La proporción de concentrado en la dieta de vacas lecheras en lactancia temprana tiene efectos contrastantes sobre los perfiles transcriptómicos globales de leucocitos circulantes, la salud y la fertilidad según la paridad.

Abstracto:La funcionalidad de los leucocitos circulantes en las vacas lecheras se suprime después del parto, siendo el balance energético negativo un factor de riesgo. Los perfiles transcriptómicos de leucocitos se compararon por separado en 44 vacas Holstein-Friesian multíparas (MP) y 18 primíparas (PP) que recibieron dietas que diferían en la proporción de concentrado para probar si la disfunción inmune podría mitigarse con una nutrición adecuada. Después del parto, a las vacas se les ofreció (1) concentrado bajo (LC); (2) dietas de concentrado medio (MC) o (3) de alto concentrado (HC) con proporciones de concentrado y ensilaje de pasto de 30%:70%, 50%:50% y 70%:30%, respectivamente. Los datos recopilados sobre el fenotipo de las vacas incluyeron metabolitos circulantes, producción de leche y registros de salud y fertilidad. Se realizó la secuenciación del ARN de leucocitos circulantes a los 14 días en leche. La dieta HC mejoró el equilibrio energético en ambos grupos de edad. Hubo más genes expresados ​​diferencialmente en las vacas PP que en las MP (460 vs. 173, comparación HC vs. LC) con pocas superposiciones. Las vacas MP con la dieta LC mostraron una regulación positiva del complemento y la cascada de coagulación y mecanismos de defensa inmune innata contra patógenos y tuvieron una tendencia a más casos de mastitis y peor fertilidad. Por el contrario, las vacas PP con la dieta HC mostraron mayores respuestas inmunes basadas tanto en la expresión genética como en los datos fenotípicos y un intervalo más largo entre el parto y la concepción. Por lo tanto, los leucocitos de las vacas MP y PP respondieron de manera diferencial a las dietas según la edad, el suministro de nutrientes y la inmunidad, lo que afectó su salud y posterior fertilidad.

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Palabras clave:inmunosupresión posparto; inmunidad innata; metabolismo; leucocitos; dietas de lactancia; transcriptoma; reproducción; vacas

1. Introducción

En el posparto temprano, las vacas lecheras se caracterizan por una inmunosupresión que afecta la inmunidad innata y adaptativa, incluida la inmunidad humoral y la mediada por células. Los leucocitos circulantes se reclutan en tejidos como la glándula mamaria y el endometrio durante la inflamación. Sin embargo, estudios anteriores han demostrado una reducción tanto del número de leucocitos como de su capacidad funcional durante el período periparto [1,2]. Los efectos informados incluyen alteración de la fagocitosis y actividad oxidativa [3-5], una menor capacidad de respuesta de las células T circulantes a los agentes mitogénicos y una reducción de la producción de inmunoglobulina por parte de las células B [6,7]. Las causas son multifactoriales, pero parecen estar relacionadas con la distribución de nutrientes a favor de la producción de leche al inicio de la lactancia, lo que compromete la función inmune [8-10]. Los leucocitos requieren un aporte adecuado de glucosa, diversos ácidos grasos y colesterol u oxiesteroles para su mantenimiento y funcionalidad [8,11,12]. Sin embargo, el suministro de nutrientes disponible tiene prioridad para la glándula mamaria después del parto, lo que requiere aproximadamente un 25% más de energía y proteínas metabolizables que las proporcionadas por la ingesta de alimento [8,13,14]. Además, el parto se caracteriza por procesos inflamatorios asociados con cambios en la secreción de diversas prostaglandinas, esteroides y citocinas y posibles lesiones durante el proceso del parto [15-17]. Las respuestas inflamatorias al parto y los metabolitos liberados durante la movilización del tejido tienen potentes efectos anoréxicos, lo que disminuye aún más la ingesta y exacerba el balance energético negativo (NEB) [18]. Cuando el consumo de alimento no puede satisfacer la creciente demanda de energía, las vacas entran en un período de NEB, y algunos individuos se desequilibran metabólicamente [19-21]. La NEB se asocia con resistencia a la insulina, reducción de la expresión del receptor de la hormona del crecimiento hepático (GH) y menor síntesis hepática de IGF-1 [22,23]. El desacoplamiento de GH con insulina en vacas posparto es una adaptación que prioriza el suministro de glucosa a tejidos como las células epiteliales mamarias, en los que la absorción es independiente de la insulina [8]. En esta situación, la competencia por el suministro de energía entre la glándula mamaria y el sistema inmunológico es inevitable, ya que ambos dependen de los mismos sustratos esenciales y ambos son grandes consumidores de energía. Kvidera et al. [24] demostraron que la activación de una respuesta inmune completa en vacas requería de 2,5 a 3,1 kg de glucosa por día. Esto es similar al requerimiento estimado de 2,7 kg/d de glucosa absorbida por las células epiteliales mamarias para una producción de leche de 40 kg/d [8].

