Un nuevo ensayo de biomarcadores múltiples para el control cuantitativo no invasivo de la lesión renal
Feb 22, 2022
dibujó watson1, Joshua YC Yang1,2,3y otros
Resumen:El estándar actual de medidas de atención parariñónfunción, la proteinuria y la creatinina sérica (SCr) son malos predictores de la etapa tempranariñónenfermedad. Medidas que pueden detectarcrónicoriñónenfermedaden sus primeras etapas son necesarios para permitir la intervención terapéutica y reducir los resultados adversos decrónicoriñónenfermedad. Hemos desarrollado el Kidney Injury Test (KIT) y un novedoso KIT Score basado en la medición compuesta y la validación de múltiples biomarcadores en un conjunto único de 397 muestras de orina. La prueba se realiza en muestras de orina que no requieren procesamiento en el sitio de recolección y sin secuenciación o amplificación objetivo. Intentamos verificar que la prueba KIT predefinida, la puntuación KIT y los umbrales clínicos se correlacionan con los valores establecidos.crónicoriñónenfermedad(ERC) y puede proporcionar información predictiva sobre el estado de la lesión renal temprana más allá de la proteinuria y las mediciones de la función renal por sí solas. Se realizaron análisis estadísticos de seis marcadores de ADN, proteínas y metabolitos en un subconjunto de muestras de orina residual conERCque cumplió con los controles de calidad de rendimiento del ensayo de pacientes que asistieron a los laboratorios clínicos de la Universidad de California, San Francisco (UCSF) como parte de un estudio prospectivo en curso aprobado por el IRB. Los criterios de inclusión incluyeron una selección de pacientes con confirmaciónERCy controles sanos normales; los criterios de exclusión incluyeron información incompleta o faltante para la clasificación de muestras, demoras logísticas en el transporte/procesamiento de muestras de orina o bajo volumen de muestras y lesión renal aguda. Regresión logística multivariada deriñónlesiónSe utilizaron estadísticas de estado y razón de verosimilitud para evaluar la contribución de la puntuación KIT para la predicción deriñónlesiónel estado y la etapa de la ERC, así como evaluar la contribución potencial de la puntuación KIT para la detección de la ERC en etapa tempranaERCmás allá de las medidas tradicionales de la función renal. Las muestras de orina fueron procesadas por una inmunosonda patentada para medir el ADN libre de células (cfDNA), cfDNA metilado, clusterina, CXCL10, proteína total y creatinina. El puntaje KIT y el grupo de riesgo de puntaje KIT estratificado (alto versus bajo) tuvieron una sensibilidad y especificidad para la detección del estado de lesión renal (sano oERC) de 97,3 por ciento (IC del 95 por ciento: 94,6–99,3 por ciento) y 94,1 por ciento (IC del 95 por ciento: 82,3–100 por ciento). Además, en pacientes con función renal normal (tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) > 90), la puntuación KIT identifica claramente a aquellos con factores de riesgo predisponentes paraERC, que no pudo ser detectado por eGFR o proteinuria (p < 0.001).="" el="" puntaje="" kit="" descubre="" una="" carga="" de="" lesión="" renal="" que="" aún="" puede="" no="" reconocerse="" por="" completo,="" lo="" que="" abre="" la="" puerta="" para="" una="" detección,="" intervención="" y="" preservación="" más="" tempranas="" de="" la="" función="">
Palabras clave:Ensayo KIT; crónicoriñónenfermedad; biomarcador; no invasivo; orina; eGFR; ADNcf
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1. Introducción
Crónicoriñónenfermedad(ERC) es un problema de salud pública mundial, con una carga global de 850 millones de personas.ERCahora se reconoce como una "epidemia oculta", ya que la mayoría de los pacientes con las primeras etapas de la ERC (~11 por ciento de la población adulta mundial) no son reconocidos, ya que no tienen síntomas y no son conscientes de su mayor riesgo de problemas cardíacos, infecciones , hospitalización e insuficiencia renal. Por lo tanto, la ERC a menudo no se considera un problema de salud importante, a pesar de que afecta al doble de diabéticos (422 millones) y a más de 20 veces el número de personas con cáncer (42 millones) o VIH/SIDA (36,7 millones).
CKD is defined as a reduced renal reserve, persisting for >3 meses y/o un diagnóstico previo de una condición con un riesgo conocido deriñóndamage [1]. CKD is defined in a five-stage classification system for the assessment of kidney injury as patients advance towards the need for dialysis or transplantation [2]. The current standard of care tests, the blood-based serum creatinine (SCr) assay (and its use to calculate the estimated glomerular filtration rate or eGFR [3]) and protein in the urine, detect CKD 3–5 (eGFR of s60 mL/min/1.73 m2 of body surface area). However, most cases of CKD 1–2 (CKD >60 ml/min/1,73 m2 de superficie corporal) pasan desapercibidos. La eGFR tiene poca sensibilidad para la detección temprana de la ERC, ya que la redundancia inherente de la reserva renal enmascara el aumento temprano de la CrS. Las biopsias de riñón, a menudo desencadenadas con estadios más avanzados de la ERC, tienen valor para evaluar la patología, pero son invasivas, costosas [4] y no se pueden utilizar para el seguimiento en serie de la progresión de la ERC.
