Parásitos, infecciones e inoculación en células mínimas sintéticas

ABSTRACTO: Las células mínimas sintéticas proporcionan un modelo controlable y modificable para procesos biológicos. Si bien son mucho más simples que cualquier célula natural viva, las células sintéticas ofrecen un chasis para investigar los fundamentos químicos de procesos biológicos clave. Aquí, mostramos un sistema celular sintético con células huésped, que interactúan con parásitos y sufren infecciones de diversa gravedad. Demostramos cómo se puede diseñar el huésped para resistir la infección, investigamos el costo metabólico de portar resistencia y mostramos una inoculación que inmuniza al huésped contra patógenos. Nuestro trabajo amplía la caja de herramientas de ingeniería de células sintéticas al demostrar las interacciones huésped-patógeno y los mecanismos para adquirir inmunidad. Esto acerca a los sistemas de células sintéticas un paso más a la hora de proporcionar un modelo integral de vida natural compleja.

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INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas, el campo de la biología sintética se ha disparado, permitiendo la construcción de células sintéticas que se asemejan y modelan aspectos de la vida biológica natural. Modelar rutas y comportamientos celulares en células sintéticas ofrece muchas ventajas sobre células vivas, como un entorno de reacción más simplificado y definido, control completo sobre la composición proteómica y química de la célula, la capacidad de compartimentar rutas y procesos biológicos que interfieren, así como mantener importantes sistemas biológicos que están ausentes en los sistemas de reacción in vitro.1,2 Estos activos únicos de las tecnologías de células sintéticas ya han permitido la simulación de condiciones y vías biológicas dentro de un biorreactor in vitro (célula sintética) realista y han aportado una mejor comprensión de muchas áreas de estudio, incluido el hacinamiento molecular,3 la dinámica de lípidos y proteínas,4 el metabolismo mínimo,5 y muchos otros aspectos críticos de la vida biológica.2 Estas células sintéticas realistas con sus activos únicos se están convirtiendo rápidamente en mejores modelos y arrojando más luz sobre el misterioso funcionamiento interno de la vida celular.6,7 Estos avances no se limitan a procesos unicelulares; Las interacciones de ingeniería entre poblaciones de liposomas también han demostrado ser una tecnología poderosa. Por ejemplo, se ha desarrollado el diseño de un sistema celular sintético que imita una relación depredador-presa utilizando la luz como señal entre estas poblaciones de células sintéticas.8 Se ha desarrollado otro trabajo complejo que permite la propagación de señales a través de una matriz de gotitas de células sintéticas. permitiendo que la fluorescencia se propague de manera espacial entre la población.9 Además de las interacciones entre células sintéticas y células sintéticas, también se han producido avances recientes en las interfaces entre células sintéticas y células vivas. Por ejemplo, se ha demostrado que una célula sintética diseñada para interactuar con una célula madre neural es capaz de inducir la diferenciación neuronal y actuar como un chasis generalizado capaz de interactuar con otros tipos de células.10 Ha habido innumerables avances en el desarrollo de propagación de señales y células sintéticas que actúan como interfaces, mucho de lo cual se explora en las siguientes revisiones.11-13 En resumen, existen campos completos de investigación relacionados con la imitación de las interacciones de poblaciones celulares en el sistema modelo de células sintéticas. A pesar de esto, no se ha realizado ningún estudio que utilice células sintéticas para modelar infección, parasitismo o inoculación. Así como las células sintéticas se utilizan comúnmente para modelar procesos biológicos complejos de una manera simplificada y controlada, existe la posibilidad de poder modelar estas complejas interacciones entre organismos. La importancia de esto se puede ver en el estudio innovador que produjo con éxito partículas de fagos activas dentro de una plataforma de expresión de proteínas libres de células.14 Nuestro objetivo es llevar este concepto al nivel macro mediante el diseño de poblaciones de células sintéticas que puedan infectarse activamente entre sí y secuestrarse. el genoma de una célula huésped, tal como lo hacen los virus y parásitos vivos. Ser capaz de aplicar y diseñar células sintéticas para modelar estos comportamientos patológicos proporcionará una herramienta valiosa a la comunidad científica.

En este trabajo, exhibimos nuestro sistema para modelar enfermedades de células sintéticas. Diseñamos una célula huésped que podría sufrir una infección a partir de la segunda población de células sintéticas parásitas e investigamos la competencia por recursos, el secuestro del genoma y la reutilización metabólica que ocurre durante dicha infección. También modelamos un método que permite el rescate del huésped después de la infección, así como un medio de inoculación que permitirá que el huésped resista la infección de las células sintéticas que causan la enfermedad. En resumen, presentamos un nuevo modelo de enfermedad e infección para células sintéticas. Con esta tecnología, las células sintéticas pueden comenzar a usarse como modelos rudimentarios para enfermedades, infecciones e inoculación (Figura 1).

Figura 1. Sistema de parásitos, infección e inoculación en células mínimas sintéticas. (a) El "huésped" es una célula sintética que expresa la proteína verde fluorescente (GFP). En la superficie de la membrana externa, el huésped lleva etiquetas de ADN ss. Las únicas proteínas que se traducen en un huésped sano son las proteínas propias de los plásmidos con los que se creó el huésped. (b) El "parásito" es un liposoma lleno de ADN plasmídico que codifica un gen para la proteína fluorescente mCherry, y la superficie del liposoma del parásito está decorada con una etiqueta de ADN ss (complementaria a la etiqueta en la superficie del huésped). La "infección" comienza con una fusión de los liposomas del huésped y del parásito, mediada por las etiquetas de ADN complementarias en su superficie. Después de la infección, el huésped expresa tanto el gen del huésped original (GFP) como el gen del parásito (mCherry). (c) La "infección" comienza con liposomas "patógenos" que portan un gen para la enzima de restricción MunI que se fusiona con los liposomas del huésped. El gen patógeno MunI es expresado por el huésped y la enzima de restricción MunI digiere el ADN del huésped. Esto da como resultado que el genoma nativo del huésped sea digerido, lo que convierte la mayor parte de la expresión de la proteína del huésped de GFP a la proteína codificada del patógeno, MunI. (d) La "infección letal" es una fusión del liposoma del huésped (con el genoma de GFP) con el liposoma del patógeno que contiene el gen que codifica aHL, una proteína de membrana. Después de la infección, el huésped expresa aHL, lo que crea poros en la membrana, lo que provoca una fuga de nutrientes del huésped y detiene efectivamente el metabolismo del huésped. (e) "Inmunización" es la incubación del huésped con ssDNA que contiene una secuencia compatible con las etiquetas de fusión en la superficie de los liposomas del huésped. El ADN inmunizante crea un dúplex con etiquetas de ADN del huésped, evitando la hibridación de otros oligonucleótidos de ADN con estas etiquetas. Esto evita la fusión de cualquier liposoma patógeno con el huésped. Esta es una figura de prueba de concepto y los gráficos tienen fines ilustrativos y representan cantidades relativas de proteína expresada por el huésped y varios patógenos. Los datos reales de cada sistema se proporcionan en las figuras siguientes.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este trabajo, utilizamos las palabras: huésped, parásito, infección, mortal, vacuna e inoculación, todo en el contexto de sistemas celulares sintéticos no vivos. Por infección "mortal" nos referimos a una marcada disminución de la traducción en la población de células sintéticas. Todos los experimentos de este trabajo se realizaron en células sintéticas que no están vivas, no se autorreplican y no evolucionan. Este es un sistema modelo para propiedades y procesos biológicos naturales.

