El estrés oxidativo, el metabolismo energético disfuncional y los neurotransmisores desestabilizadores alteraron el perfil metabólico cerebral en un modelo de rata de buceo de saturación de heliox simulado a 4.0 MPa Ⅱ

Procedimiento de extracción de tejido

El procedimiento de extracción de metabolitos polares de muestras de tejido fue una modificación menor según lo informado [18]. Las muestras de tejido congeladas previamente pesadas se descongelaron en hielo y luego se sometieron a homogeneización mecánica en un sistema solvente de agua-cloroformo-metanol grado HPLC helado (400 μL, 400 μL y 285 μL, respectivamente, por 100 mg de tejido cerebral) utilizando un homogeneizador de tejidos (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Francia). Los homogeneizados resultantes se mantuvieron en hielo durante un período de 30 min y luego se centrifugaron a 12,000 xg durante un período de 10 min a 4˚C. A continuación, se extrajo el sobrenadante de cada muestra y se liofilizó para obtener un polvo que contenía metabolitos polares en un liofilizador (FD-1A-80, BIOCOOL, China). Cada muestra de polvo se reconstituyó posteriormente con 550 μl de tampón PBS con 0,1 % de TSP y, a continuación, todas las muestras se mezclaron por rotación y se centrifugaron a 12,000 xg durante un período de 20 min a 4 °C. Luego se transfirió una alícuota de 500 μL de sobrenadante a un tubo de RMN de 5,0 mm de diámetro (Norrel, Reino Unido). El principio de extracción de proteína en la muestra de corteza fue como se describió anteriormente sin modificaciones. La cantidad exacta de muestras de corteza se vertió en un tampón de homogeneización (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 por ciento de Triton X-100, aprotinina, pepstatina A y leupeptina 10 ug/ml cada uno) y homogeneizado manualmente en baño de hielo. La mezcla se centrifugó a 1,000 xg durante un período de 10 min a 4 °C, y el sobrenadante se usó para cuantificar las concentraciones de proteína mediante la prueba de Bradford.

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Ensayo bioquímico

Se aplicó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) sensible y competitivo con kits de ensayo para la cuantificación de las enzimas metabólicas Na-KATPase y AChE y los neurotransmisores DA, E, NE, 5HT y GABA. ELISA también determinó los niveles de SOD, MDA y GPx en tejido cortical con kits de ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

medición de RMN

La cuantificación eficiente de los metabolitos tisulares se logró utilizando una plataforma analítica basada en un espectrómetro líquido de alta resolución Bruker Avance-III NMR equipado con una sonda criogénica de alta sensibilidad que opera a una frecuencia de 600. 17 MHz para observación de 1 H a 298 K. Se aplicó una secuencia de pulso (RD-90˚-ACQ) de 1 H ZGPR (TOPSPIN versión 3.0, Bruker Biospin) unidimensional suprimida con agua a adquirir datos de RMN para cada muestra. Se registraron cuatro escaneos ficticios y 128 transitorios en un dominio de tiempo de 32 K puntos de datos utilizando un ancho espectral de 20 ppm con un retraso de relajación de 10,0 s y un tiempo de adquisición de 2,73 s. Se aplicó una función de ampliación de línea exponencial de 0,3 Hz y relleno de cero a 64 K puntos de datos a todos los decaimientos de inducción libres (FID) antes de la transformación de Fourier. Se emplearon técnicas adicionales de RMN bidimensional con espectroscopia de correlación de gradiente de campo pulsado (gCOSY) y espectroscopia de correlación total homonuclear 2D (TOCSY) usando programas de pulso estándar en muestras seleccionadas para confirmar las asignaciones de desplazamiento químico. Se utilizó un cambiador de muestras automatizado para la entrega continua de muestras en todas las adquisiciones de espectros.

Identificación y confirmación de metabolitos.

Las señales de RMN basadas en la ubicación de las resonancias individuales en los espectros se identificaron en el paquete de software Chenomx NMR Suite v. 8.4 (versión de evaluación). Las confirmaciones de algunas asignaciones de metabolitos se realizaron considerando cambios químicos, constantes de acoplamiento y patrones de multiplicidad de metabolitos como información sobre acoplamientos escalares extraídos de 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, bases de datos públicas de RMN como COLMAR y Human Metabolome base de datos (HMDB), y la literatura [18, 19].