Múltiples desencadenantes y factores de riesgo inician la cascada deriñóndaños enERC, con progresión a insuficiencia renal (ERC 5). Hay más de 10 millones de personas en todo el mundo que necesitan terapia de rescate renal con apoyo de por vida de diálisis o trasplante de riñón. Aunque la diálisis y el trasplante proporcionan un reemplazo funcional del riñón, ambos aún se ven obstaculizados por diversos impactos adversos en la morbilidad y mortalidad de los pacientes. También hay un impacto marcado de la ERC en otros sistemas de órganos del cuerpo;ERClos pacientes tienen un mayor riesgo de infecciones, muertes cardiovasculares y cáncer [5].
La detección temprana del daño renal es crucial, ya que el tratamiento enERC1–2 puede resultar en la preservación renal al revertir o ralentizar la progresión del daño renal [6]. Actualmente, los análisis de orina disponibles no pueden detectar niveles bajos de lesión renal [7-14] y se han evaluado principalmente en la lesión renal aguda (IRA), con poca discriminación para la ERC [9]. Por lo tanto, existe una necesidad crítica insatisfecha de desarrollar diagnósticos sensibles, cuantitativos y no invasivos para detectar la ERC 1–3. La detección temprana y el tratamiento temprano de la ERC mitigarían la carga global de la enfermedad y reducirían la carga financiera masiva en los presupuestos nacionales de atención de la salud [15–21].
The primary aim of this study was to perform an assessment of multiple novels and known urine biomarker measurements to conduct an inexpensive, portable assay, called the Kidney Injury Test (KIT) in consecutive patients presenting with CKD at a large tertiary health care system, and develop and independently validate a quantitative KIT Score to reflect the diferent CKD stages. The KIT assay performance was also directly compared to the current standard of care tests (eGFR and proteinuria). A secondary aim was to explore the accuracy of the KIT assay to detect and quantitate kidney injury in CKD 1–2, i.e., subjects with normal eGFR (>60), pero con factores de riesgo predisponentes para la ERC. Este informe describe el proceso de selección de biomarcadores, desarrollo de algoritmos y validación independiente de la puntuación KIT como un diagnóstico novedoso para la evaluación y cuantificación de la etapa temprana y tardía.riñóndaño.
2. Sección Experimental
2.1. Selección de pacientes
Se recolectó orina residual aleatoria de 1169 pacientes secuenciales de los laboratorios clínicos de la Universidad de California, San Francisco (UCSF), durante 3 meses, desde octubre de 2016 hasta enero de 2017, como parte de las pruebas clínicas de rutina en Parnassus y Mission Bay. laboratorios clínicos del campus. La selección de muestras para un diagnóstico de ERC se enriqueció mediante la selección de muestras de orina obtenidas de las clínicas de nefrología, diabetes o cardiología de la UCSF. Para facilitar el poder estadístico, el estudio se enriqueció para pacientes con mayor riesgo de enfermedad renal, utilizando los siguientes criterios: el paciente tenía un diagnóstico confirmado de ERC (código ICD10 N18 [22]), ningún diagnóstico de ERC pero un diagnóstico actual de diabetes , hipertensión o enfermedad autoinmune, sin ERC pero con antecedentes familiares positivos de ERC, sin ERC pero mayores de 60 años o pertenecientes a una minoría étnica. Los pacientes con AKI no se incluyeron en este estudio, con la siguiente justificación: (1) este primer estudio sobre KIT se centra en el desarrollo y validación de las métricas cuantitativas y funcionales del puntaje KIT en un continuo crónico de progresión de la enfermedad renal. AKI tiene una trayectoria diferente con inicio y resolución agudos; (2) AKI puede tener una resolución completa o incompleta de la lesión, por lo tanto, la reducción de la puntuación KIT después de la resolución de AKI se volverá clínicamente interpretable cuando los rangos de puntuación KIT se hayan establecido en este documento para diferentes etapas funcionales de CKD; (3) La LRA es una de las causas del riesgo de ERC, pero la mayoría de los casos de ERC, como la diabetes y la hipertensión, no comienzan con la LRA. Se planea un estudio de KIT Score en AKI como estudio de seguimiento.
Para el desarrollo de la puntuación KIT, la causa relevante de la ERC o el factor de riesgo predisponente para la ERC se capturó de los registros de salud electrónicos (EHR), junto con las variables demográficas y la SCr, para permitir el cálculo de la eGFR [23]. Para cada paciente, se confirmó la presencia y la causa de la enfermedad renal mediante una revisión clínica de los registros médicos y de laboratorio. Las causas más comunes de ERC en esta cohorte fueron: enfermedades sistémicas inmunomediadas que pueden causar lesión renal (como nefritis lúpica, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren), hipertensión, diabetes (tipo 1 y 2), enfermedad glomerular (estos casos fueron biopsia confirmada con nefropatía IgA, glomerulonefritis membranoproliferativa o glomeruloesclerosis focal y segmentaria) y uropatía obstructiva (vejiga neurógena, válvulas de uretra posterior e hidronefrosis). En la cohorte de pacientes con ERC, el 74,8 % de los pacientes tenían 2 o más diagnósticos clínicos que serían relevantes para el desarrollo y la progresión de la ERC, mientras que el 13,3 % de los pacientes tenían diabetes e hipertensión como factores de riesgo de lesión renal dual en ausencia de un diagnóstico clínico de ERC , reflejo de la alta prevalencia de estas comorbilidades en la población general. No se filtró la causa de la ERC y se capturaron todas las causas contribuyentes de la ERC.