La movilización de tejidos también se asocia con un aumento de las concentraciones circulantes de ácidos grasos no esterificados (NEFA), beta-hidroxibutirato (BHB) y una disminución del IGF-1, todo lo cual contribuye a la disfunción inmune [5,9,10,20 ]. Por ejemplo, nuestro estudio reciente ilustró que la adhesión de leucocitos entre células se inhibía cuando la concentración de NEFA excedía los 750 µM [25]. Aunque la movilización de tejidos es una adaptación normal de los mamíferos para apoyar la lactancia, muchos estudios han demostrado que la NEB grave tiene una influencia importante en la capacidad posterior de la vaca para concebir de manera oportuna [26]. Esto puede deberse a una variedad de factores que incluyen retrasos en la restauración de un ambiente uterino apropiado [2]; un período prolongado de anovulación [27], un ambiente intrafolicular deficiente [28] y una calidad deteriorada de los ovocitos [29]. Las novillas lecheras generalmente paren alrededor del 90% de su peso corporal maduro [30]. Nuestro estudio anterior demostró que las vacas primíparas (PP) tenían concentraciones más altas de insulina, IGF-1 y leptina en su circulación, concentraciones más bajas de metabolitos sanguíneos (BHB, NEFA y urea) y concentraciones más altas de glucosa que las multíparas (MP). ) vacas durante al menos 7 semanas después del parto [31,32]. Esto indica que hay menos desacoplamiento del eje somatotrófico al comienzo de la lactancia en las vacas PP en comparación con las vacas MP, asociado con una priorización más débil de los nutrientes a la glándula mamaria, lo que permite un crecimiento continuo. Los perfiles de expresión génica en los leucocitos circulantes también difieren entre las vacas PP y MP durante la lactancia temprana [33].

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Optimizar el manejo nutricional durante el período seco puede aumentar la ingesta de materia seca (IMS), reducir la incidencia de enfermedades periparturientes y mejorar la fertilidad [34]. Existen directrices generales sobre cómo reducir el riesgo de enfermedades relacionadas con la alimentación y el manejo [35]. Sin embargo, hay poca información disponible sobre formulaciones dietéticas para vacas individuales con desequilibrio metabólico durante el período posparto que puedan mejorar la función inmune, disminuir la incidencia de enfermedades y mejorar el desempeño reproductivo posterior. La formulación de dietas con un alto potencial de ingesta de nutrientes es un enfoque práctico [36]. En el presente estudio, a las vacas en lactancia temprana se les ofrecieron dietas bajas (LC), medias (MC) o altas en concentrado (HC) basadas en las proporciones de concentrado y ensilaje de pasto, y los efectos sobre la salud y las enfermedades metabólicas y la inmunidad sistémica ( mediante la evaluación de los perfiles de expresión génica de leucocitos circulantes globales). Los datos de las vacas PP y MP se analizaron por separado para evitar cualquier efecto de confusión derivado de la paridad. Nuestra hipótesis era que las dietas de alta concentración mejorarían la función inmune y beneficiarían la fertilidad.

