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-118, dilución 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-8984 , dilución 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab30682, dilución 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab242315, dilución 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab30532, dilución 1:500),anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, EE. UU., NB400-148, dilución 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-58219, dilución 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-53570, dilución 1 :400), antivinculina (SigmaAldrich, Milán, Italia, V9264, dilución 1:10 000) y anti- -actina (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-47778, dilución 1 :10.000).

Las membranas se incubaron sucesivamente durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios anti-ratón o anti-conejo conjugados con HRP (Bio-Rad Laboratories, Milán, Italia). Los anticuerpos unidos a proteínas se visualizaron mediante transferencia Western ECL de claridad (Bio-Rad Laboratories, Milán, Italia, n.º 1705061) y la quimioluminiscencia se registró a través del sistema ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Milán, Italia). Luego se llevó a cabo el análisis densitométrico derivado de transferencias Western utilizando el software ImageJ versión 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.) para Windows. Se utilizaron vinculina o actina como proteínas de mantenimiento, que sirvieron como controles internos para la carga de proteínas. Los cálculos densitométricos se obtuvieron como unidades arbitrarias, derivadas de la relación entre la intensidad de la banda proteica y la proteína constitutiva respectiva.

4.3. Tinción con aceite rojo O

Se sembraron células U373 en cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) en placas de pocillos 6- y se realizó la tinción con rojo aceite O como se informó anteriormente [60]. Brevemente, las células se fijaron en paraformaldehído (solución al 4%) durante 10 minutos y se enjuagaron suavemente tres veces con PBS. Las células fijadas se incubaron con isopropanol al 60% durante 5 minutos y luego se lavaron con agua destilada. Posteriormente, las células se sondaron con 1 ml de solución de trabajo Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) durante 15 minutos a temperatura ambiente colocando la placa de pocillos 6- en un agitador rotador orbital. Después de la incubación con la solución colorante, los pocillos se lavaron tres veces con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

Finalmente, los cubreobjetos se montaron con medio de montaje Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182) y se visualizó la autofluorescencia de Oil red O mediante microscopía confocal (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Alemania). Las imágenes se capturaron utilizando Leica TCS SP8 equipado con un aumento de 63 × y el software Leica LAS X (Milán, Italia). La cuantificación de la tinción con rojo aceite O se realizó a través del software ImageJ para Windows y se calculó como intensidad de fluorescencia media por área celular.
4.4. Tinción filipina

La tinción con filipina se llevó a cabo utilizando el complejo de filipina (Sigma-Aldrich, F9765). La solución madre de filipina (10 mg/ml en PBS) siempre se preparó inmediatamente antes de su uso. Las células se fijaron en paraformaldehído (solución al 4%) durante 10 minutos y se lavaron con PBS. Luego se tiñeron U373 con 1 ml de solución de trabajo Filipin (0,05 mg/ml en PBS) durante 1 h en la oscuridad, a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con PBS y los cubreobjetos se montaron con medio de montaje Fluoroshield y se analizaron inmediatamente mediante microscopía confocal utilizando un juego de filtros UV (excitación de 340 a 380 nm). Las imágenes se adquirieron con un aumento de 40X. La cuantificación de filipina se calculó como intensidad de fluorescencia media por área celular utilizando el software ImageJ para Windows.

4.5. Cuantificación del colesterol

La cuantificación del colesterol se realizó mediante un ensayo colorimétrico (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Milán, Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante.

4.6. ELISA
Los niveles de ApoE en el medio de cultivo se evaluaron utilizando el kit ELISA de apolipoproteína E humana (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab108813), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4.7. inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia de células U373 se ejecutó como se describió anteriormente [60]. U373 se fijaron en paraformaldehído (4% en PBS) y se sondaron durante la noche con anticuerpos primarios: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-271708, dilución 1:100) y anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-118, dilución 1:100). Posteriormente, las células se incubaron durante 1 h con el anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU., A28180) y con el anticuerpo secundario de cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. , A27034). Se realizó tinción DAPI para visualizar los núcleos y finalmente se montaron cubreobjetos con un medio de montaje Fluoroshield. Las muestras se analizaron mediante microscopía confocal, como se describe anteriormente.