To avoid degradation of the biomarkers in the KIT assay, urine samples were either processed within an hour of collection or stored at 4 C and processed within 24 h. Samples were discarded or not included for analysis in this study if the sample volume was less than 2 mL, there were insufficient data to confirm patient CKD diagnosis, or there was a>Retraso de 24 h en el procesamiento de la muestra por motivos logísticos. Después del proceso de filtrado anterior, tuvimos una selección final de 343 muestras de orina únicas de 343 pacientes. También obtuvimos muestras de orina adicionales de 54 controles sanos seleccionados de voluntarios que tenían buena salud, con CrS normal, sin proteinuria y sin factores de riesgo de ERC identificables. El estudio se adhirió a las Declaraciones de Helsinki y Estambul y fue aprobado por la junta de revisión institucional de UCSF (IRB 16-21108) y el IRB renunció al requisito de consentimiento informado.
2.2. Métodos de ensayo de KIT
2.2.1. Procesamiento de muestras
Las muestras de orina se recogieron en recipientes estériles (recogida limpia, vaciado a mitad del chorro), independientemente de la hematuria o proteinuria micro o macroscópica. Las muestras de orina se centrifugaron a 2000 × g durante 30 min a 4 oC. El sobrenadante se separó del sedimento de orina que contenía células y residuos celulares. El pH del sobrenadante se ajustó a 7,0 usando Tris-HCl y se almacenó a _80oC en el biorrepositorio de UCSF hasta su posterior análisis.
2.2.2. KIT Biomarcadores
KIT ingresa mediciones normalizadas de 6 biomarcadores primarios de orina. El primer biomarcador fue el ADN libre de células (cfDNA): como una medida de la carga apoptótica total de la lesión renal [24], medida por una inmunosonda quimioluminiscente complementaria patentada de oligonucleótido biotinilado en 5' para apuntar específicamente a los fragmentos de cfDNA en la lesión renal [25]. Este enfoque supera las limitaciones del lento procesamiento de muestras, la costosa amplificación por PCR [26], la detección de SNP ([27,28] o los métodos de secuenciación de ADN [29], que de otro modo se emplean para medir cfDNA en sangre [27,30]. Los marcadores medidos por ELISA incluyen cfDNA metilado (m-cfDNA) para refinar la proporción de cfDNA que puede ser más relevante para la lesión del parénquima renal [31,32]; CXCL10, como marcador de inflamación [33–37]; clusterina, como un marcador de lesión tubular renal [38,39], proteína total, como marcador tardío de lesión glomerular [40,41], y creatinina, como marcador de normalización, ya que puede verse afectado por la masa corporal, la nutrición y/o la hidratación y utilizarse para evitar la necesidad de una recolección de orina cronometrada [42,43].
2.3. Análisis estadístico
2.3.1. Desarrollo de la puntuación del KIT
Se utilizó un muestreo aleatorio para dividir la 397-cohorte de pacientes en un conjunto de entrenamiento (n=233, con 37 controles sanos), estratificado por estado de lesión renal. Se utilizó un modelo de bosque aleatorio para identificar relaciones entre los diferentes marcadores para la detección de ERC con alta sensibilidad. Los modelos predictivos se entrenaron utilizando métodos estadísticos y de aprendizaje automático para el desarrollo del algoritmo KIT Score, en los seis biomarcadores de proteínas y ADN seleccionados, y la partición multidimensional de las mediciones de estos ensayos se basó en umbrales clínicos identificados mediante la incorporación de la SCr y el riesgo conocido adicional. variables para la ERC como la raza, el género y la edad. Finalmente, se desarrolló un modelo lineal simple que incorporaba la partición resultante en el puntaje KIT con un umbral adicional para la evaluación del riesgo bajo y alto de ERC.
2.3.2. Validación de puntuación KIT
Posteriormente, se utilizó un subconjunto de validación independiente de 164 pacientes, con 17 controles sanos, para validar prospectivamente el ensayo KIT preespecificado y la puntuación KIT. Se utilizó la regresión logística para comparar el modelo (completo) con las pruebas estándar de atención actuales, proteína en orina sola y eGFR. Se consideró significativo un valor de p < 0.01="" para="" la="" prueba="" de="" razón="" de="" verosimilitud="" correspondiente.="" se="" realizaron="" análisis="" de="" regresión="" logística="" para="" evaluar="" la="" precisión="" del="" umbral="" de="" puntuación="" kit="" preespecificado="" para="" los="" grupos="" de="" riesgo="" de="" puntuación="" kit="" categóricos="" (bajo="" y="" alto).="" se="" calcularon="" la="" sensibilidad="" y="" la="" especificidad="" de="" la="" puntuación="" kit="" cuantitativa="" y="" cualitativa="" resultante,="" junto="" con="" los="" intervalos="" de="" confianza="" del="" 95="" por="">
T-test and logistic regression were used to compare the pre-defined KIT Score and model patient status (individuals predisposed to CKD versus healthy subjects), to assess its ability to distinguish subjects with early stages of CKD (eGFR 60–90, CKD 2) and normal eGFR but with predisposing risk factors for developing kidney damage (>90, CKD 1), de voluntarios sanos (eGFR > 90) que no tienen factores de riesgo predisponentes conocidos. Se consideró significativo un valor de p <>
3. Resultados
De los 1169 pacientes reclutados y las muestras de orina recolectadas, 201 muestras cumplieron con los criterios de exclusión de bajo volumen de orina y se clasificaron para análisis posteriores, dejando 968 pacientes (datos demográficos en la Tabla 1). La distribución de proteinuria en estos 968 pacientes (0 a 5469,73; mediana (IQR) de 4,69 (0–39,11) mg/mmol) y el rango de eGFR (calculado para todos los pacientes con ERC [23] (Figura 1C) ) destaca que capturamos el espectro de la enfermedad CKD (Figura 1A). De esta cohorte, 397 pacientes y muestras únicos sobrevivieron a los criterios de exclusión (ver Métodos). Las etiologías de su lesión renal abarcaron una amplia y múltiple gama de enfermedades, con hipertensión como causa contribuyente para el 42 por ciento de los pacientes (Figura 1B). Más del 60 por ciento de los pacientes tenían más de una causa contribuyente a su lesión renal. Dado que esta es una realidad para la mayoría de los pacientes con CKD, particularmente a medida que avanzan a etapas posteriores de CKD, se modeló el puntaje KIT para detectar daño renal independientemente de la causa subyacente. A pesar de que la proteinuria es el estándar de oro actual para la evaluación no invasiva de la lesión renal, no hubo correlación entre la TFGe y el cociente proteína/creatinina en orina (R2=00,0087) y, como han demostrado otros investigadores [44 ], la proteinuria fue pobre en la categorización de las etapas de la ERC (Figura 2).
