Superar la inmunodeficiencia con el alojamiento compartido

Resumen sencillo:

Investigamos si dos especies de termitas estrechamente relacionadas difieren en su dependencia de la inmunidad social o individual contra dos especies de hongos patógenos, todos recolectados en el mismo lugar. Nuestros resultados indican que el acicalamiento mutuo (allogrooming) es muy eficaz para limitar las infecciones mortales en la medida en que puede compensar las defensas inmunitarias individuales relativamente débiles. Después de encontrar patógenos, las termitas utilizan una estrategia alternativa para distanciarse socialmente y limitar la propagación de enfermedades contagiosas y, en cambio, se reúnen para limpiarse entre sí. La variación en la intensidad de esta respuesta conductual indica una respuesta matizada al nivel de amenaza.

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Abstracto:

El acicalamiento parece ser esencial en muchos animales sociales para protegerse de la exposición rutinaria a los parásitos. En los insectos sociales, parece ser fundamental para la eliminación de propágulos patógenos de la cutícula antes de que puedan iniciar un ciclo infeccioso. Para las termitas subterráneas, esto incluye esporas de hongos que se encuentran comúnmente en el suelo, como las conidias de Metarhizium, que pueden germinar rápidamente y penetrar la cutícula. Investigamos si existe una diferencia en la dependencia de la inmunidad social e innata en dos termitas subterráneas estrechamente relacionadas para la protección contra infecciones fatales por dos especies de Metarhizium que se encuentran localmente. Nuestros resultados indican que la inmunidad innata relativamente débil en una especie de termitas se compensa con un acicalamiento más sostenido. Esto incluye un mejor aseo en respuesta a concentraciones de conidios que reflejan una contaminación más rutinaria de la cutícula, así como a una contaminación cuticular intensa que provoca una respuesta de emergencia en red.

Palabras clave:

inmunidad social; inmunidad innata; entomopatógenos; comportamiento de alarma; término