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2. Resultados

2.1. Efecto de las dietas sobre la ingesta de materia seca, la producción de leche, el equilibrio energético y los metabolitos en sangre

Los parámetros de la leche, el peso corporal (BW), el CMS, la puntuación de condición corporal (BCS), el balance energético (EBAL) y los metabolitos sanguíneos de las vacas MP y PP alrededor de los 14 días en leche (DIM) se resumen en la Tabla 1. El CMS para las vacas MP fue significativamente diferente entre los tres grupos dietéticos con el orden de HC > MC > LC (p < 0.01–0.0{{11 }}1). La producción de leche en las vacas MP que recibieron las dietas HC fue significativamente mayor que en las que recibieron las dietas LC (p < 0.05). La diferencia en la producción de leche corregida por energía (ECM) entre los grupos LC y HC fue significativa (p < 0.05), con valores intermedios en el grupo MC. Los valores de EBAL en los tres grupos MP fueron negativos, pero los de las vacas MC y HC fueron significativamente mejores (menos negativos) que los de las vacas LC (p < 0,01). Las concentraciones circulantes de glucosa (p < 0,01) e IGF-1 (p < 0,001) en las vacas HC fueron significativamente más altas que en las vacas LC. Las vacas MP a las que se les ofrecieron dietas HC también produjeron menos urea circulante (p < 0,001), BHB (p < 0,05) y NEFA que aquellas a las que se les ofrecieron dietas LC con las concentraciones LC > MC > HC, aunque las diferencias en las concentraciones de NEFA entre los grupos dietéticos no fueron estadísticamente significativos.

Tabla 1. Ingesta total de materia seca, parámetros de la leche, pesos corporales, balance energético, puntaje de condición corporal y metabolitos sanguíneos alrededor de los 14 días después del parto, analizados según parto y dieta 1,2

En las vacas PP, las que recibieron la dieta MC o HC tuvieron un IMS más alto que las que recibieron la dieta LC (p < {{0}}.01). Los rendimientos de leche no fueron significativamente diferentes. La EBAL fue positiva en las vacas a las que se les ofrecieron dietas MC o HC, mientras que para aquellas a las que se les ofreció la dieta LC, fue negativa. Las diferencias en EBAL entre las vacas HC y LC PP fueron significativas (p < 0,05). De los metabolitos medidos, sólo las concentraciones de urea difirieron entre los grupos, siendo menores en las vacas HC (LC > MC > HC, p < 0,001 para LC vs. HC o MC).

2.2. Efecto de las dietas sobre los parámetros inflamatorios

Los efectos de la dieta sobre los parámetros inflamatorios medidos en el útero y la glándula mamaria se presentan en la Tabla 2. En las vacas PP, la proporción de leucocitos polimorfonucleares a células epiteliales uterinas (PMN: UEC) recolectadas del útero usando un citocepillo fue significativamente mayor para las vacas con la dieta HC en comparación con la dieta LC (p < 0.05). En las vacas MP la tendencia fue en la misma dirección, con LC < MC < HC, pero no alcanzó significación estadística. En leche, las vacas MP con la dieta LC tuvieron un RCS significativamente mayor que aquellas con las dietas MC o HC (p < 0.05), mientras que en las vacas PP la tendencia no significativa fue en la dirección opuesta. . Las concentraciones de N-acetil- -d-glucosaminidasa (NAGasa) y lactato deshidrogenasa (LDH) de la leche, enzimas lácteas indicativas de mastitis, siguieron las mismas tendencias generales que los valores de RCS, pero no hubo diferencias significativas. Estos resultados fueron respaldados por los registros sanitarios. Las vacas MP con la dieta HC no experimentaron ningún caso de mastitis (0/15), mientras que 4/14 (28,6%) de las vacas con la dieta LC fueron diagnosticadas con mastitis clínica dentro de los 16 días posteriores al parto. La tendencia fue nuevamente en la dirección opuesta para las vacas PP con una de cada seis (16,7%) en la dieta LC con mastitis clínica en comparación con un caso de mastitis clínica y dos de mastitis subclínica en la dieta HC (50%).