El objetivo principal de este estudio fue desarrollar una escala de puntuación KIT compuesta de {{0}} (riesgo bajo) a 100 (riesgo alto) y evaluar prospectivamente la capacidad de una puntuación KIT cuantitativa para la detección de lesión renal. con un alto grado de sensibilidad y especificidad. Mostramos que, aunque las medidas actuales de la función renal (eGFR y proteinuria) predicen la ERC en etapa tardía (Tabla 2), la escala cuantitativa de la puntuación KIT de 0 (riesgo más bajo) a 100 (riesgo más alto) proporciona información predictiva
sobre el estado de la lesión renal por encima y más allá de la proteinuria y la función renal solas (razón de probabilidad x {{0}}.507, valor p < 0.0001),="" y="" supera="" las="" pruebas="" estándar="" de="" atención="" actuales="" (tabla="" 3).="" la="" creatinina="" en="" orina="" se="" utiliza="" con="" fines="" de="" normalización="" en="" el="" algoritmo="" kit="" y="" controla="" las="" variaciones="" diurnas="" y="" de="" hidratación="" (obviando="" así="" la="" necesidad="" de="" cualquier="" muestreo="" de="" orina="" cronometrado)="" y="" no="" fue="" significativa="" para="" el="" estadio="" de="" erc="" en="" los="" análisis="" multivariados="" (valor="" p="0).">
We also developed a qualitative KIT Score, an approach that can have important implications for population kidney risk assessment. A pre-defined risk threshold of 18.5 was established in the training data, allowing the separation of the KIT Scores into low (s18.5) and high risk (>18.5) grupos de lesión renal. Esto se confirmó en el conjunto de pruebas para proporcionar información predictiva sobre el estado de la lesión renal más allá de la proteinuria y la TFGe (razón de probabilidad fue x=44.244, valor p <>
La sensibilidad y la especificidad estimadas de la puntuación KIT para la detección de la ERC es del 97,3 % (IC del 95 % de arranque: 94,6, 99,3 %) y del 94,1 % (IC del 95 % de arranque: 82,3, 100 %), respectivamente. Por el contrario, la sensibilidad y especificidad de la proteinuria fue del 46,9 por ciento (IC del 95 por ciento de arranque: 38,8, 55,8 por ciento) y del 88,2 por ciento (IC del 95 por ciento de arranque: 70,6, 100 por ciento), respectivamente, para las mismas muestras. De manera similar, la sensibilidad de SCr fue del 65,6 por ciento (IC del 95 por ciento de arranque: 57,4, 73,8 por ciento). La estimación de los valores predictivos negativos y positivos de la puntuación KIT depende de la tasa de prevalencia de la enfermedad, por lo que la tasa de prevalencia de la hipertensión se puede utilizar como ejemplo. La prevalencia de la hipertensión en la población general de los EE. UU. es de aproximadamente el 33 por ciento. En consecuencia, el valor predictivo positivo y negativo estimado de la puntuación KIT cuantitativa para la hipertensión sería ~89,1 por ciento y 98,2 por ciento, respectivamente.
Mostramos la contribución de los biomarcadores individuales al puntaje KIT a continuación (Tabla 4). La abundancia de cfDNA en la orina fue muy variable entre las diferentes categorías de enfermedad renal y no se correlacionó de forma independiente con el estadio de la ERC. Las correlaciones entre los biomarcadores individuales fueron pequeñas (la mayor correlación R2=0.14 fue entre eGFR y proteína), lo que sugiere que cada uno de los biomarcadores proporciona información independiente para la predicción del estado de lesión renal. Los análisis de componentes principales (PCA) (Figura 2B) aclaran la relación de las combinaciones lineales independientes de los biomarcadores con la variabilidad total en las mediciones del ensayo y resaltan la importante contribución de m-cfDNA, cf-DNA y CXCL10 como un valor independiente en el generación de la puntuación KIT compuesta. La clusterina fue el único biomarcador del estado de lesión renal que no fue significativo en los análisis multivariados (valor de p=0.1671). Estos factores resaltan que, a pesar de los datos publicados sobre las correlaciones entre la abundancia de cfDNA en sangre y la disfunción renal [27,28], el cfDNA en orina en estos entornos no sería suficiente por sí solo, y es valioso incluir múltiples biomarcadores para desarrollar la puntuación KIT compuesta para Evaluación de la ERC.