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La infección de una célula sintética con una célula sintética parásita secuestra los recursos del huésped.

Para probar el concepto de un sistema celular sintético que imita una infección, comenzamos construyendo un sistema modelo para un parásito. Utilizamos el concepto más simple posible de parásito para reconstituir en este sistema bioquímico no vivo: un parásito que secuestra algunos de los recursos del huésped. En este caso, el metabolismo del huésped está representado por la expresión de la proteína GFP y el parásito está representado por la expresión de la proteína mCherry. Para este sistema, utilizamos el fenómeno previamente demostrado de rendimiento de expresión lineal de proteínas que depende de la concentración de la plantilla de ADN en TxTl.15,16 Primero, nos propusimos encontrar la concentración óptima de plásmido total en la que la proporción de GFP y ADN de mCherry corresponde a la proporción de fluorescencia observada de estas proteínas. Asignamos arbitrariamente el gen GFP como "huésped" y el gen mCherry como "parásito". Estos nombres no significan nada especial en este experimento en particular, pero indicarán el huésped y el parásito en experimentos posteriores con células sintéticas. Aquí, utilizamos estos nombres para que sea más fácil relacionar estos experimentos de prueba de concepto con experimentos posteriores de infección de células sintéticas que utilizan los mismos plásmidos. Mezclamos los plásmidos GFP y mCherry, con ambos genes bajo el control del promotor T7 en diferentes proporciones de plásmido y una concentración total de plásmido en las muestras de 1, 5, 10 o 15 nM (Figura 2b). Los resultados siguieron la relación casi lineal esperada entre la concentración de plásmido y la intensidad de fluorescencia registrada, observándose la mejor coincidencia entre las relaciones de fluorescencia y concentración de plásmido con un total de plásmido de 10 nM. La relación observada indica que los plásmidos, siendo las proteínas similares en tamaño y composición de aminoácidos (Figura S1), compiten por el mismo conjunto de recursos TxTl para su expresión. Cambiar la concentración relativa de los dos plásmidos da como resultado cambios en la eficiencia de expresión aproximadamente proporcionales a la proporción de los plásmidos. Esto indica que sería un buen modelo para imitar la infección del parásito: el genoma del parásito (plásmido mCherry) competirá con el genoma del huésped (plásmido GFP). A continuación, decidimos probar un caso en el que cualquiera de los plásmidos estaba bajo el control de un promotor más fuerte, imitando así un escenario de asignación de recursos sesgado. Para mantener el aspecto de competencia por recursos de los futuros experimentos de infección por "parásitos", mantuvimos ambos genes bajo el mismo promotor de la ARN polimerasa (la ARN polimerasa T7, T7 RNAP) pero variamos su fuerza. Utilizamos un fuerte promotor de RNAP de T7, T7Max, que demuestra un rendimiento de transcripción significativamente mayor, lo que resulta en rendimientos de traducción correspondientemente mayores, en TxTl.17 Probamos la configuración de reacción idéntica a la descrita anteriormente: dos plásmidos en diferentes proporciones, probados con un total final variable. concentraciones de plásmidos. Uno de los plásmidos estaba bajo el control del fuerte promotor T7Max, mientras que el otro estaba bajo el promotor canónico T7. En ambos casos de prueba, la expresión del plásmido T7Max fue lo suficientemente fuerte como para que la fluorescencia de la proteína de un gen bajo T7Max no aumentara significativamente con el aumento de la concentración total del plásmido (Figura 2c, 2d). No parecía importar si T7Max impulsaba GFP o mCherry, ambas proteínas respondieron al promotor más fuerte con un aumento relativo similar. Esto proporcionó un modelo prometedor para la infección con un parásito "más fuerte" (un parásito que porta un gen bajo T7Max en un huésped bajo T7) y un huésped inverso, más fuerte que resiste a un parásito más débil (un huésped con genoma bajo T7Max y un parásito que porta el gen T7). Alentados por estos experimentos de prueba de principio, pasamos a experimentos con células sintéticas.