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1. Introducción

Los mecanismos sociales de defensa pueden ser muy eficaces para contrarrestar la susceptibilidad a enfermedades contagiosas a pesar de que la sociabilidad favorece su propagación [1,2]. En termitas y hormigas, la evolución de mecanismos sociales eficaces de defensa inmune parece haber relajado la presión selectiva sobre los mecanismos inmunes innatos individuales [3-6]. Una vez que se encuentran los patógenos, la amenaza de enfermedad en los insectos sociales dependerá de la eficacia de las defensas innatas de primera línea, que incluyen barreras físicas contra la infección. Muchos hongos patógenos producen esporas asexuales (conidios) que pueden penetrar directamente la cutícula del insecto. Las defensas inmunes sociales que ayudan a proteger la cutícula, incluido el acicalamiento y los antifúngicos secretados, parecen ser especialmente importantes en las termitas para la defensa contra Metarhizium spp [7–9]. Los conidios de Metarhizium son omnipresentes en el suelo por el que se mueven muchas termitas mientras buscan alimento y alcanzan concentraciones que mantienen una amenaza constante de infección [10]. Las termitas que buscan alimento, como las especies del género Reticulitermes, se mueven a través del suelo para expandir el alcance de sus colonias y acceder a múltiples sitios de alimentación, que generalmente son recursos de madera que descansan en la superficie del suelo [11]. Las redes subterráneas de sus colonias pueden extenderse a lo largo de decenas de metros, contener más de cien mil individuos y alcanzar densidades de más de cien colonias por hectárea [12]. Evolucionaron a partir de un ancestro con colonias restringidas a una sola pieza de madera [13,14]. Esta transición habría resultado en un aumento de los encuentros con depredadores, patógenos y competidores y habría coincidido con la evolución de una verdadera casta de trabajadores dedicada que generalmente renuncia a la reproducción directa. Es probable que una mejor higiene haya sido fundamental para esta transición y la posterior radiación y el éxito ecológico actual de las termitas, cuya contribución a la descomposición de la madera puede superar la descomposición microbiana [15,16] y que parecen estar preparadas para expandirse rápidamente a nivel mundial a medida que aumentan las temperaturas [17]. . Durante la transición a la búsqueda de alimento, una relajación de la presión selectiva sobre los genes inmunes innatos coincidió con su intensificación sobre dos genes que producen proteínas antifúngicas secretadas [6]. Estas proteínas parecen ser esenciales para la eliminación de conidios fúngicos con alogrooming. La presión selectiva contrastante sobre los componentes de los mecanismos de defensa individuales innatos y sociales en el pasado sugiere que continúa habiendo una compensación adaptativa en la dependencia de las termitas de la inmunidad individual innata y social para protegerse contra las enfermedades fúngicas. Esto está respaldado por la observación de que la expresión del gen inmune innato es menor en grupos que en individuos de trabajadores de Reticulitermes que han estado expuestos a conidios de Metarhizium [18]. Allogrooming reduce la necesidad de activar el sistema inmunológico interno. En este estudio, investigamos las diferencias en la inmunidad social e innata en dos especies de termitas subterráneas frente a dos especies locales de Metarhizium que se encuentran de forma natural. Las especies de Metarhizium se aislaron del suelo debajo o junto a troncos en los que se recolectaron termitas. Las dos especies de termitas, Reticulitermes virginicus y Reticulitermes flavipes, se recolectaron en el mismo lugar en Maryland. Aunque parecen agonistas, a menudo se los encuentra buscando comida uno al lado del otro o incluso ocasionalmente en el mismo tronco. La agresión interespecífica entre trabajadores frecuentemente resulta en heridas fatales en ensayos de agonismo en placas de Petri [19]. Anteriormente se ha demostrado que la actividad antifúngica de los lavados cuticulares de las obreras de R. virginicus es más eficaz para inactivar los conidios de Metarhizium que los lavados de las obreras de R. flavipes [20]. Esto sugiere que, aunque estas dos termitas están estrechamente relacionadas y encuentran los mismos patógenos, pueden diferir en su dependencia de la inmunidad individual innata o social. Utilizamos un enfoque comparativo para investigar si existe una diferencia entre la dependencia y la integración de la inmunidad social e innata y si existe una posible compensación entre las dos. La inmunidad social mejorada puede estar asociada con mecanismos inmunes innatos menos efectivos, que pueden incluir la potencia de los antifúngicos secretados, y viceversa. Una inmunidad individual más débil puede compensarse con una inmunidad social más efectiva. Se investigó la supervivencia de las termitas obreras del último estadio en grupos de doce, parejas o ejemplares únicos después de haber sido expuestas a hongos de Metarhizium robertsii o Metarhizium brunneum. Grupos de 12 trabajadores estuvieron brevemente expuestos a una dosis alta del hongo. Esta concentración potencialmente fatal provoca respuestas de comportamiento similares a las observadas cuando las termitas se encuentran con un cadáver esporulado, provocando en algunos casos un aumento sustancial en una respuesta de alarma que resulta en rápidos movimientos oscilatorios longitudinales, LOM [21-23]. La frecuencia de LOM en los primeros 12 minutos después de que las termitas se exponen a conidios de diferentes cepas y especies de Metarhizium se correlaciona positivamente con la frecuencia de episodios de alogrooming. Por lo tanto, los LOM, que son más fáciles de medir que el allorooming, se pueden utilizar como una medida indirecta de los niveles de allorooming. La detección del hongo parece retrasarse hasta que las superficies de las termitas están contaminadas con conidias, lo que sugiere que los receptores de reconocimiento asociados con las piezas bucales son fundamentales para la aparición de una alarma elevada y el acicalamiento. Las parejas y los ejemplares únicos fueron expuestos a una dosis baja del hongo que es más probable que refleje los niveles de exposición que encuentran las termitas cuando construyen galerías a través del suelo, en contraste con los encuentros directos con cadáveres esporulados. A diferencia de las termitas individuales, las parejas de termitas son casi completamente resistentes a infecciones fatales con esta dosis durante 10 días. Para separar la inmunidad social y la innata con esta dosis baja, se separaron pares de termitas en diferentes momentos poco después de los desafíos con conidios fúngicos, y se comparó la supervivencia de estos pares con los ejemplares únicos que no tuvieron oportunidades de interacciones sociales después de los desafíos fúngicos. Se observaron alogrooming y LOM antes de los puntos de tiempo de separación de los pares de termitas. Además, se probó la actividad antifúngica de extractos crudos de termitas enteras para evaluar más a fondo las diferencias en la inmunidad innata entre las dos especies de termitas en respuesta a las dos especies de hongos.