CXCL10 is a key inflammatory cytokine dysregulated in immune-mediated renal injury [45–51]. To evaluate where CXCL10 identifies a specific cause of CKD, such as immune-mediated causes of renal injury from systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-positive vasculitis, we evaluated which CKD categories had a high abundance of urinary CXCL10. Interestingly, only ~30% of the immune-mediated cohort had very high CXCL10 values (>100 pg/ml), mientras que, en muchas muestras de lesiones renales inmunomediadas, estos valores fueron bajos y pueden reflejar la remisión de la enfermedad o la exposición a la inmunoterapia. Para nuestra sorpresa, aproximadamente el 30 por ciento de las cohortes hipertensas y diabéticas también tenían niveles elevados de CXCL10 en orina, sin ninguna enfermedad sistémica inmunomediada identificada. No hubo asociación entre los niveles urinarios de CXCL10 y el estadio de ERC.
Figure 2C displays the KIT Score, shown here as a function of CKD stage (based on the eGFR) and matched with presence (red dots) or absence (black dots) of proteinuria (threshold cut of urine protein/creatinine ratio of >0.2). The healthy controls are marked in green and are shown in a pre-CKD 1 or CKD 0 stage where the eGFR is >90 ml/min/1,73 m2 como en ERC 1, sin proteinuria ni riesgo identificado de lesión renal. Es importante tener en cuenta que ~15 por ciento de los controles sanos evaluados aquí tienen una leve elevación en su puntuación KIT (justo por encima del umbral de alto riesgo de 18,5). En esta etapa del estudio, no podemos identificar si estos controles sanos con puntajes KIT más altos tienen factores de riesgo de daño renal no detectados, ya que todos los sujetos no fueron identificados.
La Tabla 5 muestra un desglose de la puntuación KIT media por etapa de ERC y para voluntarios sanos, y observamos una trayectoria significativa de aumento de la puntuación KIT a medida que avanza la etapa de ERC. La puntuación KIT puede distinguir fácilmente la ERC 1 y 2 (28,9; IC del 95 %: 27,9, 29,9) de voluntarios sanos sin ERC (11,0; IC del 95 %: 9,5, 12,6); valor p < 0.00001).="" cuando="" se="" compara="" con="" controles="" sanos,="" existe="" una="" fuerte="" asociación="" entre="" el="" kit="" score="" y="" la="" predisposición="" a="" la="" lesión="" renal,="" incluso="" en="" sujetos="" con="" función="" renal="" normal="" en="" erc="" 1="" (tfge=""> 90), con una razón de probabilidad de x=148.4 (valor p de LR < 0,0001)="" y="" un="" umbral="" de="" ensayo="" de="" 18,5="" tenían="" una="" sensibilidad="" y="" especificidad="" de="" 92,9="" (ic="" del="" 95="" %="" exacto:="" 87,0="" %,="" 96,7="" %)="" y="" 94,4="" %="" (ic="" del="" 95="" %="" exacto:="" 84,6,="" 98,8="" %),="" respectivamente.="" este="" mismo="" efecto="" se="" amplificó="" aún="" más="" para="" la="" capacidad="" de="" los="" ensayos="" kit="" de="" detectar="" tanto="" la="" erc="" 1="" como="" la="" 2,="" con="" una="" razón="" de="" probabilidad="" x="196.5" (valor="" p="" de="" lr="">< 0,0001),="">
the >18.5 KIT Score threshold having a sensitivity of 95.8% (exact 95% CI: 92.2, 98.1%) for early CKD detection. A total of 60% of patients in CKD 1 have elevated KIT Scores >18,5, a pesar de tener una función renal "normal" y sin proteinuria. Estos son exactamente los pacientes objetivo que queremos capturar con el ensayo KIT, ya que su ERC en etapa temprana no sería detectada por las pruebas de atención estándar actuales. De hecho, el puntaje KIT identifica al 92 por ciento de los pacientes en CKD 1 que no tienen proteinuria con lesión renal temprana. En CKD 2-3, aunque aproximadamente el 60 por ciento de los pacientes no tienen proteinuria, la puntuación KIT detecta a todos los pacientes como de alto riesgo y proporciona diferentes medidas cuantitativas para la carga de lesiones de CKD de cada paciente. En CKD 4-5, la proteinuria y las puntuaciones KIT son más concordantes a medida que el daño renal es avanzado y la proteinuria se reconoce como un marcador tardío de daño renal.
Por lo tanto, estos resultados colectivos demuestran claramente que el ensayo logra sus objetivos primarios y secundarios de predecir la lesión renal con mayor sensibilidad que las pruebas estándar de atención actuales (eGFR, SCr, proteinuria) y, a diferencia de nuestros ensayos clínicos actuales, el puntaje KIT puede identificar con precisión las etapas muy tempranas de la ERC en las pantallas de población.