Análisis estadístico multivariado

El protocolo de preprocesamiento utilizado para el preprocesamiento de cada espectro 1D 1 H NMR fue el mismo que el descrito en nuestro trabajo anterior [20]. Los espectros de RMN de 1H se escalonaron y se corrigieron con la línea base utilizando MestReNova (Mestrelab Research, SL, España), y la región espectral de cada metabolito se integró en un cubo. Las resonancias de la señal del disolvente orgánico y la región de la señal H2O/HOD residual se eliminaron en todos los espectros de RMN 1D 1H. En todos los espectros se aplicó un procedimiento de cubo 0.{{30}}03 Hz y normalización a la suma de la intensidad espectral multiplicada por 10000. Solo se seleccionaron los valores de cubo más grandes en un pico para el análisis del siguiente paso para evitar la interpretación errónea de los metabolitos discriminantes debido a la superposición de señales. Posteriormente, se extrajeron cubos integrales de 47 metabolitos y se sometieron a análisis de datos univariados y multivariados. El análisis de indiscriminación por análisis de componentes principales (PCA) y el análisis de discriminación por análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y el análisis discriminante de proyecciones ortogonales a estructuras latentes (OPLS-DA) se realizaron utilizando el paquete de software SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics , Umeå, Suecia) escalados a datos de varianza unitaria. Los gráficos de puntuación de PCA y PLS-DA se ilustraron con el primer y el segundo componente principal (t[1], t[2]), mientras que el gráfico de puntuación de OPLS-DA utilizó t[1] y el componente ortogonal (to[1 ]). Los parámetros Q2 (cum), R2Y (cum) y R2X (cum) se calcularon para probar la solidez de los modelos de discriminación contra el sobreajuste [21]. Como se describió anteriormente, un valor de evaluación de calidad de Q2 � 0.4 se considera un modelo confiable. La estrategia de validación cruzada de siete veces y la prueba de permutación 200 veces con el primer componente se aplicaron para protegerse contra el sobreajuste del modelo y validar aún más la confiabilidad y confiabilidad de los modelos. Si la línea de regresión de Q2 tenía una intersección negativa y los valores de Q2 ajustados en el punto más a la izquierda eran mayores que todos los valores de Q2 de los puntos de la derecha en la prueba permutada, el modelo OPLS-DA establecido era sólido [22]. Se aplicó la estrategia de validación cruzada 10-fold predeterminada para evitar el sobreajuste del modelo. En general, un estadístico de evaluación de la calidad (Q2) � 0,4 se considera un modelo confiable, como se describió anteriormente. Los coeficientes de correlación (r) y los valores de VIP extraídos de los modelos OPLS-DA se utilizaron para identificar los metabolitos que contribuyeron significativamente a la separación entre los dos grupos. Además, los cambios de pliegue de metabolitos entre grupos se calcularon usando una función. IA/IB, donde IA e IB representan los valores medios para el metabolito integral en los grupos A y B, respectivamente. El mapa de calor y los gráficos de caja se trazaron para facilitar la comprensión de las variaciones de metabolitos entre los grupos.

Estadísticas univariadas de integrales de metabolitos

El promedio del cubo de metabolitos en cada grupo se expresa como la media ± desviación estándar (DE). También se realizó un análisis univariante mediante ANOVA (análisis de varianza). Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se evaluaron mediante una prueba t no pareada de dos colas después de la conversión logarítmica en el software GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Las diferencias estadísticamente significativas se definieron mediante valores de p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Análisis de correlación metabólica estadística del sistema y análisis de conglomerados jerárquicos

El cálculo del coeficiente de correlación de Pearson y el análisis de conglomerados jerárquicos se realizaron en función de las integrales relativas de los metabolitos en R Studio (versión 1.4.1717) con scripts pequeños. Para cada par de grupos, la matriz de correlación se ilustró en un mapa de píxeles como se describe en la literatura [21]. Brevemente, para cada variable en un grupo, las correlaciones con valores de p menores que 0.05 se consideraron correlaciones estadísticas significativas y se mantuvieron para construir la red de correlación final para ilustrar las relaciones latentes de los metabolitos dentro del grupo. grupo y las relaciones metabólicas alteradas entre los grupos. Los cuadrados más rojos indican una correlación positiva más significativa. Los cuadrados más azules indican una correlación positiva más significativa. Los cuadrados blancos indican la correlación sin significación. El análisis de las vías y redes metabólicas cerebrales más relevantes invocadas como encuestados de HSD se realizó utilizando la herramienta MetaboAnalyst 3.0. Para el análisis de topología de vías realizado, se seleccionó la biblioteca de vías de mamíferos de Rattus norvegicus (rata). Este enfoque también se utilizó para proporcionar estimaciones del impacto de la ruta, la tasa de descubrimiento falso (FDR) y los valores de p.