La "infección", en todos los casos, es la fusión de una célula sintética del huésped y del parásito. La fusión se facilita mediante etiquetas de ADN en la superficie de los liposomas, utilizando el sistema de fusión inducible por ADN descrito anteriormente.18 Brevemente, las células sintéticas se crearon con Escherichia coli TxTl dentro de una membrana de POPC y colesterol, y se decoró la valva exterior. con ADN monocatenario anclado a la membrana mediante modificación del colesterol. Si un par de liposomas con etiquetas complementarias se encuentran, las etiquetas de ADN se hibridan, uniendo las membranas e iniciando la fusión de membranas, seguida de la mezcla de lúmenes. En nuestros experimentos, la célula sintética huésped es el liposoma que contiene TxTl con T7 RNAP además del genoma de una GFP codificada por plásmido. El seguimiento de la fluorescencia de GFP sirve como indicador de la "salud" del metabolismo del huésped. El parásito entrante contiene un genoma en forma de plásmido que codifica mCherry, el sistema de traducción completo, pero no contiene ARN polimerasa T7. Esto asegura que cualquier cambio observado en el metabolismo del huésped sea el resultado de los genes introducidos por el parásito y no de la fusión del parásito y los liposomas del huésped, diluyendo el citoplasma del huésped. Los experimentos de infección del parásito se llevaron a cabo con la membrana del huésped marcada con Marina Blue DHPE, un tinte lipídico de membrana azul. Esto nos permitió normalizar la fluorescencia observada de los genes del huésped y del parásito a la fluorescencia azul, normalizando los resultados a la cantidad total de fluorescencia de la membrana del huésped presente en la muestra. Esto tiene en cuenta las diluciones del volumen total de la muestra después de la adición de liposomas de parásitos. Las membranas del parásito no estaban marcadas con fluorescencia. Todos los experimentos fueron acompañados por una muestra de control, donde solo estaba presente una población como huésped, pero con el plásmido mCherry, para mostrar los niveles teóricos máximos posibles de expresión de mCherry si fuera el único gen en la población. En la primera serie de experimentos, mezclamos el huésped y el parásito con genes ambos bajo el control del promotor T7 regular.de modo que tanto los genes del huésped como los del parásito eran igualmente "fuertes". Mezclamos el huésped con el parásito de modo que el parásito estuviera en el 25, 50 o 75% de la población total de liposomas. En todos los casos, la fluorescencia de GFP del huésped disminuyó en presencia del parásito, con el correspondiente aumento de la fluorescencia del parásito mCherry (Figura 2e). Las muestras que sólo contenían el parásito y ningún huésped no produjeron fluorescencia de ninguno de los colores, como se esperaba. En todos los casos, la fusión de liposomas mediada por ADN no es 100% eficiente;18,19 Por lo tanto, la disminución relativa de la fluorescencia del huésped y el aumento de la fluorescencia del parásito no fueron tan grandes como el valor teórico esperado basado en la proporción entre huésped y parásito. En otras palabras, la infección no fue 100% eficaz. Esta cualidad fortuita del sistema de fusión inducida por ADN fue, en este caso, una característica beneficiosa del sistema. Como en el caso de la infección natural, la infección mediada por fusión de células sintéticas no afectó a todos los huéspedes y no todos los parásitos encontraron un huésped. A continuación, investigamos dos casos en los que el huésped y el parásito no coincidían uniformemente en la fuerza de sus genomas. En un caso, el genoma del huésped estaba bajo el control del promotor T7 mientras que el genoma del parásito estaba bajo el promotor T7Max (Figura 2f), y en el escenario opuesto, el genoma del huésped estaba bajo T7Max y el genoma del parásito estaba bajo el promotor T7. (Figura 2g). En el caso del huésped más débil atacado por un parásito más fuerte, el aumento relativo en la fluorescencia parásita de mCherry y la correspondiente disminución en la fluorescencia de GFP del huésped fueron mucho más fuertes que en el caso anterior de un huésped y un parásito uniformemente emparejados. Como se esperaba, cuando el huésped era más fuerte que el parásito, ocurrió lo contrario: los niveles de fluorescencia de mCherry fueron más bajos y la disminución relativa en la fluorescencia de GFP fue menor que en el caso igualado. Esto se ilustra mejor comparando un solo punto de datos bajo las mismas condiciones de infección: con una proporción de parásitos del 75%. Las poblaciones de parásitos y huéspedes uniformemente coincidentes dan como resultado una fluorescencia del parásito ligeramente mayor que la del huésped. Cuando el parásito es más fuerte, la fluorescencia del parásito es significativamente mayor que la del huésped. Y cuando el huésped es más fuerte, la fluorescencia del parásito es ligeramente menor que la del huésped. Estos puntos de datos resaltados están marcados con una estrella amarilla en la Figura 2e-g. Realizamos el experimento de control de un huésped infectado con un parásito "asintomático", un parásito que porta un plásmido con el promotor T7 pero sin una secuencia codificante de proteína (eliminamos el casete mCherry del plásmido) (Figura 2h). La fluorescencia de GFP del huésped disminuye mínimamente a niveles más altos del parásito, lo que indica que una pequeña cantidad de recursos del huésped se dedica a transcribir el ARN corto no codificante del plásmido del parásito. Estos datos también confirman que la principal carga metabólica de la infección del parásito en el huésped radica en la utilización de recursos traduccionales, no transcripcionales. Esta observación coincide con observaciones previas de que la traducción es el recurso más variable y limitante en los sistemas libres de células.20 En general, estos experimentos proporcionan un modelo para la infección con un parásito que secuestra los recursos metabólicos del huésped, con comportamientos celulares sintéticos que imitan Aspectos de una relación natural huésped-parásito.

Figura 2. La infección por parásitos secuestra los recursos del huésped. (a) El liposoma de la célula sintética huésped contiene un sistema de traducción libre de células y un plásmido que codifica GFP. La superficie del huésped está decorada con etiquetas de ADNss. El liposoma del parásito contiene un plásmido que codifica mCherry, con un sistema de traducción pero sin ARN polimerasa (por lo que el parásito no puede expresar mCherry). La superficie del parásito está decorada con etiquetas de ADN ss complementarias a las etiquetas de la superficie del huésped. Las etiquetas de ADN facilitan la fusión de los liposomas del huésped y del parásito y el huésped expresa tanto su propia GFP genómica como el genoma del parásito que contiene mCherry. (b-d) Prueba de principio para los genomas del huésped (GFP) y del parásito (mCherry) que compiten por los mismos recursos celulares sintéticos. Estos experimentos se realizan en solución TxTl, no en liposomas. Se mezclaron dos plásmidos, que codifican GFP y mCherry, en la proporción indicada por los íconos de plásmidos a la izquierda del mapa de calor, con la concentración total de ADN de la muestra indicada en la fila sobre el mapa de calor. La fluorescencia se midió en los canales verde (GFP) y rojo (mCherry). Cada plásmido se probó en dos variantes con promotores de diferente potencia: con T7 y con el promotor más fuerte T7Max. Los datos individuales para todos los mapas de calor se proporcionan en las Figuras S2 a S4. En las Figuras S5-S7 se proporcionan cursos de tiempo individuales representativos para la expresión de proteínas del huésped y el parásito T7 y para el parásito T7Max en las Figuras S8-S10. (e-g) Infección del huésped con el parásito. En cada experimento, los liposomas del huésped se mezclan con liposomas del parásito. La fusión del parásito con el huésped proporciona ADN mCherry parásito, que se expresa junto con el ADN GFP del huésped. Se probaron diferentes proporciones entre el huésped y el parásito, como lo indican los íconos debajo de los gráficos de barras. El genoma del huésped bajo el promotor T7 se infectó con un parásito con su genoma bajo el panel del promotor T7 (e) y con un parásito con su genoma bajo el panel del promotor T7Max (f), el huésped también se creó con un genoma T7Max y se infectó. con el parásito con un panel del genoma T7 (g). En la Figura S11 se proporcionan cursos de tiempo individuales representativos para la expresión de proteínas. En la Figura S12 se proporcionan experimentos similares con concentraciones de lípidos totales más altas y más bajas. En la Figura S13 se proporcionan trazas de purificación por exclusión de tamaño que muestran la estabilidad de las vesículas después de la fusión. (h) Infección por parásito incompatible: el parásito porta el promotor T7 pero ADN no codificante. Las barras de error indican SEM, n=3. Los valores de fluorescencia en los paneles (e-h) se normalizan con respecto a la fluorescencia azul de un tinte de membrana para normalizar los resultados con respecto a la concentración de células huésped. Todas las series de muestras etiquetadas como "huésped infectado con GFP" son experimentos en los que el huésped y el parásito tenían etiquetas de ADN complementarias en la superficie, lo que permitía la fusión de los liposomas, lo que se denomina infección. Las series etiquetadas como "huésped GFP sano" muestran muestras en las que el huésped y el parásito se mezclaron en las proporciones mostradas, pero no contenían etiquetas de fusión complementarias, lo que hacía imposible la infección. El diamante en los paneles (e-h) indica una condición de infección particular que ilustra mejor las diferencias en las intensidades de expresión del huésped y del parásito en los paneles (e-g) y los beneficios de la inmunidad del huésped en el panel (h). En la Figura S14 se ofrece una comparación directa de los valores del huésped y del parásito indicados por la estrella. Los datos de la infección con un parásito sin ningún plásmido se muestran en la Figura S15.