Cuadro 2. Parámetros inflamatorios alrededor de los 14 días después del parto según parto y dieta 1,2.

2.3. Datos de fertilidad

Los detalles de los datos de fertilidad se dan en la Tabla 3. Para las vacas MP, aquellas con la dieta LC tardaron un poco más en concebir y requirieron más servicios por concepción que las vacas HC (2,4 ± 0.42 vs. 1,6 ± 0% vs. , 71,4%). Sin embargo, ninguna de estas diferencias fue significativa. Para las vacas PP, ocurrió lo contrario: las vacas LC tuvieron el intervalo más corto hasta la concepción, de 29 días (p < {{20}}}.05), y cinco de los seis animales concibieron su primer servicio. . En contraste, la mitad del grupo HC no recibió servicio (n=2) o no pudo concebir (n=1), y las tres que concibieron requirieron 2,0 ± 0,41 servicios por concepción. Esto dio como resultado que el grupo HC tuviera una puntuación "en pantorrilla por" (ICB) significativamente mayor (p < 0,05).

Tabla 3. Datos de fertilidad según parto y dieta 1,2

2.4. Perfiles transcriptómicos de leucocitos en vacas a las que se les ofrecieron diferentes proporciones de concentrado

El genoma bovino de referencia de ARS-UCD 1.2 proporcionado por RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, consultado el 1 de mayo de 2022) contiene 35 158 genes, de los cuales 19 001 genes de leucocitos fueron cuantificables cuando se leyó la secuenciación. en los archivos FASTQ se le asignaron. En la Figura 1 se presentan los gráficos de volcanes que muestran los perfiles de expresión en las vacas MP y PP que recibieron las tres dietas diferentes. En las vacas MP, hubo 173 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en la comparación entre HC y LC, 126 entre MC y LC y 68 para HC frente a MC (archivo complementario S1A – C). El diagrama de Venn ilustró que ningún gen (DEG común) fue significativo en las tres comparaciones dietéticas (Figura 2A). En las vacas PP, hubo 460 DEG en la comparación de HC frente a LC, 178 entre MC frente a LC y 128 entre HC frente a MC (archivo complementario S2A-C). Solo un gen común (DCN, cambio de veces (FC)=−7.3) fue significativo en las tres comparaciones dietéticas (Figura 2B). Esto codifica la decorina, una proteína que desempeña un papel en el ensamblaje de las fibrillas de colágeno. En general, fue notable que se encontró una mayor cantidad de DEG en las comparaciones dietéticas de la expresión de genes de leucocitos en las vacas PP que en las MP a pesar de los tamaños de grupo más pequeños, y la mayoría de estos genes estaban regulados positivamente en la dieta HC. Además, hubo poca superposición en los genes identificados entre los diferentes grupos de edad, como se ilustra en los diagramas de Venn de la Figura 3. Esto sugiere que las dietas tuvieron diferentes efectos sobre el transcriptoma de leucocitos en vacas PP y MP. En ambos grupos de edad, las mayores diferencias se encontraron entre las vacas a las que se les ofrecieron las dietas LC y HC, por lo que nos centramos en esta comparación en los análisis posteriores.