Resultados Índices bioquímicos corticales de los grupos HSD y CON

Para validar los efectos de alteración metabólica de HSD en los tejidos cerebrales, los parámetros bioquímicos, incluidas las actividades enzimáticas metabólicas relacionadas con el metabolismo energético de Na-KATP, AChE y LDH, los neurotransmisores de DA, E, NE, 5HT y GABA, y elproteínas relacionadas con el estrés oxidativodeCÉSPED, MDA, y Gpx en los tejidos de la corteza ipsilateral de ratas HSD y CON también se determinaron (Tabla 1). En comparación con el grupo de control, los niveles de DA, E, NE y MDA aumentaron significativamente, mientras que los contenidos de Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD y Gpx disminuyeron en el modelo HSD. El límite de detección de los kits de ensayo utilizados en el presente trabajo se enumeró en la Tabla S3 en el archivo de materiales complementarios.

Tabla 1. La cuantificación de los parámetros bioquímicos se midió en tejido de la corteza de animales CON y HSD mediante ELISA con los kits de ensayo. (media ± DE). indica significación estadística.

Metabolitos identificados en espectros de RMN de 1H de muestras de tejido cerebral

La Fig. 3 muestra tres espectros de RMN de 1H representativos de la corteza (Fig. 3A), el hipocampo (Fig. 3B) y el cuerpo estriado (Fig. 3C) de una rata HSD. Se identificó una amplia gama de metabolitos destacados de acuerdo con los datos de RMN de 1 H de muestras de tejido cerebral, y son aniones de ácidos orgánicos (lactato (Lac), malonato (Maln), succinato (Suc), malato (Mal), fumarato (FMA ), 2-hidroxibutirato (2-HB), acetato (Ace), formiato (For), taurina (Tau), ascorbato (Asc), 2-hidroxibutirato (2HIB)), aminoácidos (leucina (Leu), isoleucina (Ile), valina (Val), alanina (Ala), glicina (Gly), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe), aspartato (Asp), glutamina (Gln), glutamato (Glu) , treonina (Thr), serina (Ser), lisina (Lys), asparagina (Asn)), neurotransmisores (-aminobutirato (GABA)), metabolitos relacionados con la energía (creatina (Cre), trifosfato de adenosina (ATP), monofosfato de adenosina ( AMP), metabolitos relacionados con fosfolípidos (ofosfoetanolamina (PEA), O-fosfocolina (Pcho), sn-glicero-3-fosfocolina (GPC)) y otros (mioinositol (MI), dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD más ), ácido nicotinúrico (Nic), N-acetilaspartato (NAA), nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato (NADP plus), UDP-N-galactosa (UDPGa), uridina (Uri), uracilo (Ura), cistidina (Cyt) uridina 5'-monofosfato (UMP), inosina 5'-monofosfato (IMP), inosina (Ino), colina (Cho), carnitina (Car), glutatión (GSH). La tabla S1 muestra información detallada sobre las asignaciones de metabolitos.