4.8. Silenciamiento ApoE

El silenciamiento del ARNm de ApoE se realizó en células U373 utilizando ARNip de ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-29708) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección se instaló en una placa de cultivo de tejido 6-pocillo donde se sembraron 100,000 células por pocillo en medio de crecimiento libre de antibióticos DMEM suplementado con 10 % de FBS durante 24 h. Para cada pocillo, se añadió medio de transfección de ARNip (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., sc-36868) ​​a la solución de reacción de transfección de ARNip, preparada utilizando dúplex de ARNip y reactivo de transfección de ARNip (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, Estados Unidos, sc29528). Luego, las células se lavaron una vez con medio de transfección de ARNip y se cubrieron con la mezcla de transfección preparada previamente. Posteriormente, la placa de cultivo se incubó durante 7 h a 37 ◦C en una incubadora con 5% de CO2.

Se añadió medio de crecimiento DMEM con 20 % de FBS y antibióticos (2- veces la concentración normal) a la mezcla de transfección en cada pocillo en una proporción de 1:1. Las células se incubaron durante 18 h y luego se descargó el medio y se reemplazó con medio de crecimiento normal nuevo; 24 h después de este último paso, las células estaban listas para usarse en experimentos adicionales. La eficacia del silenciamiento de ApoE se evaluó mediante RT-qPCR en células U373 y mediante ELISA en el sobrenadante celular; El ARNip de ApoE previno eficientemente la inducción de ApoE por NGF en comparación con el ARNip codificado (ARNm de ApoE: disminución del 83 %; ELISA de ApoE: disminución del 78 %). En particular, la expresión de ApoE tras el silenciamiento de ARNip fue inferior a los niveles de expresión basal observados en el control U373 (ARNm de ApoE: disminución del 72 %; ELISA de ApoE: disminución del 58 %) (Figura S 3A, B).

4.9. Extracción de ARN y PCR en tiempo real

El análisis de ARNm se realizó como se informó anteriormente [22,63]. Brevemente, se extrajo el ARN total de las células U373 con el reactivo TRI (Merck Life Science, Milán, Italia) según las instrucciones del fabricante. Se realizó un tratamiento con ADNasa (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milán, Italia) y luego se purificó el ARN utilizando un kit de limpieza de ARN (Zymo, Italia). El ARN se transcribió sucesivamente de forma inversa a ADNc a través de un kit celular de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Bio-System, Foster City, CA, EE. UU.) y se utilizó para el análisis de qPCR.

Los cebadores utilizados en qRT-PCR para apoE fueron: 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 e inverso 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Los cebadores utilizados en qRT-PCR para gapdh (elegido como gen de referencia) fueron: directo 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 e inverso 50 -ACCACCCTGTGCTGTAGCCA-30. La producción del amplicón correcto se evaluó mediante la evaluación de la curva de fusión. Cada muestra biológica se analizó por triplicado con el reactivo SYBR green IQ (Bio-Rad Laboratories, Milán, Italia) y utilizando el sistema de detección CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Milán, Italia).

4.10. Evaluación cuantitativa de la morfología neuronal.

La morfología neuronal en las células N1E-115 se estimó mediante la captura de imágenes con un microscopio invertido. El análisis morfométrico se llevó a cabo a través del software ImageJ para Windows, y se estimó el número de células totales (expresado como una variación porcentual del control), la longitud promedio de las neuritas (expresada como un porcentaje del control) y las células portadoras de neuritas. Para las células portadoras de neuritas, el porcentaje se calculó dividiendo el número de células diferenciadas por el número total de células por campo. N1E-115 fueron devas diferenciados cuando tenían al menos una neurita a con longitud igual o mayor que el diámetro del soma. La evaluación morfológica se realizó en al menos cinco experimentos independientes, en los que se analizaron al menos tres imágenes.