Figura 1. Los gráficos de volcán muestran los perfiles de expresión en las vacas MP y PP que reciben tres dietas diferentes. (A) vacas MP HC versus LC, (B) vacas MP HC versus MC, (C) vacas MP MC versus LC, (D) PP HC versus LC, (E) PP HC versus MC y (F ) PP MC frente a LC. HC: concentrado alto (n=6 en vacas PP y n=14 en vacas MP), MC: concentrado medio (n=5 en vacas PP y n=15 en vacas MP ), y LC: concentrado bajo (n=6 en vacas PP y n=14 en vacas MP). Los cambios de pliegue se transformaron log2-. Los puntos verdes indican los genes regulados negativamente con p (BH) < 0.05 y cambios de pliegue menores o iguales a −1,5 y los puntos rojos indican genes regulados positivamente con p (BH) < {{ 16}}.05 y doblar cambios Mayor o igual a 1,5. Los puntos naranjas indican los genes con p (BH) <0,05 pero cambios absolutos <1,5.

Figura 2. Diagramas de Venn que muestran los genes expresados ​​diferencialmente por los leucocitos circulantes entre los tres grupos dietéticos en (A) vacas multíparas (MP) y (B) vacas primíparas (PP). HC: concentrado alto (n=6 en vacas PP y n=14 en vacas MP), MC: concentrado medio (n=5 en vacas PP y n=15 en vacas MP ) y LC: concentrado bajo (n=6 en vacas PP y n=14 en vacas MP).

Figura 3. Diagramas de Venn que muestran los genes expresados ​​diferencialmente por los leucocitos circulantes entre las vacas PP y MP en las comparaciones de (A) alto concentrado (HC) con bajo concentrado (LC); (B) HC con concentrado medio (MC) y (C) MC con LC. HC: n=6 en vacas PP y n=14 en vacas MP, MC: n=5 en vacas PP y n=15 en vacas MP y LC: n {{5 }} en vacas PP y n=14 en vacas MP

2.5. Comparación de perfiles de expresión genética de leucocitos entre vacas multíparas que reciben dietas altas o bajas en concentrado

Los 20 principales DEG regulados al alza y a la baja clasificados según los valores de p (BH ajustado) en las vacas MP alimentadas con una dieta HC en comparación con aquellas alimentadas con una dieta LC se dan en el Archivo Suplementario S1D, E. Entre las DEG reguladas al alza, la mayoría estuvo involucrada en el GO funciones del proceso del sistema inmunológico, el metabolismo y la respuesta al estímulo, y muchas proteínas codificantes tienen múltiples funciones. Por ejemplo, ALAS2 (que codifica la 50 -aminolevulinato sintasa 2) tiene un papel en el proceso metabólico, la respuesta al estímulo y el proceso de desarrollo. COL1A1 (cadena alfa 1 de colágeno tipo I) y DAB2 participan en el metabolismo, la respuesta al estímulo, el organismo multicelular, la locomoción y el desarrollo. Los 20 principales genes regulados a la baja ilustran un tema claro de cambios en la inmunidad con 14 DEG asociados. De estos, DMTB1, FGA, FGB y TF codifican péptidos antimicrobianos, ALB y TF codifican proteínas de fase aguda negativas (APP) y FGA y FGG codifican APP positivas. Ocho genes desempeñan funciones en el metabolismo y 10 participan en la respuesta al estímulo.

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Los DEG de leucocitos derivados de la comparación del grupo HC con el grupo LC se sometieron a continuación a un análisis de enriquecimiento GO. Los 76 DEG regulados positivamente se enriquecieron significativamente con 208 funciones, de las cuales las 20 principales según las puntuaciones de enriquecimiento se muestran en la Figura 4A. Estos se asociaron con varios aspectos de la función celular, con la unión del factor de crecimiento derivado de las plaquetas en la parte superior. Muchas funciones estaban relacionadas con el metabolismo de proteínas y aminoácidos (que involucran APLP1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, HTR1B y P2RY12 en la mayoría de ellos), la biomineralización y el procesamiento de colágeno (que involucran COL1A1, COL1A2, SPP1 y TUFT1) y la comunicación celular. Por el contrario, las funciones principales de los 97 DEG regulados a la baja tenían un tema claro de varios procesos de defensa inmune (Figura 4B) que estaban asociados predominantemente con 20 DEG. De estos, FGA (una APP positiva) se redujo 85- veces en la comparación HC versus LC. Una herramienta de navegador GO resumió las funciones biológicas de los DEG regulados hacia arriba y hacia abajo en ocho categorías importantes (Tabla 4). A excepción de la biomineralización, todas las demás funciones biológicas, especialmente aquellas asociadas con la defensa inmune, se asociaron predominantemente con los DEG regulados negativamente.