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2. Métodos

2.1. Organismos de estudio

Las termitas R. flavipes y R. virginicus, y los hongos M. brunneum y M. Roberts, se recolectaron de bosques caducifolios de crecimiento secundario en el condado de Baltimore (Pleasant Hills y Monkton), Maryland. Las especies de termitas se identificaron mediante ensayos de agonismo intra e interespecíficos [19] y secuencias de ARNr mitocondrial [4]. Las especies de Metarhizium fueron aisladas de muestras de suelo cercanas a sitios de recolección de termitas (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000) y la madera en la que se alimentaban fueron recolectadas y almacenadas en recipientes de plástico en condiciones de oscuridad y humedad a 25 ◦C. Las termitas pertenecientes a la misma especie se recolectaron en sitios que estaban separados por al menos 60 m, lo que suele ser suficiente para garantizar que las colecciones provengan de diferentes colonias [12]. Estas colecciones separadas se denominan colonias a continuación. Las termitas se recolectaron en el verano de 2018 y 2019 para los experimentos con grupos de 12, así como experimentos in vitro con extractos crudos de termitas, y en 2021 y 2022 para los experimentos con parejas y ejemplares únicos. Se utilizaron termitas en sus respectivos experimentos dentro de los 4 meses posteriores a la recolección. Los trabajadores se retiraron suavemente de las piezas de madera y se mantuvieron en grupos de placas de Petri de 12 55 mm de diámetro revestidas con papel de filtro humedecido (Whatman 1) durante 24 h a la luz ambiental antes de usarlos para nuestros experimentos. Esto les permitió aclimatarse a la luz y limpiar sus superficies cuticulares de partículas finas antes de la exposición a los hongos. No incluimos soldados porque no preparan a sus compañeros de nido, representan entre el 1% y el 2% de la colonia y no se los encuentra consistentemente en grupos de alimentación.

2.2. Supervivencia y respuesta a alarmas para grupos de doce

Se expusieron grupos de 12 trabajadores de R. flavipes o R. virginicus a una dosis alta de 10 6 conidios ml-1 de 0.05% Tween 80 (MilliporeSigma , Burlington, MA, EE. UU.) o Tween 80 al 0,05 % para los controles. Se incluyó Tween 80 para ayudar a romper los grupos de conidios al preparar las suspensiones. El día antes de estos tratamientos, las 12 termitas fueron marcadas con un pequeño punto de pintura de esmalte de colores en el lado dorsal de sus abdómenes para que pudieran identificarse individualmente. El allogrooming eliminó la pintura de algunos individuos, pero estos individuos aún podían identificarse individualmente en el momento de la muerte mediante encuestas a los sobrevivientes y mediante la variación individual natural de los trabajadores, como el grado de coloración oscura en el abdomen. Las termitas utilizadas para cada réplica de 12 termitas desafiadas y controles procedían de diferentes colonias. Se utilizaron cinco colonias tanto para R. flavipes como para R. virginicus (n=480 trabajadores). Los experimentos con colonias de M. Roberts se repitieron después de tres meses para comprobar la coherencia en la supervivencia. En total, hubo 60 réplicas de 12 u 11 termitas (n=709). En 11 réplicas, una termita murió antes de la exposición a los hongos, lo que parecía deberse a la manipulación al marcar con pintura. Las termitas fueron expuestas a conidios preparados a partir de un cultivo clonal de M. Roberts o M. brunneum. Se agregaron trabajadores a tubos de 1,5 ml que contenían 500 µl de diluciones de conidias, o Tween 80 al 0,05% para los controles, con un pequeño embudo de plástico y se agitaron suavemente durante 10 s para asegurar una inmersión completa. Luego, los trabajadores fueron depositados sobre papel de filtro para absorber el exceso de líquido, transferidos a placas de Petri de 55 mm de diámetro revestidas con papel de filtro humedecido (Whatman 1) y grabados en video durante 12 minutos. La mortalidad se controló diariamente durante dos semanas. Se retiraron los individuos muertos, se esterilizó la superficie con etanol al 70% y se colocaron sobre papel de filtro húmedo en placas de Petri (55 mm) mantenidas a 24 ◦C y 100% de humedad para confirmar la infección por Metarhizium (crecimiento de muscardina verde después de 3 a 4 días). Se calificó el número total de LOM observadas en los videos durante 12 minutos para cada termita. Los LOM duraron entre 2 y 7 segundos y tuvieron que detenerse y luego reanudarse para calificarse como eventos separados [23].