La infección de una célula sintética puede destruir el genoma del huésped.

El parásito descrito anteriormente expresaba un genoma que codifica mCherry utilizando recursos del huésped, pero el huésped mantuvo parte de su metabolismo y continuó expresando GFP a pesar de la infección. A continuación, decidimos investigar un sistema en el que la infección da como resultado una toma completa del metabolismo del huésped por parte del parásito mediante la destrucción del genoma del huésped (Figura 3a). Para diseñar tal escenario, investigamos una digestión con enzimas de restricción de un plásmido en TxTl. En los experimentos de prueba de principio, se expresó una enzima de restricción MunI en TxTl sin liposomas. El plásmido MunI se mezcló con el plásmido GFP en diferentes proporciones. Si el plásmido GFP no contiene sitios de restricción MunI, la disminución relativamente pequeña en la fluorescencia de GFP observada puede explicarse por la competencia descrita anteriormente entre los dos plásmidos por los recursos de TxTl. Si el plásmido GFP tiene un sitio de restricción MunI, la fluorescencia de GFP disminuye significativamente y la disminución aumenta proporcionalmente a una cantidad creciente del plásmido que codifica MunI (Figura 3b). La expresión de MunI se controló mediante Western Blot y se amplió proporcionalmente con la concentración del plásmido (Figura 3c).

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Alentados por estos resultados, pusimos en marcha un experimento de infección con células sintéticas. El huésped portaba el plásmido GFP y el patógeno portaba el plásmido MunI. La concentración de plásmidos GFP y MunI se estableció en 2 mM, muy por debajo de la concentración de saturación de plásmido para TxTl.21 Pretendíamos permanecer por debajo de la concentración total de plásmido en la que la expresión del huésped y del parásito sería lo suficientemente alta como para competir directamente por recursos limitados ( como en el caso descrito anteriormente de un parásito simple), en lugar de intentar medir principalmente el efecto de la enzima del parásito que destruye activamente el genoma del huésped. Al igual que en los experimentos con parásitos descritos anteriormente, el huésped contenía ARN polimerasa bacteriana TxT1 y T7, el patógeno solo llevaba extracto celular sin ARN polimerasa T7, y tanto el huésped como el patógeno estaban marcados con etiquetas de fusión de ADN complementarias. La membrana del huésped se marcó con Marina Blue DHPE para normalizar los resultados de fluorescencia con respecto a la concentración de los liposomas del huésped. El huésped y el patógeno se mezclaron en proporciones variables, siendo el patógeno el 25, el 50 o el 75% de la población total. La fluorescencia del huésped "infectado", donde el huésped y el patógeno contenían etiquetas de fusión complementarias, disminuyó con una cantidad creciente de patógeno. La fluorescencia de GFP del huésped "sano", donde el patógeno no contenía etiquetas de fusión complementarias, no disminuyó en presencia de ninguna cantidad de patógeno. Las muestras con solo el patógeno no produjeron fluorescencia mensurable (Figura 3d). La expresión de la proteína MunI patógena se cuantificó mediante análisis de transferencia Western, y se muestran datos para la serie de muestras del huésped infectado (Figura 3e). A continuación, investigamos la infección en el caso de un huésped inmune al patógeno: el plásmido GFP del huésped no tenía un sitio de restricción MunI (Figura 3f). La fluorescencia del huésped después de la infección disminuyó, pero no fue tan significativa como en el caso anterior de un huésped con un sitio MunI en el genoma. La proteína patógena MunI se expresó en niveles comparables a experimentos de infección anteriores (Figura 3g), por lo que la carga metabólica en el huésped fue similar. La disminución de la fluorescencia del huésped infectado en estos experimentos se debe a que algunos de los recursos del huésped son secuestrados por el patógeno que expresa MunI, pero debido a que la concentración total del plásmido es mucho menor que en los experimentos anteriores con patógenos simples, la disminución de la fluorescencia del huésped es menos significativa. Este experimento también confirma que la disminución de la fluorescencia del huésped con un sitio MunI (Figura 3d) fue causada por los tiempos de expresión de proteínas proporcionados en la Figura S22. (g) La expresión de MunI se rastreó mediante análisis de transferencia Western a través del experimento para las muestras que se muestran en la serie "infectadas con GFP" en el panel (f). Las barras de error en todos los paneles indican SEM, n=3. Los valores de fluorescencia en los paneles (d, f) se normalizan con respecto a la fluorescencia azul del tinte de membrana utilizado para normalizar los resultados con respecto a la concentración de las células huésped. La fluorescencia en el panel (b) se normaliza al plásmido MunI 0 mM para cada serie de muestras. Los símbolos de diamantes en los paneles (d, f) resaltan una condición particular que ilustra mejor las diferencias en las respuestas a la infección de un huésped susceptible al panel de patógenos (d) e inmune al panel de patógenos (f). Todas las series de muestras etiquetadas como "infectadas con GFP" son experimentos en los que el huésped y el patógeno tenían etiquetas de ADN complementarias en la superficie, lo que permitía la fusión de los liposomas, lo que se denomina infección. La serie denominada "GFP saludable" muestra muestras en las que el huésped y el patógeno se mezclaron en las proporciones mostradas pero no contenían etiquetas de fusión complementarias, lo que hacía imposible la infección.