Figura 4. Las 20 funciones GO principales asociadas con los DEG derivados de comparaciones HC versus LC. (A) DEG con regulación positiva de MP, (B) DEG con regulación negativa de MP, (C) DEG con regulación positiva de PP y (D) DEG con regulación negativa de PP.

Tabla 4. Resumen de las principales funciones de enriquecimiento de GO de los DEG de leucocitos en la comparación entre vacas multíparas que recibieron dietas altas (n=14) y bajas (n=14) de concentrado al comienzo de la lactancia.

Tabla 4. Cont.

Los DEG combinados regulados hacia arriba y hacia abajo (n=173) se enriquecieron significativamente con 23 vías KEGG que estaban relacionadas principalmente con diversos procesos inmunológicos y metabólicos (Tabla 5). Las cascadas de complemento y coagulación estuvieron en la parte superior con ocho DEG regulados negativamente (CFB, FGA, FGB, FGG, KNG1, PROC, SERPINA1 y VTN). La vía inflamatoria de señalización similar a NOD se asoció con seis DEG (IFNB1, MAPK10, OAS1X, OAS1Y, OAS1Z y OAS2), de los cuales todos, excepto MAPK10, estaban regulados negativamente. La vía de digestión y absorción de proteínas contenía seis DEG, de los cuales tres (COL1A1, COL1A2 y COL3A1) estaban regulados al alza y tres a la baja (CELA2A, COL5A3 y ELN). Cinco DEG regulados negativamente estuvieron involucrados en la vía de señalización de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR) (APOA2, APOC3, FABP1, HMGCS2 y PCK1). Las vías de interacción matriz extracelular-receptor, adhesión focal y señalización de esfingolípidos están implicadas en el mantenimiento de la estructura celular y tisular.

Tabla 5. Vías significativas identificadas por el enriquecimiento de la vía KEGG asociadas con genes de leucocitos expresados ​​diferencialmente en las vacas multíparas a las que se les ofreció la dieta alta en concentrado (n=14) en comparación con aquellas a las que se les ofreció la dieta baja en concentrado (n=14).

2.6. Comparación de patrones de expresión genética de leucocitos entre vacas primíparas que reciben dietas altas o bajas en concentrado

Los 20 DEG de leucocitos circulantes principales en las vacas PP alimentadas con las dietas HC en comparación con las dietas LC se enumeran en el archivo complementario S2D, E. Los procesos inmunológicos y metabólicos predominaron en las funciones biológicas de los DEG con regulación positiva superior, que contienen 11 y 12 DEG respectivamente. Entre estos, ACSL6, MMP9 y SLC11A1 están involucrados en la proliferación de leucocitos, y ACSL6, ADGRG3, COL1A2, DUSP1, HCK, MMP9 y PADI4 en el proceso de desarrollo. SLC40A1 es un importante transportador de hierro que desempeña un papel clave en el equilibrio de los niveles de hierro celular y sistémico. Algunos de estos DEG codifican proteínas con múltiples funciones. Por ejemplo, MMP9, DUSP1, SLC11A1 y COL1A2 están asociados con la mayoría de las funciones GO anteriores. Las funciones biológicas de los DEG regulados desde arriba eran más diversas. Había ocho DEG involucrados en el proceso del sistema inmunológico, cinco desempeñando funciones en el metabolismo y dos asociados tanto con la proliferación de leucocitos como con el proceso de desarrollo (EPCAM y FCRL3). Nuevamente, algunos DEG, por ejemplo CD96 y FCRL3, codifican proteínas con múltiples funciones.