2.3. Supervivencia y alojamiento compartido para parejas y solteros

La supervivencia de los pares de termitas se comparó con la de los ejemplares únicos después de la exposición a una dosis baja (104 conidios ml-1) de conidios que no causaron una mortalidad excesiva y probablemente reflejan las concentraciones que encuentran las termitas cuando se mueven por el suelo [10]. . Se compararon parejas y solteros para medir la supervivencia proporcionada por los mecanismos sociales de defensa. Inicialmente se desafiaron grupos de 12 trabajadores con o sin hongos como se describe anteriormente, excepto que se prepararon suspensiones de conidios de aproximadamente 107 conidios ml-1 en Tween 80 al 0,1% y se agitaron vigorosamente antes de las diluciones con agua estéril a 104 conidios ml-1. Tween 80 no se incluyó en las diluciones porque las suspensiones de conidios individuales podían mantenerse en concentraciones bajas y porque el tensioactivo puede interferir con la adhesión de los conidios a la cutícula. Estos individuos no estaban marcados con pintura. Inmediatamente después de los tratamientos y antes de que las termitas tuvieran la oportunidad de interactuar, se dividieron en pares o singletons en los pocillos de 24-placas de cultivo celular de plástico (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Cada pocillo se recubrió con papel de filtro humedecido (Whatman 1). Para cada combinación de termitas/hongos (n=4), se separaron cuatro pares de termitas en ejemplares únicos después de 15 min, 2 h, 5,5 h, 8 h y 27 h (n=160), y para cada combinación combinación de termitas/hongos 12 termitas que nunca tuvieron la oportunidad de interactuar se separaron en ejemplares únicos tratados con hongos o de control (n=96). Estas termitas individuales también se dividieron en 24-placas de pocillos revestidas con papel de filtro. Posteriormente se controló la mortalidad de las termitas durante diez días y se retiraron los individuos muertos para confirmar la infección por Metarhizium. Se usó una sola colonia tanto para R. flavipes tratado con M. robertsii o M. brunneum como para R. virginicus tratado con M. robertsii o M. brunneum (n=256). También se mantuvieron seis pares sin tratar en 24-placas de pocillos durante 10 días para cada especie. Un experimento separado con las mismas colonias se centró en registrar el acicalamiento antes de los tiempos de separación de las parejas a los 15 min, 2 h, 5,5 h, 8 h y 27 h. Se trataron seis pares diferentes de cada especie de termitas con cada hongo o agua como controles y se puntuaron para el acicalamiento durante 15 minutos antes de los puntos de tiempo de separación (n=180). Los eventos de acicalamiento se calificaron cuando el contacto boca a cuerpo entre dos termitas implicaba el movimiento de piezas bucales (palpos), y se registró la duración de cada evento de acicalamiento ininterrumpido. El acicalamiento fue calificado por un único observador que no sabía qué tratamiento habían recibido las termitas. También se puntuaron los LOM, pero fueron insignificantes y no se utilizaron en el análisis. No se observó auto-aseo.

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2.4. Actividad antifúngica in vitro

Doce trabajadores de 5 colonias de R. flavipes o R. virginicus se inmovilizaron en frío en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se agregaron 120 µL de agua fría y estéril a cada tubo. Las obreras de ambas especies utilizadas en este estudio tenían aproximadamente el mismo tamaño (longitud 4 a 5 mm). Las termitas se homogeneizaron con un mortero de plástico y el extracto se centrifugó a 16,000 g durante 2 min. El sobrenadante se esterilizó por filtración con filtros Ultrafree de 0,22 µm (MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.). Se incubaron diez µl del filtrado durante 24 h con diez µl que contenían 100 conidios de M. robertsii o M. brunneum y 20 µl de 100 µg ml-1 de ampicilina para evitar aún más la contaminación bacteriana. Los controles incluyeron 10 µL de agua estéril en lugar del extracto crudo. Se extendieron dos réplicas para cada mezcla incubada en agar papa dextrosa (PDA) suplementado con 50 µg ml-1 de ampicilina (placas de Petri de 60 mm) y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 4 a 5 días. La actividad antifúngica se midió comparando las unidades formadoras de colonias (UFC) en los tratamientos con extracto crudo con los controles.

