Los ácidos grasos omega-3 regulan al alza SIRT1/3, activan PGC-1 a través de la desacetilación e inducen la producción de Nrf1 en un modelo de rata con nefrectomía 5/6
Mar 10, 2022
Introducción
Riñonesestán involucrados en la regulación de varias funciones, incluidas varias vías metabólicas, el equilibrio de agua y electrolitos, el control de la presión arterial y la producción de varias hormonas. Como estas funciones consumen una enorme energía,riñonesson ricas en mitocondrias [1]. Las mitocondrias pueden adaptarse a diferentes condiciones metabólicas a través de la regulación de los objetivos mecanísticos de la rapamicina (mTOR) y las vías de detección de nutrientes mediadas por la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) para mantener una población mitocondrial saludable [2]. Entre los estudios sobre mitocondrias, hasta la fecha, solo hay unos pocos estudios sobre biogénesis mitocondrial. La mayoría de los estudios relacionados con la biogénesis mitocondrial se basan enrenaltejido [3,4], y estudios sobreriñonesse relacionan principalmente con enfermedades agudaslesión renal(AKI) modelos animales, células tubulares proximales y nefropatía diabética [5–7]. Aunque la biogénesis mitocondrial puede vincularse a la patogénesis de la disfunción mitocondrial en pacientes crónicos no diabéticosenfermedad del riñon (CKD), la investigación sobre este tema también es muy limitada. La ERC y la biogénesis mitocondrial están relacionadas con la enfermedad cardiovascular [8,9]. Mejorar la biogénesis mitocondrial puede ser beneficioso para la cardioprotección en la ERC. Se realizó un estudio que indica que los ácidos grasos (FA) omega-3 facilitan la biogénesis de las mitocondrias utilizandoriñóntejidos [3,10]. Un estudio reciente demostró un papel prometedor de los ácidos grasos omega-3 en la biogénesis mitocondrial en modelos animales con enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas [11]. Por lo tanto, en el presente estudio, nuestro objetivo fue investigar la biogénesis mitocondrial enriñonesde 5/6 ratas con nefrectomía (Nx). Además, evaluamos el efecto de los ácidos grasos omega-3 en la biogénesis mitocondrial usando este modelo.
Palabras clave:factor respiratorio nuclear 1; factor nuclear eritroide 2-factor relacionado 2; sirtuina 1; sirtuina 3; ácidos grasos omega-3; riñón, renal
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2. Resultados
2.1. Cambios en la función renal y hallazgos histológicos
En comparación con el grupo de control, el nivel de nitrógeno ureico en sangre (BUN) en los grupos Nx y Nx tratados con omega{{0}} FA aumentó significativamente (grupo de control 17,7 ± 1,5, grupo Nx 77,7 土 28,4 y tit con el grupo omega-3 FA 63,9 土 17.0 mg/dL, p = 0.{{20}}07). Aunque no hubo una diferencia significativa entre los grupos Nx y Nx tratados con omega-3 FA, los niveles de BUN fueron numéricamente más bajos en el grupo Nx tratado con omega-3 FA. El nivel de creatinina sérica (sCr) entre los tres grupos fue similar al de BUN (grupo control, 0.4 th 0.U; grupo Nx, 1.3 土 0.6; omega-3 FA, 1.0 ± 0,3 mg/dl y=0,008). En comparación con el grupo de control, se observaron dilatación y atrofia tubulares graves mediante la tinción con PAS en el grupo Nx (Figura complementaria S1). Además, los resultados mostraron que el grupo Nx tratado con omega-3 FA mostró menos cambios tubulointersticiales que el grupo Nx. losfunción renaly los cambios histológicos en los tres grupos ya se han informado en un estudio anterior [12].
22 Cambios en factores relacionados con la biogénesis mitocondrial
2.2.1. Expresión Nrf1 y Nrf2.En comparación con el grupo de control, el grupo Nx mostró un nivel de expresión significativamente menor del factor respiratorio nuclear 1 (Nefl) y el factor 2 relacionado con el factor eritroide 2-nuclear (Nrf2). Sin embargo, en el grupo Nx tratado con omega-3 FA, el nivel de expresión de Nrf1 y Nrf2 aumentó significativamente en comparación con el grupo Nx, pero no alcanzó el nivel del grupo de control (Oigure P, figura complementaria St) . Estos resultados también se encontraron cn Nrf1 mRNA análisis de PCR en tiempo real cuantitativo (Figura complementaria S3).