Figura 3. La infección destruye el genoma del huésped y secuestra sus recursos. (a) Las células huésped contienen un plásmido que codifica GFP, con dos sitios de restricción MunI; el patógeno contiene un plásmido que codifica la enzima de restricción MunI. Después de la fusión del huésped y el patógeno, el huésped TxTl expresa la enzima de restricción MunI, que luego digiere el genoma del huésped. (b) Los experimentos de prueba de principio para la infección: el plásmido GFP se preparó con y sin sitios de restricción MunI. El plásmido GFP se mezcló con el plásmido MunI y se registró la expresión de GFP. Estos experimentos se realizaron en solución TxTl sin liposomas. En las Figuras S16 y S17 se muestra la prueba de principio para el experimento de infección, con la enzima MunI agregada externamente en lugar de expresarse en TxTl. En la Figura S18 se proporcionan cursos de tiempo de expresión de proteínas representativos. (c) La expresión de MunI se controló mediante análisis de transferencia Western; la intensidad de la banda MunI se cuantificó en las mismas muestras que los resultados de fluorescencia mostrados en el panel (b) para la serie "sitio MunI ausente". En la Figura S19 se proporciona una transferencia Western representativa de la enzima de restricción MunI. ( d ) Fluorescencia de GFP del huésped mezclada con liposomas patógenos en la proporción que se muestra en el gráfico de datos. El plásmido GFP huésped tiene dos sitios de restricción MunI. En la Figura S20 se proporcionan cursos de tiempo de expresión de proteínas representativos. En la Figura S21 se proporcionan datos para experimentos de infección con etiquetas de fusión incompatibles. (e) La expresión de MunI se rastreó mediante análisis de transferencia Western a través del experimento para las muestras que se muestran en la serie "infectadas con GFP" en el panel (d). ( f ) Fluorescencia de GFP del huésped mezclada con liposomas patógenos en la proporción que se muestra en el gráfico de datos. La GFP del huésped no tiene sitios de restricción MunI, lo que le otorga inmunidad a la proteína patógena. En la Figura S22 se proporcionan cursos de tiempo de expresión de proteínas representativos. (g) La expresión de MunI se rastreó mediante análisis de transferencia Western a través del experimento para las muestras que se muestran en la serie "infectadas con GFP" en el panel (f). Las barras de error en todos los paneles indican SEM, n=3. Los valores de fluorescencia en los paneles (d, f) se normalizan con respecto a la fluorescencia azul del tinte de membrana utilizado para normalizar los resultados con respecto a la concentración de las células huésped. La fluorescencia en el panel (b) se normaliza al plásmido MunI 0 mM para cada serie de muestras. Los símbolos de diamantes en los paneles (d, f) resaltan una condición particular que ilustra mejor las diferencias en las respuestas a la infección de un huésped susceptible al panel de patógenos (d) e inmune al panel de patógenos (f). Todas las series de muestras etiquetadas como "infectadas con GFP" son experimentos en los que el huésped y el patógeno tenían etiquetas de ADN complementarias en la superficie, lo que permitía la fusión de los liposomas, lo que se denomina infección. La serie denominada "GFP saludable" muestra muestras en las que el huésped y el patógeno se mezclaron en las proporciones mostradas pero no contenían etiquetas de fusión complementarias, lo que hacía imposible la infección.

La infección de una célula sintética puede ser "mortal", agotando los recursos de la célula huésped, y dichas infecciones pueden "tratarse" para lograr una función de rescate.

Los experimentos con parásitos y patógenos anteriores demostraron que las células sintéticas pueden usarse como modelo para la infección, donde un patógeno secuestra los recursos del huésped. A continuación, decidimos investigar un escenario en el que la infección hace que el metabolismo del huésped deje de funcionar después de la expresión de la proteína patógena. En este caso, el patógeno es comparable a la infección con una bacteria que expresa una toxina mortal menos el aspecto de replicación del huésped o parásito, ya que estas células sintéticas no se replican (Figura 4a). Para diseñar este sistema, elegimos la hemolisina (aHL), una toxina natural y una proteína de membrana ampliamente utilizada en la ingeniería de células sintéticas para crear poros de membrana no específicos.22,23 Apreciamos la ironía de esta elección, ya que Staphylococcus aureus expresa naturalmente aHL como una toxina, y la proteína fue posteriormente apropiada para diseñar el transporte de membrana y prolongar el metabolismo de las células sintéticas.24 Aquí, volvemos a utilizar aHL por su papel natural como toxina dañina producida por una infección. Otro ejemplo notable relacionado con la ingeniería de células sintéticas del uso de la toxicidad de aHL para causar la muerte celular natural proviene de la aplicación de células sintéticas como tecnología de terapia contra el cáncer.25 Como prueba de principio, establecimos que la expresión de una alta concentración de aHL en vesículas de células sintéticas da como resultado una fuga de contenido celular y una disminución significativa en la expresión de GFP dentro de la célula. Este efecto puede revertirse si el exterior de los liposomas contiene todas las moléculas pequeñas necesarias para TxTl (Figura 4b). En nuestro sistema modelo huésped-patógeno, el huésped contiene un plásmido que codifica GFP y el patógeno contiene un plásmido que codifica aHL. El diseño de todos los experimentos de infección es similar a los escenarios de parásitos y patógenos descritos anteriormente, donde el patógeno no porta T7 RNAP y tanto el huésped como el patógeno están decorados con etiquetas de fusión de ADN. Curiosamente, observamos que en concentraciones más bajas de patógenos (el patógeno representa el 25 o el 50% de la población total), la fluorescencia del huésped disminuye solo ligeramente. Sin embargo, aumentar la concentración del patógeno al 75% da como resultado una disminución significativa en la fluorescencia de GFP del huésped (Figura 4c). Especulamos que este resultado podría deberse a la fuga relativamente lenta de nutrientes de las células sintéticas en una concentración más baja de aHL. La fluorescencia de GFP se midió sólo después de 12 h de incubación y GFP es una proteína muy estable. Por lo tanto, es posible que en el caso de concentraciones más bajas de aHL (menor cantidad de patógeno), la fuga de nutrientes causada por aHL fuera lo suficientemente lenta como para que las células huésped acumularan cantidades significativas de GFP antes de que los efectos de la fuga inducida por aHL se volvieran paralizantes. el metabolismo. Para desacoplar los resultados de la competencia simple por los recursos entre los genomas del huésped y del parásito, realizamos experimentos de "infección con rescate" en los que el tampón externo contenía todas las moléculas pequeñas que componen las mezclas de energía, aminoácidos y sales de TxTl. Esto se configuró de manera similar a la condición de "nutrientes externos" probada en la Figura 4b. La disminución de la fluorescencia del huésped en estos experimentos fue similar a la de las muestras anteriores de "infección sin rescate" con niveles del 25 y 50% del patógeno. La disminución de la fluorescencia del huésped al 75% del patógeno fue significativamente menor que la disminución observada en muestras sin rescate (Figura 4d). La gran diferencia en los resultados del experimento con el 75% del parásito, con los puntos de datos en los paneles de la Figura 4 (c, d) resaltados con una estrella, parece respaldar nuestra hipótesis de que concentraciones más altas de aHL causan daño en las primeras etapas de la reacción. A una concentración de patógeno más baja, la fuga es lo suficientemente lenta como para que la GFP del huésped se acumule (como se ve con y sin nutrientes de rescate), por lo que la fluorescencia de GFP observada disminuye después de la infección, principalmente debido a la competencia por los recursos. A concentraciones más altas de patógenos, la fluorescencia de GFP en muestras con nutrientes externos disminuye principalmente debido a la competencia por recursos. Estos experimentos demuestran que podemos diseñar células sintéticas para modelar la infección, lo que produce dos resultados diferentes: la penalización metabólica de la infección en sí (disminución de la GFP debido a la competencia por los recursos) y una infección más "mortal" resultante de la abolición de la expresión de proteínas de los huéspedes. Alentados por esta observación, decidimos investigar un sistema en el que las células sintéticas pudieran resistir activamente una infección patógena e investigar la penalización metabólica de tal respuesta.