2.5. Estadísticas

Se utilizaron estimaciones de Kaplan-Meier de los tiempos medios de supervivencia para comparaciones de supervivencia por pares. Los índices de riesgo de muerte (HR) se calcularon con análisis de regresión de Cox. Utilizamos la regresión de Cox para investigar las diferencias en la mortalidad entre individuos que exhiben LOM o no exhiben LOM mientras controlamos otras variables categóricas (tratamiento o control de hongos, especies de hongos, especies de termitas, colonia de origen). Los LOM se clasificaron como ausentes o presentes en individuos debido a la frecuencia de valores atípicos y la falta de normalidad. En el análisis de supervivencia con pares de termitas y ejemplares únicos, el HR se basó en una comparación entre los pares tratados con conidias (separados en diferentes momentos) y los ejemplares únicos tratados con conidias. Estos RRHH, por lo tanto, proporcionan una medida de supervivencia proporcionada por los mecanismos sociales de defensa al tiempo que controlan los mecanismos de defensa individuales. La asociación entre el tiempo pasado en pareja y el cambio en la FC se midió con correlaciones de Pearson. La distribución de LOM entre diferentes tratamientos se comparó con una prueba de Kruskal-Wallis con correcciones de Bonferroni para pruebas múltiples para comparaciones por pares. Las UFC medias o la duración de los eventos de acicalamiento se compararon con una prueba ANOVA con correcciones de Bonferroni para comparaciones por pares. Utilizamos IBM SPSS Statistics (versión 28) para las pruebas estadísticas.

3. Resultados

3.1. Supervivencia y alarma de los grupos de doce desafiados

The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>90% de confirmación). En el caso de las termitas expuestas a M. Roberts, se observaron 129 muertes entre 237 individuos, y el tiempo medio de supervivencia de R. virginicus (9,10 días) fue significativamente menor que el de R. flavipes (10. 98 días)(Breslow=10.05, gl=1, p=0.002) (Figura 1). Para las termitas expuestas a M. brunneum, se observaron 79 muertes entre 120 individuos, y el tiempo medio de supervivencia para R. flavipes (9,70 días) fue menor que para R. virginicus (10,68 días), pero no significativamente (Breslow=2 .74, gl=1, p=0.098). La distribución de LOM (Figura 2) entre los tratamientos fúngicos y de control fue significativamente diferente (Kruskal-Wallis=176.897, df=5, p <0,001). La frecuencia de LOM no fue significativamente diferente entre los tratamientos de M. brunneum y sus respectivos controles para R. flavipes (p ajustado=0.097) y R. virginicus (p ajustado=1.000 ). Sin embargo, la frecuencia de LOM fue significativamente mayor para los tratamientos con M. Roberts en comparación con sus respectivos controles para R. flavipes (p ajustado < 0,001) y R. virginicus (p ajustado < 0,001) (Figura 2). Para el tratamiento con M. Roberts, la frecuencia de LOM de R. flavipes fue significativamente mayor que la de R. virginicus (p ajustado < 0,001). Sin embargo, para el tratamiento con M. brunneum, la frecuencia de las LOM de R. flavipes no fue significativamente diferente de la de las LOM de R. virginicus (p ajustada=1.000). A diferencia de M. brunneum, grupos de 12 termitas expuestas a conidias de M. Roberts dieron como resultado una respuesta conductual significativa.

3.2. Supervivencia de parejas desafiadas y solteros

La supervivencia de parejas de termitas separadas en diferentes momentos poco después del desafío con patógenos se comparó con la supervivencia de ejemplares únicos desafiados con índices de riesgo de muerte (HR). Un HR de 1 corresponde a una supervivencia igual en las parejas separadas y en los ejemplares únicos durante diez días. Valores inferiores a uno indican que hay una mortalidad reducida en las parejas separadas en comparación con los ejemplares únicos. La correlación entre el tiempo pasado en pareja y la reducción de la FC solo fue significativa para R. flavipes tratado con M. Roberts (r=−0.978, p=0.{ {7}}04) o M. brunneum (r=−0.983, p=0.003), y no para R. virginicus tratado con cualquiera de los dos M. Roberts (r=−0,643, p=0.242) o M. brunneum (r=−0,812, p=0.095). Esto también se refleja en los valores R2 de las regresiones lineales que se muestran en la Figura 3 (el tiempo se transformó logarítmicamente para calcular las correlaciones de Pearson y los valores R2). No se observó ninguna muerte en parejas no tratadas (6 parejas por cada especie de termita) y una muerte en 16 parejas tratadas (4 parejas por cada combinación de termitas/hongos) que nunca se separaron durante 10 días.