2.2.3. Expresión de Factores Relacionados con PGC-1 Actividad: pAMPK, SIRT1/3.En comparación con el grupo de control, los grupos Nx y Nx tratados con omega-3 exhibieron niveles significativamente más bajos de AMPK fosforilada (la proporción de calabaza a AMPK) (Figura 3A). Además, el grupo Nx exhibió un nivel significativamente más bajo de expresión de sirtuina 1 (SIRT1) en comparación con el grupo de control (Figura 3B, Figura complementaria S6). Sin embargo, después de la adición de omega-3 FA, la expresión de SIRT1 aumentó relativamente, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Estos resultados se encontraron en el análisis de PCR en tiempo real cuantitativo de ARNm de SIRT1 (Figura complementaria S7). Por el contrario, la expresión de sirtuina 3 (SIRT3) disminuyó significativamente en el grupo Nx en comparación con el grupo de control, que se rescató significativamente en el grupo Nx tratado con el grupo omega-3 FA (Figura 3C).
2.2.4. Expresión de Keap1, mTOR, FoxO1 y FoxO3, en comparación con el grupo de control, la expresión de la proteína 1 asociada a EC H similar a Kelch (Keap1) y las proteínas O1 y O3 de Forkhead box (FoxO1/3) aumentó significativamente en el grupo Nx . En el grupo Nx tratado con omega-3 FA, el nivel de expresión de Keap1 y FoxO1/3 disminuyó significativamente en comparación con el grupo Nx (Figura 4C,E,F). En comparación con el grupo control, la expresión de mTOR disminuyó significativamente en el grupo Nx. Sin embargo, en el grupo Nx tratado con omega-3 FA, la expresión de mTOR se rescató pero no alcanzó el nivel en el grupo de control (Figura 4B)
2.2.5. Contenido de ADN mitocondrial (ADNmt), Se observó una reducción significativa de ADNmt en el grupo Nx en comparación con el grupo de control. Sin embargo, la cantidad de reducción de mtDNA se recuperó significativamente en el grupo omega-3 Nx tratado con Nx (Figura complementaria S9).
3. Discusión
PGC-1 , que se activa mediante la fosforilación y la desacetilación, es el principal regulador de la biogénesis mitocondrial y la producción de energía. Encontramos una disminución en la expresión y desacetilación de PGC-1 en el modelo de ERC. Cabe señalar que la disminución de la desacetilación de PGC-1 es el principal mecanismo que contribuye a la biogénesis mitocondrial disfuncional y a la reducción de la producción de energía en la ERC. AMPK activa PGC-1 mediante la fosforilación de sus residuos de treonina o serina [13,14]. AMPK también se activa con la fosforilación cuando la relación AMP/ATP es alta. Sin embargo, se sabe que la AMPK se inactiva en la ERC debido a la alteración de la detección de niveles altos de AMP [15,16]. Similar a estudios previos, demostramos que la fosforilación de AMPK se redujo significativamente en elriñóntejido del grupo Nx. Aunque pPGC-1/PGC-1 parece aumentar hasta cierto punto en el grupo Nx, es poco probable que el nivel de fosforilación de PGC-1 aumente debido a la disminución de PGC{{3 }} expresión. Además, los Nx tratados con el grupo de omega-3 FA también mostraron resultados similares a los del grupo de Nx, lo que indica que la administración de omega-3 FA no afectó la fosforilación de AMPK y PGC{{6} } . La desacetilación puede ocurrir en toda la secuencia de PGC-1, y SIRT1 y 3 juegan un papel importante en el proceso de desacetilación [13,14]. Después de la administración de omega-3 FA, el nivel de expresión de PGC-1, SIRT1 y 3 aumentó, lo que resultó en el rescate de PGC-1 desacetilado al mismo nivel que el del grupo de control normal . El rescate en el nivel de expresión de Nrf1 y Nrf2, que se demuestra en el grupo Nx tratado con omega-3 FA, está directamente relacionado con el aumento en el nivel de expresión de SIRT1 y 3, lo que además condujo a la desacetilación de PGC{ {22}} .