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Las células sintéticas pueden defenderse de las infecciones mediante una estrategia inspirada en las bacterias.

Inspirándonos en la conocida función de las endonucleasas de restricción para proteger a las bacterias contra el ADN extraño, intentamos emplear esta estrategia dentro de células sintéticas. Ampliamos el sistema de parásitos presentado en la Figura 2: además de GFP, agregamos plásmido que contiene MunI al huésped. El parásito contenía mCherry, como en experimentos anteriores. El plásmido mCherry contiene un sitio de restricción MunI (Figura 5a). Primero, realizamos experimentos de prueba de principio para evaluar la carga metabólica de la expresión de MunI en el huésped. En estos experimentos de TxTl no encapsulados, monitoreamos la expresión de GFP y la expresión de mCherry, cada una mezclada con una cantidad creciente de plásmido MunI o EcorI. Todos los genes estaban bajo el control del mismo promotor T7. El gen GFP tenía un sitio de restricción EcorI pero no MunI y el gen mCherry tenía un sitio de restricción MunI pero no EcorI. Cuando el plásmido de la enzima de restricción se mezcló con un plásmido de proteína fluorescente sin un sitio de reconocimiento para esa enzima de restricción, la expresión de la proteína fluorescente disminuyó proporcionalmente al aumento del plásmido de la enzima de restricción, lo que indica competencia entre los dos plásmidos por los recursos de TxTl, como se demostró anteriormente para GFP. y mCherry en la Figura 2. Estos pares no cortantes fueron GFP con MunI (Figura 5b) y mCherry con EcorI (Figura 5e). Cuando una proteína fluorescente se emparejó con una enzima de restricción capaz de cortar el gen de esa proteína fluorescente, la fluorescencia disminuyó significativamente hasta casi niveles de fondo en concentraciones más altas de plásmido de enzima de restricción. Estos pares de corte fueron GFP con EcorI (Figura 5c) y mCherry con MunI (Figura 5d). Esto indicó una disminución en la fluorescencia significativamente más allá de la simple competencia por los recursos y similar al escenario de infección demostrado en la Figura 3. La expresión de MunI en presencia de GFP disminuye la expresión de GFP. Si utilizamos GFP como indicador del metabolismo "base" del huésped, entonces MunI puede verse como una carga metabólica en el huésped.

Figura 4. El huésped es susceptible a una infección "mortal", pero puede ser rescatado. (a) El huésped contiene plásmido GFP y el patógeno contiene plásmido que codifica el canal de membrana de hemolisina (aHL). Después de la infección, el huésped expresa aHL, lo que crea poros en la membrana, lo que provoca una fuga de nutrientes y una disminución de la actividad metabólica del huésped. (b) Prueba de principio para un huésped que expresa aHL (sin infección, el huésped se creó con GFP 5 nM y la cantidad indicada de plásmido aHL). El huésped se incubó en un tampón con o sin nutrientes (todos los componentes de la mezcla de energía, sal y aminoácidos se utilizan para preparar el sistema de traducción libre de células huésped). La concentración óptima de nutrientes de rescate se estableció experimentalmente, los datos se muestran en la Figura S23. (c) Infección del huésped con el patógeno, con cantidades variables de patógeno por célula huésped. La fuga de moléculas pequeñas de las células "sanas" e "infectadas" se midió directamente utilizando un tinte de molécula pequeña; los datos se muestran en las Figuras S24 y S25. (d) En el panel (c) se muestran experimentos similares a estos, pero el tampón exterior contiene nutrientes de molécula pequeña similares a las condiciones experimentales de "nutrientes exteriores" que se muestran en el panel (b). Las barras de error en todos los paneles indican SEM, n=3. Los valores de fluorescencia en los paneles (b-d) se normalizan con respecto a la fluorescencia azul del tinte de membrana utilizado para normalizar la señal con respecto a la concentración de las células huésped. Los símbolos de diamantes en los paneles (c, d) resaltan una condición particular que ilustra mejor las diferencias en respuesta a la infección de un huésped sin nutrientes externos en el panel (c) e inmune al patógeno debido a la presencia de nutrientes externos en el panel (d). Para los paneles (c, d), la serie "GFP infectado" es el huésped fusionado con el patógeno que porta la proteína aHL, y "GFP sano" es el huésped fusionado con el patógeno que no porta plásmido.