Figura 1. Supervivencia para grupos de 12. Rf corresponde con R. flavipes, Rv con R. virginicus, Mr con M. robertsii y Mb con M. brunneum. Las diferencias de supervivencia significativas para las comparaciones por pares se basaron en las pruebas de Breslow (pruebas de Wilcoxon generalizadas). *Diferencia significativa entre tratamientos, NS no hay diferencia significativa entre tratamientos (p< 0.025 Bonferroni adjusted α). The distribution of LOMs (Figure 2) among fungal and control treatments was significantly different (Kruskal–Wallis = 176.897, df = 5, p < 0.001). The frequency of LOMs was not significantly different between M. brunneum treatments and their respective controls for R. flavipes (adjusted p = 0.097) and R. virginicus (adjusted p = 1.000). However, the frequency of LOMs was significantly greater for M. robertsii treatments compared to their respective controls for R. flavipes (adjusted p < 0.001) and R. virginicus (adjusted p < 0.001) (Figure 2). For the M. robertsii treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was significantly greater than R. virginicus LOMs (adjusted p < 0.001). However, for the M. brunneum treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was not significantly different from R. virginicus LOMs (adjusted p = 1.000). In contrast to M. brunneum, groups of 12 termites challenged with M. robertsii conidia resulted in a significant behavioral response. 

Figura 1. Supervivencia para grupos de 12. Rf corresponde con R. flavipes, Rv con R. virginicus, Mr con M. robertsii y Mb con M. brunneum. Las diferencias de supervivencia significativas para las comparaciones por pares se basaron en las pruebas de Breslow (pruebas de Wilcoxon generalizadas). *Diferencia significativa entre tratamientos, NS no hay diferencia significativa entre tratamientos (p< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).

3.3. Actividad antifúngica de extractos crudos

Las dos especies de hongos se analizaron por separado (la viabilidad de los conidios en PDA difiere entre las dos especies). Para M. robertsii, las unidades formadoras de colonias (UFC) medias entre los tratamientos fúngicos y de control fueron significativamente diferentes (F=18.08, gl=2, p < 0 .001) (Figura 5a). Los extractos crudos de R. virginicus, pero no los trabajadores de R. flavipes, mostraron una actividad antifúngica significativa contra M. robertsii en comparación con el control (p ajustado < 0.001 y p=1.{{ 10}}, respectivamente). La actividad antifúngica de los extractos de R. virginicus contra M. robertsii fue significativamente mayor que la actividad antifúngica de los extractos de R. flavipes contra M. robertsii (p ajustado < 0,001). Para M. brunneum, las UFC medias (Figura 5b) entre los tratamientos fúngicos y de control fueron significativamente diferentes (F=27.26, gl=2, p <0,001). Los extractos crudos de R. virginicus pero no de R. flavipes mostraron una actividad antifúngica significativa contra M. brunneum en comparación con el control (p ajustado < 0,001 y p=0.072, respectivamente). La actividad antifúngica de los extractos de R. virginicus contra M. brunneum fue significativamente mayor que la actividad antifúngica de R. flavipes contra M. brunneum (p ajustado < 0,001).

Figura 2. Respuesta de alarma al desafío fúngico. Los diagramas de caja representan la distribución de LOM (LOM puntuados en 709 individuos marcados con pintura). Los cuadros corresponden a la distancia entre los cuartiles superior e inferior de la mediana (RIC). Los bigotes corresponden con 1,5 × IQR. Los círculos y asteriscos representan valores atípicos más allá de 1,5 × IQR o 3 × IQR, respectivamente. Letras diferentes indican diferencias significativas entre las distribuciones de los tratamientos fúngicos y de control (ajustado por Bonferroni). Rf corresponde con R. flavipes, Rv con R. virginicus, Mr con M. robertsii y Mb con M. brunneum.

3.4. Alojamiento compartido entre parejas desafiadas

La frecuencia de los episodios de acicalamiento disminuyó significativamente con las pruebas de hongos (media de la prueba {{0}}.55, media de control=8.80, t=−4.461, p <{{20}}.001). Sin embargo, la duración media del acicalamiento aumentó significativamente con los desafíos con hongos (media del desafío=19.01 s, media de control=5.62 s, t=4.876, p <0,001). La duración de los episodios de acicalamiento para cada interacción entre pares de termitas difirió significativamente entre tratamientos y controles (F=7.166, gl=5, p <0,001) (Figura 6). La duración del alojamiento por evento fue significativamente elevada en las parejas de R. flavipes tratadas con M. robertsii (p ajustado < 0,001) o M. brunneum (p ajustada=0.037) en relación con los controles, pero no en las parejas de R. virginicus tratadas con M. robertsii (p ajustado=1.000) o M. brunneum (p ajustado=1.000) en relación con los controles.

Figura 3. La supervivencia de dos termitas frente a una se comparó con los índices de riesgo de muerte (n=80 pares, 96 ejemplares únicos). Rf corresponde con R. flavipes, Rv con R. virginicus, Mr con M. robertsii y Mb con M. brunneum. El tiempo se transformó logarítmicamente para calcular los valores de R2.