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Estudios recientes sobre las mitocondrias enenfermedad del riñonhan demostrado que el aumento en el nivel de expresión de PGC- 1 o SIRT a través de intervenciones genéticas o farmacológicas mejoróDaño en el riñónen modelos animales de LRA [5–7,17,18]. El mecanismo subyacente implica el efecto de mejora en la oxidación de AG o la respuesta antioxidante. Un estudio anterior informó que la administración de omega-3 FA mejoró la beta-oxidación mitocondrial de FA y exhibió efectos antioxidantes en un modelo de rata 5/6 Nx [19]. También hay informes que sugieren que los omega-3 FA aumentan la expresión de PGC-1, Nrf1 y SIRT1 en células musculares, macrófagos y células nerviosas [3,10,11]. Como aún no se han informado los efectos de los ácidos grasos omega-3 en las mitocondrias en un modelo de ERC, demostramos que los ácidos grasos omega-3 son eficaces para recuperar las moléculas relacionadas con la biogénesis mitocondrial y el ADNmt usando un modelo de ERC en este estudiar.
Tanto mTOR como AMPK están involucrados en la biogénesis mitocondrial, pero sus funciones varían según el estado nutricional. mTOR, un objetivo del complejo de rapamicina 1 (mTOC1), puede activarse a través de estímulos energéticos, como aminoácidos o glucosa, y puede desencadenar vías que conducen a procesos anabólicos y biogénesis mitocondrial. Por el contrario, la AMPK puede activarse a través de la hipoxia y los déficits nutricionales, lo que conduce a la activación del proceso catabólico y la biogénesis mitocondrial, e inhibe el consumo de energía a través de mTOC1 [2]. En este estudio, no solo demostramos una disminución de pAMPK/AMPK, sino también una disminución de mTOR en el modelo de ERC. Además, la administración de ácidos grasos omega-3 condujo a una casi recuperación de la expresión de mTOR, pero no a la recuperación de la disminución de pAMPK/AMPK. Por lo tanto, los AG omega-3 podrían aliviar la disminución de la biogénesis mitocondrial al aumentar la expresión de mTOR en elriñonesde un modelo animal de ERC. Sin embargo, se requieren más estudios para aclarar si mTOR está disminuido en pacientes con ERC y cómo el aumento en la expresión de mTOR a través del tratamiento con ácidos grasos omega-3 afectará la salud mitocondrial y la progresión de la ERC.
FoxO1 y 3 se unen al promotor PGC-1 y mejoran su transcripción [20,21]. Sin embargo, en este estudio, se encontró que FoxO1 y 3 aumentaron en el grupo Nx y disminuyeron en los grupos de control y Nx tratados con omega-3 FA. Por lo tanto, se supone que la expresión de FoxO1 y 3 es relevante para la respuesta compensatoria para disminuir PGC-1 en ERC o aumentar PGC-1 a través de la administración de ácidos grasos omega-3. Nrf2 juega un papel importante en la homeostasis redox celular y la biogénesis mitocondrial. Hay tres sistemas de ligasa de ubiquitina relacionados con la degradación de Nrf2 (Keap1, proteína que contiene repeticiones de transducina y sinovial de ligasa de ubiquitina E3) [22]. En este estudio, mostramos una disminución significativa en Nrf2 y un aumento significativo en Keap1 en el grupo Nx en comparación con el grupo de control.d Sin embargo, en el grupo Nx tratado con omega-3 FA, se encontró la expresión de Keap1 se redujo y Nrf2 se incrementó. Los resultados sugieren que el efecto antioxidante mejorado de la administración de ácidos grasos omega-3 en el modelo de rata con ERC puede estar relacionado con la disminución de la expresión de Keap1 y la degradación de Nrf2, lo que podría mejorar la biogénesis mitocondrial. Según los resultados obtenidos en este estudio, se requiere más investigación para dilucidar la relación causal entre FoxO1/3 y Nrf2 en el entorno de la ERC y el efecto de la administración de ácidos grasos omega-3.