4. Discusión
La fuerza impulsora detrás del desarrollo del ensayo KIT y la puntuación KIT fue el reconocimiento de la enorme y creciente carga de lesión renal no reconocida [52], agravada por la debilidad de las pruebas estándar de atención actuales [53] para descubrir el carga real y "oculta" de la enfermedad renal. El seguimiento del daño renal en individuos mediante muestras de orina siempre ha sido un objetivo muy deseable, ya que la señal biológica de la orina puede proporcionar una ventana muy informativa sobre la salud del riñón. Sin embargo, una prueba de orina para predecir la lesión renal, independientemente de la causa subyacente, sigue siendo una necesidad clínicamente insatisfecha y un desafío bioquímico para ejecutar, ya que hay muchas sustancias que interfieren en la orina, como las proteasas [54,55], lo que resulta en la degradación de biomarcadores y alta variación interindividual en el pH de la orina, todo lo cual puede confundir el desarrollo de un ensayo de laboratorio sólido. Los estudios proteómicos dirigidos [56–59], impulsados por el muestreo de orina protocolizado de ensayos clínicos prospectivos, que abarcan una década (en nuestros laboratorios en la Universidad de Stanford y UCSF), han llevado al desarrollo de procedimientos operativos estándar (SOP) para la recolección de orina, estabilización , procesamiento, evaluación de sustancias que interfieren, preservación y transporte desde sitios distantes a un laboratorio de procesamiento central [60]. Además, más de una década de estudios proteómicos de orina basados en LC-MS/MS y transcripcionales [48,50,58,61–64] han dado como resultado una comprensión biológica más profunda de la lesión renal en diferentes causas de ERC, lo que impulsó la selección de biomarcadores para su inclusión en el ensayo KIT para representar lesiones en diferentes compartimentos intrarrenales.
Esta búsqueda exhaustiva nos llevó a seis biomarcadores: cDNA, cfDNA metilado, clusterina, CXCL10, creatinina y proteína urinaria. El ADN libre de células ha sido reconocido como un marcador sensible de la carga de enfermedad en el plasma de pacientes con enfermedades autoinmunes [65,66] y tumores [67]. Sin embargo, su utilidad en el plasma es limitada en el contexto de múltiples enfermedades y morbilidades, ya que la carga total de cfDNA reflejaría los procesos acumulativos de varias enfermedades, mientras que la medición del ADN libre de células en un órgano o sitio específico en el plasma requiere tecnologías de secuenciación avanzadas y bioinformática [68,69]. Sin embargo, debido a que el cfDNA en la orina refleja específicamente las contribuciones del riñón, el ensayo KIT cfDNA permite una detección extremadamente sensible de la lesión renal a través de un ensayo económico basado en ELISA. La medición de fragmentos metilados de cfDNA proporciona especificidad adicional con respecto al tipo de lesión. Mientras que la hipermetilación global se ha asociado con lesión renal relacionada con el sistema inmunitario y aumento de la fibrosis, la hipometilación global se asocia con deterioro renal relacionado con el envejecimiento y lesión renal por isquemia-reperfusión [31,32,70]. Al igual que con nuestra justificación en la medición de cfDNA, encontramos que los cambios globales en el estado de metilación del cfDNA permiten una discriminación precisa entre estados de enfermedad renal sin necesidad de secuenciación específica de loci o PCR.
CXCL10 ha sido bien establecido como un marcador de lesión inmunomediada en una variedad de contextos debido a su papel como ligando para el receptor CXCR3 [33,34,37,45,51,71]. Anteriormente demostramos que CXCL10 y cfDNA, medidos a través del ensayo KIT, pueden detectar la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar en el trasplante de pulmón, así como el rechazo en el trasplante de riñón [35,72,73]. Sorprendentemente, lo que encontramos en el presente estudio es que hay un número significativo de pacientes con enfermedades renales tradicionalmente no inmunes, como hipertensión y diabetes tipo 2, que tenían CXCL10 elevado, lo que podría indicar una utilidad más amplia en la detección temprana de Lesión renal en etapa. Estudios previos han identificado que la diabetes tipo 2 tiene un componente mediado por CXCL10-significativo [74] y han identificado CXCL10 producido por células endoteliales como un contribuyente a la hipertensión esencial [75]. Nuestros hallazgos sugieren que CXCL10 puede identificar no solo a los pacientes con daño renal mediado por el sistema inmunitario, sino también a aquellos con otras causas, que tienden a presentarse de manera insidiosa con síntomas clínicos tardíos en relación con la progresión de la enfermedad.
La proteína total en orina y la clusterina son marcadores bien establecidos de disfunción renal [38,40,41] y la creatinina está bien validada en el campo como un biomarcador de normalización [42,43]. Sorprendentemente, encontramos que la clusterina, después de análisis multivariados, no es significativa en nuestro modelo de lesión renal en el contexto de nuestros otros biomarcadores. Esto puede deberse a una serie de causas, incluida su correlación con la proporción de proteína total a creatinina, cuyos componentes ya están incluidos en el modelo [38], así como la variación de punto alto debido a los ritmos ultradianos de la estrecha correlacionó los niveles plasmáticos y urinarios de clusterina [76,77].