Figura 4. Supervivencia de termitas individuales después de un desafío fúngico (n=96). Rf corresponde con R. flavipes, Rv con R. virginicus, Mr con M. robertsii y Mb con M. brunneum. Consulte el texto para obtener detalles sobre las diferencias estadísticas entre tratamientos. Las diferencias de supervivencia significativas para las comparaciones por pares se basaron en las pruebas de Breslow (pruebas de Wilcoxon generalizadas). *Diferencia significativa entre tratamientos (p < 0.025 Bonferroni ajustado).

Figura 5. Actividad antifúngica del extracto crudo contra M. robertsii (a) y M. brunneum (b). Los valores sobre las barras representan UFC medias (± DE), y letras diferentes indican diferencias significativas (ajustadas por Bonferroni). Rf corresponde con R. flavipes y Rv con R. virginicus. El análisis utilizó dos réplicas de 5 colonias de cada especie de termita, 6 réplicas para el control Rf y 2 réplicas para el control Rv.

Figura 6. Duración del alojamiento por interacción (n=161 eventos de alojamiento). Los valores sobre las barras representan la duración media de las interacciones de alojamiento (±SD), y las distintas combinaciones de letras indican diferencias significativas (ajustado por Bonferroni). Rf corresponde con R. flavipes, Rv con R. virginicus, Mr con M. robertsii y Mb con M. brunneum.

4. Discusión

R. flavipes depende de mecanismos sociales de defensa contra hongos patógenos locales en mayor medida que R. virginicus. Para los trabajadores de R. flavipes desafiados con cualquiera de las especies de Metarhizium, hubo una fuerte correlación negativa entre el tiempo que dos termitas pasaron juntas y su probabilidad de muerte en relación con las termitas individuales desafiadas. La tasa de riesgo de muerte en relación con las termitas individuales desafiadas se redujo a la mitad en aproximadamente dos horas (Figura 3). Por lo tanto, las interacciones sociales tempranas parecen ser críticas para la supervivencia cuando los trabajadores de R. flavipes encuentran bajas concentraciones de conidias de Metarhizium. Por el contrario, los trabajadores de R. virginicus mostraron una correlación débil entre el tiempo que dos termitas pasaban juntas y su probabilidad de muerte. Además, a diferencia de R. virginicus, las parejas de trabajadores de R. flavipes aumentaron significativamente la duración de los episodios de acicalamiento después de una exposición al hongo (Figura 6). Es probable que la detección de conidios en la cutícula de un compañero de nido haya provocado este aumento. La eliminación más eficaz de los conidios de las superficies cuticulares al aumentar la duración de los episodios de acicalamiento parece explicar la superior inmunidad social de R. flavipes. Nuestros resultados también indican que R. virginicus depende de mecanismos de defensa innatos individuales contra patógenos fúngicos locales en mayor medida que R. flavipes. La mortalidad de obreras individuales de R. flavipes expuestas a cualquiera de las especies de Metarhizium fue significativamente mayor que la mortalidad de las obreras de R. virginicus (Figura 4). Anteriormente se ha demostrado que la actividad antifúngica de los lavados cuticulares de los trabajadores de R. virginicus contra los conidios de Metarhizium es significativamente más fuerte que la actividad de los trabajadores de R. flavipes [20]. La actividad antifúngica de los extractos crudos de termitas enteras también fue más fuerte en R. virginicus que en R. flavipes (Figura 5). Estos extractos incluyen compuestos de simbiontes intestinales que, junto con compuestos antifúngicos de termitas, también pueden contribuir a eliminar las conidias ingeridas [26]. La variación en los índices de riesgo de muerte y su débil correlación con los tiempos de separación en los trabajadores de R. virginicus es consistente con una mayor dependencia de los mecanismos de defensa inmune innatos que varían entre los individuos en lugar de los mecanismos inmunes sociales. R. flavipes también mostró una mayor dependencia de la inmunidad social cuando grupos de 12 trabajadores estuvieron brevemente expuestos a altas concentraciones de conidios de M. robertsii. Inmediatamente después de la exposición a los conidios de M. robertsii, ambas especies de termitas mostraron LOM elevadas. Esta actividad de alarma fue significativamente mayor en R. flavipes que en R. virginicus (Figura 2), y la resistencia a infecciones fatales también fue significativamente mayor en R. flavipes que en R. virginicus (Figura 1). Por el contrario, hubo una respuesta de alarma elevada pero débil a los conidios de M. brunneum. De acuerdo con este resultado, se ha demostrado previamente que una alarma elevada en R. flavipes en respuesta a los conidios de diferentes cepas y especies de Metarhizium se correlaciona con un elevado acicalamiento y supervivencia [23]. Los trabajadores de R. flavipes pueden tener un umbral más bajo que los trabajadores de R. virginicus para reconocer y responder colectiva y eficazmente a la contaminación cuticular con conidios de M. robertsii. M. robertsii, que es la especie de Metarhizium más prevalente en nuestro sitio de estudio [24], puede representar una amenaza para R. flavipes que requiere una fuerte respuesta inmune social porque esta termita tiene defensas inmunes innatas relativamente débiles contra ella. Es probable que la eficacia de los compuestos antifúngicos asociados con las secreciones de las glándulas salivales sea esencial para las defensas individuales observadas en este estudio [20]. Estos compuestos están presentes en la superficie de los trabajadores antes de los desafíos fúngicos, ya que se expresan de manera constitutiva y se diseminan constantemente por los niveles basales de alogrooming, que por lo tanto integra las defensas individuales y sociales. Esta gestalt probablemente incluye el pequeño péptido antifúngico termicina, similar a la defensina, que se secreta en la glándula salival y es de vital importancia para la defensa contra infecciones fatales por Metarhizium [27]. Un estudio de R. flavipes y R. virginicus del mismo sitio de recolección en Maryland utilizado en este estudio reveló que las termicinas recientemente enfrentaron un barrido selectivo que resultó en una reducción en el polimorfismo de nucleótidos, y esta reducción fue mayor en R. flavipes que en R. virginico [28].