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El peso molecular de Nrf2 se encontró en un área de 68 kilodaltons (kDa) en este estudio y en otros estudios recientes [23,24]. Sin embargo, estudios previos indicaron que un peso molecular biológicamente relevante de Nrf2 es de 95 a 110 kDa con evidencia [25,26]. También encontramos bandas que se sospechaban como Nrf2 biológicamente relevantes (Figura complementaria S8). Se necesitan más estudios para encontrar el peso molecular de Nrf2 biológicamente importante. En estudios previos, se informaron los cambios en las mitocondrias el día 28 después de 5/6 Nx, lo que indicó una disminución en la expresión de genes o proteínas asociadas con la beta-oxidación, la fosforilación oxidativa y la proteína estructural de la membrana interna, pero no hubo ningún resultado. relacionado con la expresión PGC-1 [27,28]. En este estudio, confirmamos que las moléculas relacionadas con la biogénesis mitocondrial y el mtDNA que refleja la biogénesis mitocondrial se modularon durante la etapa crónica, ya que los cambios se observaron el día 45 después de 5/6 Nx en ratas. A pesar de las mejoras histológicas y biológicas, el tratamiento con ácidos grasos omega-3 no resultó en la recuperación funcional deriñonesen comparación con el modelo Nx. Por lo tanto, se requiere más investigación para determinar si los ácidos grasos omega-3 son efectivos para restaurarFunción del riñónal inducir efectos que podrían mejorar la función mitocondrial. Hay varias limitaciones en este estudio. Primero, no evaluamos la actividad de citrato sintasa y la formación de superóxido en la cadena de respiración mitocondrial. En segundo lugar, no experimentamos con qué componentes FA de Omacor se ven afectados principalmente en las moléculas relacionadas con la biogénesis mitocondrial. En tercer lugar, no demostramos un mecanismo claro para mejorar las moléculas relacionadas con la biogénesis mitocondrial. Solo sugerimos que el efecto antiinflamatorio, que reduce el estrés oxidativo y los propios ácidos grasos omega-3 como compuestos metabólicos, puede estar relacionado con el mecanismo.
4. Materiales y Métodos Biogénesis Mitocondrial
4.1. Animales y Diseño ExperimentalLos estudios se realizaron en ratas macho Sprague-Dawley (9-semanas de edad) adquiridas de Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japón). Todas las ratas se sometieron a control simulado o 5/6 Nx. Todos los procedimientos que involucran animales se realizaron de acuerdo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad Dong-A (DIACUC-14-4). Las ratas se mantuvieron en condiciones estándar y se les permitió el libre acceso al agua del grifo y una dieta estándar. Todas las ratas se asignaron a los siguientes grupos: grupo 1 (control simulado, n=6), ratas de control mantenidas con solución salina (1 ml/kg/día mediante lavado gástrico); grupo 2 (grupo Nx, n=6), ratas Nx mantenidas con solución salina (1 ml/kg/día mediante lavado gástrico); grupo 3 (grupo omega-3 FA), ratas Nx tratadas con omega-3 FA. La dosis y la vía de administración de los ácidos grasos omega-3 (Omacor, 300 mg/kg/día por sonda gástrica, Pronova Biocare, Sandefjord, Noruega) se determinaron en base a estudios previos [19]. Omacor es omega-3 FA de origen marino y se compone de 460 mg de ácido eicosapentaenoico (EPA) y 380 mg de ácido docosahexaenoico (DHA) en 1 g de Omacor. Omacor generalmente se prescribe para la prevención secundaria después del infarto de miocardio y el tratamiento de la hipertrigliceridemia [29]. Dos omega-3 FA (EPA más DHA) son los componentes principales (84 por ciento) y activos de Omacor, que se preparan farmacéuticamente
composiciones que superan los componentes minoritarios (16 por ciento). Elegimos Omacor para la suplementación con omega-3 FA con antiinflamatorio y reducción del estrés oxidativo porque disminuyó el riesgo de enfermedad cardiovascular en los estudios clínicos [30]. Las ratas se alimentaron uniformemente y se observó su peso diariamente. A las ratas se les permitió el libre acceso al agua del grifo durante 15 semanas después de la cirugía y luego se sacrificaron bajo anestesia con éter dietílico. Al morir, se recogió una muestra de sangre aórtica y luego se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min. Para identificar cambios enFunción del riñónLos niveles de , BUN y sCr se midieron utilizando un analizador automático (Roche, Alemania).
4.2. Examen histopatológico.fijado en formalinariñónlos tejidos se incluyeron en parafina, se cortaron en rodajas (4 µm) y se tiñeron con ácido peryódico de Schiff. Los cambios histopatológicos se observaron con Aperio ScanScope (Aperio Technologies, Vista, CA, EE. UU.).