La detección temprana de la lesión renal tiene ramificaciones muy importantes para limitar la tasa de progresión de la ERC e impactar positivamente en la atención médica en todo el mundo. Dado que los cambios hemodinámicos renales son muy sensibles a las perturbaciones sistémicas, un mejor manejo de las principales causas subyacentes de la ERC sería un beneficio inmediato, especialmente el control mejorado y estricto de la presión arterial [78], la estabilidad y el control estricto de la hiperglucemia [79] y detección temprana e inmunomodulación rápida para la anulación de la inflamación y lesión renal en enfermedades sistémicas inmunomediadas como el lupus eritematoso sistémico [80] y la artritis reumatoide [81]. Las elevaciones persistentes y tempranas de la puntuación podrían desencadenar imágenes renales para evaluar la uropatía obstructiva, con una intervención inmediata para prevenir la presión intrarrenal alta y la fibrosis intersticial renal progresiva y la deserción tubular. Lo más probable es que la detección temprana de la lesión renal ocurra en el entorno de atención primaria, donde la disponibilidad de un análisis simple de rendimiento rápido con una lectura cuantitativa de la puntuación de riesgo renal puede desencadenar una derivación más temprana a un nefrólogo para el control de la presión arterial, modificación, el tratamiento de la enfermedad vascular coronaria y/o periférica, la causa subyacente de la ERC y la consideración de terapias conservadoras renales [82,83]. La capacidad de realizar un seguimiento cuantitativo de la resolución de la puntuación KIT a lo largo del tiempo brinda la oportunidad de realizar un seguimiento de la resolución de la lesión renal. Además de las opciones para usar medicamentos o apoyo para controlar mejor la enfermedad sistémica, los nuevos medicamentos renoprotectores, como los inhibidores de SGLT2 y otros [84], resaltan aún más cuán crucial es poder detectar la lesión renal muy temprano, tratar y revertirlo.
Los retrasos en la detección de la lesión renal y, en consecuencia, la derivación de los pacientes es un obstáculo importante para lograr que los nuevos pacientes reciban regímenes de tratamiento efectivos mientras aún tienen la oportunidad de maximizar los beneficios de las terapias de preservación renal. Para enfatizar cuántos pacientes "pierden" la oportunidad de recibir un diagnóstico de CKD en las etapas más tempranas de su enfermedad, los pacientes con ESRD usan el departamento de emergencias a una tasa seis veces mayor que la tasa media nacional para adultos de EE. UU., la mitad de los cuales resultan en hospitalización [85]. Por lo tanto, además de utilizar la puntuación KIT para realizar un seguimiento de la recuperación renal, también es muy valioso utilizar este ensayo para realizar un seguimiento de la progresión de la lesión renal, de modo que se puedan realizar intervenciones según sea necesario para estabilizar la progresión de la trayectoria de la puntuación KIT. La observación de que un tercio de los pacientes con ERC de etiología debida a hipertensión o diabetes también tienen un entorno inmunitario/inflamatorio fuerte como parte de su lesión renal sugiere que la apreciación de la heterogeneidad biológica de diferentes categorías de enfermedades por los valores de biomarcadores individuales en el ensayo KIT, y otros estudios interrogativos, permitirán enfoques más personalizados para el tratamiento de pacientes con ERC.
Los estudios en curso están planificados y en curso mediante los cuales una evaluación en serie de la puntuación KIT predefinida con el ensayo KIT predefinido nos permitirá evaluar el valor de los biomarcadores individuales en el ensayo durante la lesión renal y la recuperación renal. Además, estamos estableciendo colaboraciones con socios farmacéuticos en los que la evaluación en serie del ensayo KIT se puede utilizar como un medio para realizar un seguimiento preciso y no invasivo de la lesión renal temprana por nefrotoxicidad del fármaco, inherente a muchos inmunomoduladores, como la calcineurina. inhibidores [86] y agentes anti-TNF [87]; agentes quimioterapéuticos como el cisplatino [88], los aminoglucósidos [89] y las inmunoterapias más nuevas [90], así como la exposición a medios de contraste con radionúclidos con fines de imagen [91]. Se están reuniendo cohortes adicionales para el análisis donde los pacientes han sido seguidos longitudinalmente a lo largo de la progresión de la ERC, lo que nos permitirá comprender mejor la trayectoria granular de la puntuación KIT y posiblemente ayudar a refinar las etapas de la ERC.
Como se eligieron los biomarcadores del ensayo y se desarrolló el ensayo con la intención específica de detectar una lesión renal muy temprana, también observamos que el ensayo KIT puede detectar que un pequeño porcentaje de controles "normales" muestran puntuaciones de KIT en orina que oscilan en el nivel más alto. umbral de riesgo de 18,5. Aunque no está confirmado, es posible que esto no sea ruido de ensayo y que estos casos sean verdaderos positivos con una identificación muy temprana del riesgo de lesión renal en la etapa pre-CKD 1 o CKD 0. Dado que el 96 % de las personas con ERC no se dan cuenta de que la tienen [92], un desafío significativo en el desarrollo de modelos de lesión renal es la alta probabilidad de que los pacientes reclutados como controles sanos en realidad tengan una enfermedad renal en etapa temprana. Por ejemplo, el proyecto de longevidad humana, dirigido por Craig Venter con la prueba Health Nucleus, secuenció y realizó extensamente pruebas de detección adicionales de adultos sin síntomas y encontró correlaciones clínicas de enfermedades potenciales en el 21 por ciento de los participantes "sanos" del estudio, incluida la evaluación urológica. /enfermedades renales, lo que sugiere la necesidad de una mayor detección. Esto es especialmente cierto en el caso de enfermedades en las que la intervención temprana puede retrasar o incluso revertir la progresión de la enfermedad. Encontramos que la ERC y la lesión renal en su conjunto son una enfermedad ejemplar en la que esto es cierto, ya que numerosas intervenciones terapéuticas y de estilo de vida pueden prevenir una mayor progresión del deterioro de la función renal [6,82,83,92].