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

El barrido puede haber sido, y posiblemente siga siendo, más severo para R. flavipes porque R. virginicus tiene mecanismos inmunes innatos más efectivos que redujeron su dependencia de las termicinas para defenderse contra una reciente epidemia de hongos. Alternativamente, las limitaciones adaptativas en la evolución de las termitas (falta de variación genética) pueden haber dejado a R. flavipes con armas más débiles frente a una nueva epidemia de hongos. La limitación del cambio adaptativo en las termicinas bajo una fuerte presión selectiva también es evidente en los Nasutitermes australianos [29]. El proceso estocástico de duplicación genética parece haber liberado esta restricción en diferentes linajes nasute, lo que resultó en la evolución repetida de dos termicinas con diferentes cargas moleculares. Esto puede haber beneficiado la defensa antifúngica porque dos terminales con diferentes propiedades de carga restringen las oportunidades para la evolución de resistencia fúngica a ellos. Las termitas que mostraban alarma (LOM) después de la exposición a una dosis alta de conidios tenían menos probabilidades de morir en dos semanas que las personas que no mostraban alarma. Los LOM se correlacionan positivamente con la agregación de trabajadores de R. flavipes y el acicalamiento [23], lo que sugiere que los individuos que mostraron alarma en este estudio solicitaron más acicalamiento a sus compañeros de nido. Los LOM rara vez se informan en investigaciones que investigan infecciones por Metarhizium en termitas y se ha descartado que desempeñen un papel en la señalización de la exposición a patógenos [30]. Sin embargo, pueden pasar desapercibidos porque no ocurren en individuos aislados, no son provocados sustancialmente por ciertas cepas y especies de Metarhizium, toman aproximadamente 3 minutos después de una exposición antes de que aumenten y desaparecen después de aproximadamente 30 minutos [22,23]. Nuestros resultados sugieren que los LOM comunican una alerta de emergencia después de la exposición a una dosis alta de conidios, que se detectan durante el acicalamiento. Sin embargo, los LOM no son necesarios para una respuesta conductual proactiva, ya que la duración del alojamiento aumentó después de una exposición a dosis bajas cuando los LOM eran insignificantes.

5. Conclusiones

Los LOM parecen ser parte de una respuesta de emergencia a la contaminación cuticular intensa que utiliza la comunicación en red para intensificar rápidamente la eliminación y destrucción de la mayoría de los conidios antes de que tengan la oportunidad de adherirse firmemente y germinar, lo que demora aproximadamente 12 horas [31]. Es probable que esta respuesta de emergencia resulte energéticamente costosa. La inmunidad social mejorada en R. flavipes en respuesta a M. robertsii puede ser una compensación adaptativa que R. virginicus no tiene que hacer en la misma medida porque tiene mecanismos inmunes innatos más efectivos. Cuando se enfrentan a bajos niveles de exposición a patógenos que los trabajadores que buscan alimento deben soportar habitualmente, el alojamiento también parece compensar los débiles mecanismos inmunológicos innatos.

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