4.11. Análisis estadístico

Todos los resultados presentados en este estudio se expresaron como media ± DE (desviación estándar). La distribución normal de los datos se verificó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Cuando se compararon dos grupos experimentales, se aplicaron pruebas no apareadas. Sin embargo, cuando se compararon tres o más grupos Para las comparaciones se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey. En cuanto a los experimentos con rotenona, donde estaban presentes dos variables, se utilizó un ANOVA de dos vías seguido de una prueba post hoc de Bonferroni. Se consideró estadísticamente diferente p < 0.05. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, EE. UU.) para Windows.

Contribuciones de autor:

Conceptualización, Maestría; metodología, MS y MC; validación, MS y MC; análisis formal, MS, MC, DP y MP; investigación, MC, NM, LL, MP y DP; recursos, MS y VP; curación de datos, MS y MC; redacción: preparación del borrador original, MS y MC; redacción: revisión y edición, MP, LL, DP, NM y VP; visualización, MS, MC y MP; supervisión, EM; administración de proyectos, maestría; adquisición de financiación, MS Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:

Esta investigación fue financiada por Fondos para la Investigación Departamental 2021 (Universidad de Molise) para MS y por la convocatoria de subvenciones de la Fundación Jerome Lejeune sesión 2021a, #2043 para MS.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:

No aplica.

Declaración de consentimiento informado:

No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:

No aplica.

Expresiones de gratitud:

Agradecemos a Claudia Tonini por la ayuda con el ensayo de colesterol.

Conflictos de interés:

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Referencias

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; Fogelman, AM Colesterol cerebral: una larga vida secreta detrás de una barrera. Arterioscler. Trombo. Vasc. Biol. 2004, 24, 806–815. [Referencia cruzada] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Las neurotrofinas como reguladores clave del metabolismo celular: implicaciones para la homeostasis del colesterol. En t. J. Mol. Ciencia. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Múltiples mecanismos median la sinaptogénesis inducida por el colesterol en una neurona del SNC. Mol. Celúla. Neurociencias. 2005, 29, 190–201. [Referencia cruzada] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Expansión de la membrana plasmática: la tarea hercúlea de una neurona. Nat. Rev. Neurociencias. 2009, 10, 251–261. [Referencia cruzada]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brugger, B.; Ringler, P.; et al. Anatomía molecular de un orgánulo traficante. Celda 2006, 127, 831–846. [Referencia cruzada] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. El factor neurotrófico derivado del cerebro regula el metabolismo del colesterol para el desarrollo de sinapsis. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [Referencia cruzada]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trápani, L.; Pallottini, V. Fallo de la homeostasis del colesterol en el cerebro: implicaciones para la disfunción sináptica y el deterioro cognitivo. actual. Medicina. Química. 2014, 21, 2788–2802. [Referencia cruzada] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM Regulación de las tasas de síntesis de colesterol in vivo en el hígado y la carcasa de la rata medidas con [3H]agua. J. Res de lípidos. 1980, 21, 364–376. [Referencia cruzada]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Metabolismo del colesterol en neuronas y astrocitos. Prog. Res. lipídica. 2011, 50, 357–371. [Referencia cruzada]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Marcadas diferencias en la síntesis de colesterol entre neuronas y células gliales de ratas posnatales. J. Neuroquímica. 2009, 109, 125-134. [Referencia cruzada]

11. Oram, JF; Heinecke, JW Transportador A1 de casete de unión a ATP: un exportador de colesterol celular que protege contra las enfermedades cardiovasculares. Fisiol. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [Referencia cruzada]

12. Pfrieger, FW Subcontratación en el cerebro: ¿Dependen las neuronas del suministro de colesterol por parte de los astrocitos? BioEssays 2003, 25, 72–78. [Referencia cruzada]

13. Christopherson, KS; Ulian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; Demonios, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Las trombospondinas son proteínas secretadas por astrocitos que promueven la sinaptogénesis del SNC. Celda 2005, 120, 421–433. [Referencia cruzada]

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