Alteraciones del perfil metabólico reveladas por análisis metabolómico

PCA, un enfoque de análisis exploratorio e imparcial de los espectros de RMN de 1H de todos los extractos de cerebro en diferentes regiones del cerebro, se creó por primera vez para revelar las principales tendencias metabólicas impulsadas por la exposición hiperbárica a un 400 msw ambiente de saturación de heliox. Un gráfico de dispersión de PC1 frente a PC2 obtenido de PCA (Fig. S1A–S1C) de datos de cubo integral reveló una cierta discriminación con cierta superposición entre las dos clasificaciones. Las investigaciones supervisadas de los modelos PLS-DA (S1A'–S1C' Fig) y OPLS-DA (Fig 4A–4C) exhibieron claras discriminaciones de clase de los perfiles metabólicos entre grupos. La figura 4 muestra los gráficos de puntuación del modelo OPLS-DA para la región de la corteza (A), la región del hipocampo (B) y la región del cuerpo estriado (C), mostrando una clara discriminación entre los grupos HSD y los controles. La alta variación explicada y la bondad de la predicción reflejada por los valores de R2X y Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig 4A–4C) y las gráficas de prueba de permutación (Fig 4'-4C'A) indicaron la robustez de los modelos supervisados ​​generados. El coeficiente de correlación (r) extraído de los gráficos de líneas S, la importancia variable en la proyección (VIP) y el valor p de las pruebas univariadas no paramétricas se recopilaron para evaluar los metabolitos significativos responsables de los patrones de discriminación de clases. Por lo tanto, al cumplir cualquiera de los tres criterios (el valor absoluto de r superior a 0.50, el valor de VIP superior a 1,0, junto con un valor de p inferior a 0,05), seleccionamos un panel de metabolitos estadísticamente significativos (Tabla 1) responsable de la separación entre los grupos CON y HSD. En la Tabla 1, los valores de cambio de pliegue superiores a 1 indican un nivel aumentado en el grupo HSD, mientras que los valores de cambio de pliegue inferiores a 1 indican un nivel reducido en el grupo HSD. Los valores SD medios de los metabolitos discriminativos se enumeran en la Tabla S2. Usando el análisis de conglomerados jerárquicos de metabolitos y el método de vinculación promedio, el mapa de calor generado (Fig. 5A–5C) con dendrogramas permite una mejor visualización de tres alteraciones metabólicas de la región del cerebro causadas por la exposición hiperbárica en un ambiente saturado de helio y oxígeno.

Trastornos metabólicos observados en diferentes regiones del cerebro de ratas HSD

El análisis multivariante y el análisis univariante mencionados anteriormente utilizando la altura del cubo de los metabolitos en los diferentes grupos proporcionaron un excelente tubo de trabajo para identificar metabolitos discriminativos que revelan las posibles alteraciones metabólicas neurológicas asociadas con los eventos de HSD. Se encontraron niveles elevados de AMP, FMA, Nic y Phe y una disminución de Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura y Uri en el tejido de la corteza del HSD grupo en comparación con el grupo CON (Fig. 5A, Tabla 1). Mientras tanto, en el hipocampo, Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr y Ura también disminuyeron y AMP aumentó en el grupo HSD, al igual que en la corteza. Además, Thr regulado al alza y Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc y DMA regulados a la baja se expresaron en extractos de hipocampo del grupo HSD en relación con los controles (Fig. 5B, 5D, Tabla 1). En comparación con el grupo CONS, los contenidos de Cyt, GABA, Ura, Cho y Thr también disminuyeron al igual que en la corteza y el hipocampo. Además, niveles elevados de aminoácidos de cadena ramificada (BCAA, incluidos Leu, Ile, Val) y Lys y niveles reducidos de Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, una serie de metabolitos de ATP, Tau, IMP, y Suc, que también disminuyó en el hipocampo, y otros dos metabolitos, Ino y Pcho, que también disminuyeron en la corteza, se observaron en los tejidos del cuerpo estriado de las ratas del grupo HSD (Fig. 5C, 5D, Tabla 1). Tantos metabolitos siempre indican vías moleculares implicadas con complejidad y diversidad. Se cuantificaron los valores de cubeta integral de los metabolitos discriminantes, y los cambios de pliegue estadísticamente significativos de sus concentraciones entre los grupos expuestos a la saturación de heliox hiperbárica y de control se resumen en la Tabla S2 y la Tabla 2 para las tres regiones cerebrales.

Fig. 4. Gráficos de puntuación del análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) y gráficos de prueba de permutación que discriminan el efecto de la exposición a la saturación de heliox de 400 msw en los espectros de RMN de 1H de los grupos de control en la corteza (CONC, n=8, HSDC, n=8, A y A') (R2X=0.38; Q2=0.46), hipocampo (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B y B') (R2X=0.37; Q2=0.43), y cuerpo estriado (CONS, n=8, HSDS, n=8, C y C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Los valores del parámetro Q2 en los gráficos de puntuación de OPLS-DA, que eran iguales o superiores a 0,40, junto con los valores de Q2 del punto más a la izquierda en los modelos permutados, eran mayores que todos los valores de Q2 ajustados de los puntos de la derecha (permutación). test 80 veces), indicando que los modelos OPLS-DA establecidos eran válidos.