Una limitación del diseño del estudio actual es el uso de una población enriquecida para sujetos con ERC de un centro de atención terciaria. Los sujetos obtenidos de más exámenes de detección y entornos comunitarios pueden ser más representativos de la población general, en particular para la detección de la ERC en etapa temprana. Además, el estudio fue transversal y es posible que no haya representado completamente la ERC en etapa temprana y tardía. Se planean estudios longitudinales de seguimiento de pacientes con signos de ERC en etapa temprana para mejorar la evaluación de las capacidades de detección temprana de la puntuación KIT y el impacto de la detección temprana en la progresión de la ERC. Finalmente, puede ser posible aumentar aún más la puntuación KIT con biomarcadores adicionales para permitir un mejor diagnóstico diferencial de la ERC y minimizar la necesidad de medir la creatinina sérica y la proteinuria.
No se puede subrayar el impacto económico positivo de la detección precoz del daño renal y su tratamiento. Casi un tercio del presupuesto de Medicare se dedica al tratamiento de lesiones y enfermedades renales en los EE. UU. La pérdida de la función renal en la ERC 5 agrega una carga fiscal adicional de ~$80,000 por año debido al apoyo de diálisis. Aunque el trasplante renal permite que los pacientes salgan de la diálisis, la escasez de donantes renales, tanto vivos como cadavéricos, requiere trasplante renal, con un costo inicial del procedimiento de ~$100,000, seguido de costos de medicamentos de mantenimiento de ~$20,{{ 6}}/año, resulta en solo una pequeña mella en el presupuesto de diálisis de Medicare [93]. Se espera que la trayectoria del número de pacientes con ERC continúe aumentando en todo el mundo, con mayores tendencias en la obesidad, lo que resulta en un aumento del número de personas con hipertensión y diabetes [94]. Además, las variaciones étnicas en las enfermedades renales generan problemas nacionales de atención de la salud, lo que requiere el cribado de la población con biopsias renales para la detección temprana de la lesión renal por enfermedad renal IgA en el sudeste asiático [95], donde la enfermedad renal IgA es la principal causa de insuficiencia renal. . La inclusión de un ensayo no invasivo sensible para la lesión renal, para reemplazar los procedimientos de biopsia invasivos, de alto costo y alta morbilidad, generaría importantes beneficios socioeconómicos para estas poblaciones en riesgo.
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En conclusión, este estudio proporciona el modelo para los biomarcadores del ensayo KIT, el proceso de desarrollo del algoritmo del ensayo KIT, la definición de puntuación KIT y su rendimiento para la detección temprana de daño renal, y su comparación directa con las pruebas de atención estándar actuales. Este estudio propone que la prueba KIT podría usarse (1) como una prueba de detección cuando existe la preocupación de comorbilidades que se sabe que aumentan el riesgo de ERC, como la morbilidad cardiovascular, la obesidad, la diabetes, sin documentación de insuficiencia renal anormal. función por ensayos actuales; (2) como una prueba complementaria para controlar la carga y la progresión precisa de la ERC en pacientes en los que las pruebas de atención estándar actuales ya han detectado lesión renal, es decir, pacientes con ERC preexistente conocida en diferentes etapas de la enfermedad renal; (3) para permitir la evaluación sensible de la recuperación de la lesión renal cuando se exponen a diferentes terapias de protección renal y opciones de manejo. Se necesitan y planifican más estudios para la detección longitudinal de pacientes a lo largo del tiempo para comprender mejor la historia natural de la progresión de la ERC, los beneficios de la detección temprana, la intervención y el control, y los puntos de infección donde la lesión de la ERC se vuelve fija y progresiva. .
Contribuciones de autor:MMS, JYCY, DW y TKS diseñaron el estudio y los experimentos; JML, ID, VL, SS, DL, KS, RS, AC, PC.L. y ML, realizaron experimentos; DW, JYCY, RDS y MMS analizaron los datos; DW, JYCY y MMS hicieron las cifras; JYCY, DW, RDS, TKS y MMS redactaron y revisaron el documento; todos los autores revisaron críticamente el manuscrito en busca de contenido intelectual importante y aprobaron la versión final del manuscrito. MMS tuvo pleno acceso a todos los datos del estudio y asume la responsabilidad de la integridad de los datos y la precisión del análisis de datos.
Fondos:MMS y TKS cuentan con el apoyo de investigación del NIH (NIAID y NIDDK). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Expresiones de gratitud:Estamos agradecidos por la ayuda de médicos, coordinadores clínicos, personal de investigación, pacientes y familiares de pacientes.
Conflictos de interés:MMS, DW y JYCY son fundadores de KIT Bio, Inc. (Los Altos, CA, EE. UU.), cuya propiedad intelectual es propiedad exclusiva de Regents, University of California San Francisco y tiene licencia para KIT Bio. Todos los demás autores declaran no tener conflicto de intereses.
1. KIT Bio, 665 3rd Street, San Francisco, CA 94107, EE. UU.; drew@kit.bio (DW); joshua.yang@ucsf.edu (JYCY)
2. Departamento de Cirugía, Universidad de California San Francisco, San Francisco, CA 94143, EE. UU.;
reuben.sarwal@ucsf.edu (RDS); tara.sigdel@ucsf.edu (TKS); juliane.liberto@ucsf.edu (JML);
izabella.damm@ucsfmedctr.org (identificación); victorialouie11@gmail.com (VL); shristisigdel@gmail.com (SS); peichen@berkeley.edu (P.-CL)
3. Programa de Maestría en Medicina Traslacional, Universidad de California Berkeley, Berkeley, CA 94720, EE. UU.; devonlivingstone@berkeley.edu (DL); katherine_soh@berkeley.edu (KS); archakra@berkeley.edu (CA); liangmichael@berkeley.edu (ML)
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