4.3. Aislamiento de ARN y Análisis PCR Cuantitativo en Tiempo Real.El ARN total se extrajo deriñóntejidos utilizando el reactivo TRIzol. Luego, 1 µg de ARN total se convirtió en ADNc monocatenario utilizando el kit de síntesis de ADNc M-MLV (Enzynomics, Daejeon, Corea). Los cebadores se diseñaron a partir de las respectivas secuencias de genes utilizando Primer3 y el software mfold. Para el análisis de PCR cuantitativo en tiempo real, el ADNc se sometió a amplificación por PCR utilizando cebadores específicos de genes: rat PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(sentido), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(antisentido); rat Nrf1 50- GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30(sentido), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30(antisentido); rata SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30(sentido), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30(antisentido); rata SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30(sentido), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30(antisentido); rata -actina, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30(sentido), 50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG -30 (antisentido). La PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) con un instrumento ABI 7500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.).
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4.4. Western Blotting e Inmunoprecipitación.Western Blot se analizó como se describe anteriormente con ligeras modificaciones [10].Riñónlos tejidos se homogeneizaron mediante tampón de lisis (solución de extracción de proteínas PRO-PREP), se incubaron (30 min a 4 ◦C) y se centrifugaron (14,000 rpm durante 20 min a 4 ◦C). La concentración de proteína se determinó mediante el reactivo de ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). La muestra de proteína igual se cargó en un SDS-PAGE del 7,5 al 15 por ciento y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE. UU.). Luego, las proteínas se inmunotransfirieron con cada anticuerpo. Los anticuerpos contra PGC-1 y SIRT1 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). Los anticuerpos contra AMPK, pAMPK, Nrf1, SIRT3, FoxO1, FoxO3a y mTOR se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra Nrf2, Keap1 (monómero) y -actina se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA, EE. UU.) y Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Para la inmunoprecipitación, se incubó un total de 500 µg de proteína con anticuerpos PGC-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) y proteína A/G más perlas de agarosa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.), y se dejó mezclar a 4 ◦C durante la noche. Luego, los inmunoprecipitados se separaron mediante electroforesis SDS-PAG y se sometieron a inmunotransferencia utilizando anticuerpos de acetil-lisina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU.) y fosfoserina (MerckMillipore, Burlington, MA, EE. UU.). Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los niveles de proteína fueron estandarizados por -actina (ImageJ versión 1.48q). El análisis de inmunoprecipitación y transferencia Western con anticuerpos se realizó con el sustrato de quimioluminiscencia mejorado Super Signal West Pico (Thermo Scientific, Hudson, NH, EE. UU.) y se detectó con LAS-3000 Plus (Fuji Photo Film, Tokio, Japón).
4.5 Medición del contenido de mtDNALa qPCR se utilizó para determinar el contenido relativo de mtDNA. La reacción se realizó mediante química SYBR Green utilizando 3 ng de ADN total como molde y los siguientes cebadores: mtDNA de rata 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3' (sentido), 5,-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA-3' ( antisentido); p-actina de rata, 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA (sentido), C-CGTCTC-CGGAGTCCATCAC f (antisentido). El contenido de ADNmt en relación con el ADN nuclear se informó en [31].
4.6 Análisis estadísticoLos análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 18.0 (IBM Corp., Armonk, NYP EE. UU.). Los resultados se expresan como media ± SD. Las medias de los grupos se compararon mediante análisis de varianza seguido de comparaciones múltiples de Tukey. p e 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
5. Conclusiones
En conclusión, se observaron modulaciones significativas en la expresión de mediadores relacionados con la biogénesis mitocondrial en un modelo de rata con ERC. Omega-3 FA puede mejorar la biogénesis mitocondrial al regular al alza Nrf1 y Nrf2. Este mecanismo de protección puede iniciarse a través de un aumento en la expresión de PGC-1 y la desacetilación de PGC-1 , que fue desencadenada por una mayor producción de SIRT1/3 (Figura 5). Figura 5. Efecto de omega-3 FA sobre la biogénesis mitocondrial en la ERC. Las flechas negras en negrita indican la expresión de mediadores relacionados con la biogénesis mitocondrial en un modelo de rata con ERC. Las flechas rojas indican la expresión de mediadores después de la administración de omega-3 FA. Las flechas arriba/abajo indican un aumento y disminución en la expresión de mediadores.