Pcho, que también disminuyó en la corteza, se observó en los tejidos del cuerpo estriado de las ratas del grupo HSD (Fig. 5C, 5D, Tabla 1). Tantos metabolitos siempre indican vías moleculares implicadas con complejidad y diversidad. Se cuantificaron los valores de cubeta integral de los metabolitos discriminantes, y los cambios de pliegue estadísticamente significativos de sus concentraciones entre los grupos expuestos a la saturación de heliox hiperbárica y de control se resumen en la Tabla S2 y la Tabla 2 para las tres regiones cerebrales.

Fig. 5. Gráficos de mapa de calor y correlación estadística derivados de los valores de cubeta de los metabolitos discriminatorios de la corteza (A, A', las muestras de HSDC se encuentran en el panel superior y CONC en el panel inferior), el hipocampo (B, B', HSDH el grupo se encuentra en el panel superior y CONH se encuentra en el panel inferior), y el cuerpo estriado (las muestras C, C', HSDS se encuentran en el panel superior y CONS se encuentra en el panel inferior) tejidos de ratas HSD y CON. Los metabolitos en el mapa de calor están organizados por agrupación jerárquica basada en la similitud general en los patrones de nivel. Diagrama de Venn (D) que ilustra la superposición de metabolitos entre las comparaciones HSDC-CONC, HSDH-CONH y HSDS-CONS.

Análisis de correlación de metabolitos

La relación entre los metabolitos era tan compleja en la figura 5A'-5C'. Para los metabolitos energéticos, las correlaciones positivas para Lac vs Ala en HSDC, AMP vs IMP en HSDH, ATP vs Pcho en HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA en HSDS, y las correlaciones negativas para Lac vs Thr y GSH vs Suc en HSDH, Suc vs Val en HSDS estaban presentes en los gráficos de correlación de metabolitos. Para los neurotransmisores, las correlaciones positivas para GABA frente a Car en HSDC, GABA frente a Cho en CONH y GABA frente a Suc/Ino/Gln en HSDS estaban presentes en los gráficos de correlación de metabolitos. Las correlaciones negativas para GABA frente a FMA en CONC y GABA frente a NAA/Ura/NADP plus en CONS estaban presentes en los gráficos de correlación de metabolitos. Para los metabolitos relacionados conestrés oxidativo, elcorrelaciones positivaspara GSH vs Asn en el HSDC y el CONC, Tau vs Lac en el HSDH, Tau vs Suc/Ala en el CONH, las correlaciones negativas para GSH vs Suc en el HSDH, Tau vs Thr en el HSDH estuvieron presentes en la correlación de metabolitos parcelas

Análisis de rutas metabolómicas

El análisis cuantitativo de la vía, que consiste en el análisis del enriquecimiento de la vía y el impacto de la vía a partir de la topología de la vía, reveló modulaciones inducidas por HSD estadísticamente significativas en una serie de vías metabólicas. Las puntuaciones de impacto de la ruta, junto con la tasa de descubrimiento falso (FDR) y los valores de p, se describen en la figura 6. Las rutas se consideraron significativamente enriquecidas si los valores de p eran inferiores a 0.05; los metabolitos perfilados (aciertos) en relación con los metabolitos totales de la vía (estado de coincidencia) fueron superiores a 1; y las puntuaciones de impacto (que indican el impacto de los metabolitos significativamente afectados en la ruta según la medida de la topología de red de la centralidad relativa de intermediación) fueron superiores a 0. Las rutas en la corteza (Fig. 6A) con el mayor valor de impacto metabólico fueronfenilalanina, tirosina, ybiosíntesis de triptófano>metabolismo de la fenilalanina> metabolismo de las pirimidinas > metabolismo de la alanina, aspartato y glutamato. Las vías en el hipocampo (Fig. 6B) con el mayor impacto metabólico fueron la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano > metabolismo del glutatión > metabolismo de la glicina, serina y treonina > metabolismo de las purinas > metabolismo de las pirimidinas > metabolismo de la alanina, aspartato y glutamato > metabolismo del butanoato . Las vías en el cuerpo estriado (Fig. 6C) con el mayor impacto metabólico fueron metabolismo de alanina, aspartato y glutamato > metabolismo de nicotinato y nicotinamida > metabolismo de purina.

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