Se procede a los experimentos de infección, mezclando el huésped (con plásmidos GFP y MunI) con un parásito (con plásmido mCherry). Como anteriormente, investigamos escenarios con una cantidad creciente de parásitos en la población (Figura 5f). El control positivo de un mCherry que expresa únicamente el huésped (con EcorI en lugar de MunI para equilibrar la carga metabólica) creó un punto de referencia para la cantidad máxima teórica de proteína patógena que se puede expresar en el huésped (Figura 5f). A medida que aumentó la cantidad de parásito, la fluorescencia de GFP del huésped disminuyó, pero la disminución de la fluorescencia del huésped infectado fue significativamente menor que la disminución de la expresión de GFP observada en experimentos anteriores con el mismo parásito. La fluorescencia de GFP y mCherry del parásito de este MunI infectado que expresa el huésped (punto de datos etiquetado con una estrella en la Figura 5f) se puede comparar directamente con huéspedes de infección similares sin MunI (punto de datos etiquetado con una estrella en la Figura 2e). En el huésped que expresa MunI, la GFP del huésped comenzó con un nivel absolutamente más bajo mientras estaba sano (porque algunos recursos se desvían para expresar MunI), pero después de la infección, la disminución de la fluorescencia del huésped es mucho menos significativa y el huésped produce mucho menos proteína mCherry del parásito. que en el caso del anfitrión que no expresa MunI. Este experimento demuestra el beneficio de que el huésped gaste algunos recursos en defensa contra los parásitos. Este sistema podría verse como un modelo bioquímico muy simple para que los organismos que expresan proteínas se defiendan contra futuras infecciones o incluso factores ambientales dañinos. Originalmente, el huésped es menos robusto (si tomamos la expresión de GFP como punto de referencia para la salud del huésped), pero en caso de infección, los recursos adicionales que el huésped gastó en expresar proteínas defensivas dan sus frutos, brindando protección contra el parásito infectante. Por lo tanto, en esta simple célula sintética no viva, reconstituimos un ejemplo de una carrera armamentista biológica fundamental.

Figura 5. Las células huésped se defienden contra la infección. (a) Las células huésped contienen dos plásmidos: uno que codifica GFP (sin un sitio de restricción MunI) y el otro que codifica la enzima de restricción MunI (el gen de "resistencia al parásito"). El parásito contiene el plásmido mCherry, en un sistema similar a los experimentos que se muestran en la Figura 2. La infección está mediada por fusión a través de etiquetas de ADN en la superficie del huésped y el parásito. Después de la infección, el plásmido mCherry introducido por el parásito es digerido por la enzima de restricción MunI del huésped. (b-e) Medir el costo metabólico de expresar la resistencia del parásito. Los experimentos se realizan en un sistema TxTl a granel, no encapsulado en vesículas. En cada experimento, el plásmido de proteína fluorescente (GFP o mCherry) se mezcló con el plásmido de enzima de restricción (MunI o EcorI) en la proporción indicada en el eje x para la concentración total de plásmido de 10 mM. GFP tiene un sitio de restricción EcorI pero no un sitio MunI, y mCherry tiene un sitio de restricción MunI pero no un sitio de restricción EcorI. La línea de tendencia es una guía visual pero no un ajuste de datos. Las barras de error indican SEM, n=3. En la Figura S26 se proporcionan experimentos de control con enzimas de restricción purificadas, en lugar de expresarlas a partir de un plásmido. También se midió la estabilidad de los liposomas con una mayor cantidad de plásmido del parásito, datos que se muestran en la Figura S27. (f) Infección del huésped con una cantidad creciente de parásito. "Hospedero GFP sano" es la expresión de GFP de células huésped fusionadas con el parásito sin ningún plásmido. "Hospedero infectado con GFP" es el huésped fusionado con el parásito que porta mCherry. La fluorescencia roja es la fluorescencia de mCherry del parásito fusionado con el huésped (solo están disponibles los datos del huésped infectado. Las muestras del huésped sano no portaban el plásmido mCherry). Las barras de error en todos los paneles indican SEM, n=3. Los valores de fluorescencia se normalizan con respecto a la fluorescencia azul del tinte de membrana utilizado para normalizar los resultados con respecto a la concentración de las células huésped. El símbolo del diamante indica la expresión de la proteína del parásito en condiciones de infección particulares, directamente comparable al punto de datos resaltado con una estrella en la Figura 2e, un experimento en las mismas condiciones, pero con el huésped sin el gen de resistencia MunI.

Figura 6. La inoculación proporciona defensa contra las infecciones. (a) El huésped contiene plásmido GFP. El patógeno en estos experimentos es uno de los tres esquemas de infección demostrados en este artículo: un parásito (como se muestra en la Figura 2), un patógeno con la enzima de restricción MunI que digiere el genoma GFP del huésped (como se muestra en la Figura 3), o un patógeno transportando el canal de membrana aHL provocando la fuga de nutrientes del huésped (como se muestra en la Figura 4). En cada caso, el huésped y el patógeno contienen etiquetas de fusión de ADN complementarias. Antes de introducir el patógeno, el huésped se "inocula": se incuba con un exceso de oligos de ADN ss complementarios a las etiquetas de ADN de fusión en la superficie del huésped (etiquetas idénticas a estas en el patógeno menos el resto de colesterol utilizado para anclar la etiqueta a la membrana de el patógeno). La inoculación hace que las etiquetas de fusión en la superficie del huésped se vuelvan bicatenarias, imposibilitando así la fusión con el patógeno. (b) La prueba de principio para el plan de inoculación. La población de liposomas que llevan GFP bajo el control del promotor de ARN T7, pero sin ARN polimerasa de T7, se fusiona con liposomas que contienen ARN polimerasa de T7. La proteína GFP sólo puede expresarse si las dos poblaciones se fusionan. Uno o ambos compañeros de mezcla fueron "inoculados" mediante incubación con una etiqueta de ADN compatible con las etiquetas de fusión en la superficie del liposoma, haciendo que las etiquetas de fusión sean bicatenarias y por lo tanto incompatibles con la fusión. En la Figura S28 se muestra un curso temporal representativo de la expresión de proteínas. Los experimentos de control sin etiquetas de fusión se muestran en la Figura S29, y los controles con etiquetas de fusión incompatibles se proporcionan en la Figura S30. La concentración de oligo de inoculación se estableció experimentalmente, los datos se muestran en la Figura S31. (c) Experimentos de infección de parásitos. Un huésped que portaba GFP se fusionó con un parásito que portaba mCherry, como se describe en la Figura 2. El huésped y el parásito se mezclaron con una proporción variable de huésped y parásito; las células huésped fueron inoculadas (con etiquetas de fusión de ADN de doble cadena no compatibles con la fusión) o no inoculadas (por lo tanto, susceptibles a la fusión con el parásito). La fluorescencia de mCherry se informa solo para muestras con el huésped no inoculado porque no hubo fluorescencia de mCherry mensurable en las muestras del huésped inoculado. Se probó una inoculación inversa inoculando el parásito en lugar del huésped, datos que se muestran en la Figura S32. (d) Experimentos de infección con el genoma del huésped susceptible al patógeno que porta la enzima de restricción MunI, como se describe en la Figura 3. La serie de datos infectados representa un huésped sin inoculación, y la serie de datos inoculados representa muestras con el huésped incubado con oligos de inoculación. por lo tanto, no es susceptible a la fusión con el patógeno. (e) Los experimentos de infección con el patógeno que porta el gen aHL dan como resultado que los canales aHL filtren nutrientes de las células huésped después de la infección, como se describe en la Figura 4. La serie de datos infectados representa el huésped sin inoculación y la serie de datos inoculados representa muestras con el huésped incubado con oligos de inoculación, por lo que no es susceptible a la fusión con el patógeno. Las barras de error en todos los paneles indican SEM, n=3. Los valores de fluorescencia en los paneles (c-e) se normalizan con respecto a la fluorescencia azul del tinte de membrana utilizado para normalizar los resultados con respecto a la concentración de las células huésped. Algunos datos que se muestran en esta figura son experimentos con una configuración idéntica a los experimentos mostrados en figuras anteriores (como se indica en cada título). Estos experimentos se repitieron para esta figura para producir datos usando el mismo lote de TxTl para comparar directamente los resultados, eliminando la variabilidad entre lotes de las preparaciones de TxTl.

La inoculación de células sintéticas previene la infección.

En el ejemplo descrito anteriormente, demostramos que el huésped se defiende contra la influencia del genoma de un patógeno mediante la expresión de una proteína adicional. A continuación, preguntamos si es posible modelar un escenario en el que alguna intervención haga que un huésped previamente susceptible sea inmune a la infección en primer lugar. Lo llamamos modelo de inoculación. Si bien reconocer que esto está lejos de ser una analogía perfecta, el aspecto en el que nos centramos es que la célula sintética huésped no gasta ningún recurso en generar inmunidad. En nuestro modelo de inmunización, diseñamos un tratamiento que convierte la célula sintética del huésped susceptible a la infección en células que no pueden fusionarse con un patógeno. El sistema de fusión de células sintéticas utilizado en este artículo se basa en etiquetas de ADN monocatenario para inducir la fusión de la membrana del liposoma. Para inocular contra la fusión con un patógeno, incubamos las células con oligonucleótido de ADN complementario al oligo de fusión en la superficie de las células (Figura 6a). En primer lugar, necesitábamos confirmar que la inoculación mediante incubación con oligo complementario funciona para abolir la fusión. En los experimentos de prueba de principio, se prepararon dos poblaciones de liposomas: una población tenía TxTl con un plásmido que codifica GFP bajo el control del promotor T7 y la otra población tenía ARN polimerasa de TxTl y T7 pero ningún plásmido. Después de la fusión de estas dos poblaciones, el plásmido GFP se mezcló con la ARN polimerasa T7 e indujo la expresión de GFP. Si las dos poblaciones tenían etiquetas de fusión monocatenarias y complementarias, se producía la fusión y se detectaba fluorescencia de GFP. Si una o ambas poblaciones se incubaron con un oligonucleótido complementario a la etiqueta de fusión, la fusión del liposoma no se produjo y no se expresó GFP (Figura 6b). Una vez establecido el sistema de inoculación, procedimos a introducir la inoculación para proteger las células sintéticas del huésped en tres de los escenarios de infección descritos anteriormente en este trabajo. Primero, utilizamos el escenario del parásito descrito en la Figura 2. Las células huésped, que contienen un genoma de GFP, se inocularon con un oligo complementario a la etiqueta de fusión en la superficie del huésped, y el huésped se mezcló con el parásito mCherry. Mezclamos el huésped con el parásito en diferentes proporciones. En todas las condiciones de infección, la fluorescencia del parásito mCherry fue indetectable si el huésped fue inoculado y la fluorescencia de GFP del huésped inoculado no disminuyó. Los experimentos de control con el huésped no inoculado mostraron una disminución en la expresión de GFP del huésped y un aumento en la señal del parásito mCherry, como se esperaba (Figura 6c). A continuación, aplicamos el sistema de inoculación al caso de un huésped infectado con un patógeno que porta una enzima de restricción MunI que codifica el genoma capaz de digerir el genoma de GFP del huésped, como en los experimentos que se muestran en la Figura 3. El huésped inoculado no mostró una disminución. en la fluorescencia de GFP después de mezclar con cantidades crecientes del patógeno, mientras que el huésped no inoculado se infectó y la fluorescencia de GFP del huésped disminuyó proporcionalmente a la cantidad creciente de patógeno (Figura 6d). La inoculación también fue eficaz contra el patógeno aHL. Los huéspedes inoculados no mostraron ninguna disminución en la fluorescencia al mezclarse con el patógeno, mientras que la fluorescencia de GFP del huésped no inoculado disminuyó significativamente con la infección (Figura 6e). En todos los casos, este simple procedimiento de inoculación, incubando el huésped con un oligo de ADN complementario al oligo de fusión en la superficie del huésped, fue suficiente para abolir la capacidad de las células sintéticas patógenas para infectar las células huésped. Por lo tanto, demostramos un modelo fisicoquímico simple de intervención que protege a las células huésped de la infección.

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CONCLUSIONES

En este artículo, demostramos métodos para utilizar células mínimas sintéticas para modelar infecciones patógenas y de parásitos. La motivación detrás de nuestro trabajo era doble. Queríamos diseñar un comportamiento complejo y realista en células sintéticas, facilitando el objetivo de diseñar células sintéticas que se parecieran más a las células vivas naturales. También queríamos aprovechar el sistema celular sintético simple y controlable para modelar las propiedades básicas de los procesos de infección, inoculación y resistencia. Si bien las células sintéticas no evolucionan ni se autorreplican, este sistema permite estudiar la dinámica de la infección en un modelo simple y fácil de analizar. Esperamos que los principios de infección descritos aquí ayuden a crear modelos prácticos y aplicables para diferentes patógenos y la mitigación de infecciones. El estudio de este sistema celular sintético simplificado puso de relieve las interacciones fundamentales entre el parásito y el patógeno. Si bien las células sintéticas no están (todavía) vivas y no tienen la capacidad de sufrir una evolución darwiniana, este sistema nos permite observar las interacciones entre patógenos y huéspedes sin la capacidad de desarrollar inmunidad natural o cambiar la virulencia del patógeno. Si bien la dinámica de infección del huésped presentada aquí utiliza células sintéticas basadas en bacterias, este sistema no se limita inherentemente a TxTl bacteriano. Incluso sería posible imaginar utilizar el sistema presentado aquí para modelar la dinámica de infección en poblaciones que se asemejan a ecosistemas naturales, aprovechando la simplicidad inherente a las células sintéticas para controlar y estudiar completamente las interacciones entre diferentes miembros de grandes poblaciones.

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