En las vacas PP, 382 DEG regulados positivamente derivados de la comparación HC versus LC se asociaron significativamente con 690 funciones GO, y las 20 principales se presentan en la Figura 4C. Todos estos involucraron 116 DEG (Archivo Suplementario S2F) con diversas actividades inmunes. La función principal era la vía de señalización del receptor de la superficie celular. Esto se asoció con 43 DEG que incluían genes que codifican muchos receptores para ligandos inmunes, como CXCR1, CXCR2, IL17RD e IL1RAP. Esta función tenía seis subfunciones importantes, incluida la vía de señalización mediada por lipopolisacáridos (LPS) (PTAFR, TLR4 y SCARB1) y la vía de señalización del receptor de superficie celular regulada por la respuesta inmune. La principal subfunción dentro de la regulación del proceso de organismos multicelulares fue la regulación de la producción de citoquinas, con 24 DEG regulados positivamente, como MARK13, LTF y TLR4. Hubo menos DEG regulados a la baja (solo 78) que se asociaron con 298 funciones GO significativas, con puntuaciones de enriquecimiento más bajas y procesos biológicos más diversos. La Figura 4D muestra las 20 funciones principales. Varios de ellos estaban asociados con aspectos de la inmunidad, como la adhesión celular, la regulación de la producción de mediadores de la respuesta inmune, la respuesta al LPS y la respuesta a moléculas de origen bacteriano. Otros estaban relacionados con el mantenimiento de la homeostasis, como la superficie celular, la citólisis, el transporte transmembrana y la endopeptidasa de tipo serina. El resumen de las funciones biológicas significativas asociadas con los DEG regulados hacia arriba y hacia abajo generó siete categorías (Tabla 6), con el proceso del sistema inmunológico en la parte superior y la mayoría de las otras funciones también asociadas con la defensa inmune. Por ejemplo, los DEG enriquecieron la locomoción con propiedades quimiotácticas e inmunes y la interacción entre especies entre organismos, que implica matar patógenos invadidos. Tanto el proceso celular como la regulación biológica se asociaron con una gran cantidad de DEG. El proceso celular (n=239 DEG) incluyó muchas subfunciones asociadas con la adhesión celular, la destrucción celular, la activación de las células inmunitarias y la proliferación de la población celular. La regulación biológica (125 DEG) también implica muchas actividades inmunes, como la regulación del proceso del sistema inmunológico, la locomoción y la respuesta al estímulo. Todas estas funciones contenían DEG predominantemente regulados al alza en la dieta HC.

Tabla 6. Resumen de las principales funciones de enriquecimiento de GO de los DEG en la comparación entre las vacas primíparas a las que se les ofrecieron dietas altas (n=6) y bajas (n=6) en concentrado al comienzo de la lactancia.

Tabla 6. Cont.

Los DEG combinados regulados hacia arriba y hacia abajo (460) en las vacas PP se enriquecieron con 35 vías KEGG significativas (Tabla 7). Muchos se asociaron con procesos metabólicos que involucran aminoácidos (valina, leucina, isoleucina, arginina y glutatión), proteínas, lípidos (ácido araquidónico, glicerolípido y colesterol), vitamina B6 y algunas hormonas (aldosterona, cortisol, tiroides y hormona del crecimiento). ). Estas vías metabólicas se enriquecieron predominantemente con los DEG regulados positivamente en la dieta HC. Por ejemplo, la biosíntesis de aminoácidos se asoció con cinco DEG regulados positivamente (ARG2, ASS1, GPT2, SDS y SDSL), la vía de síntesis, secreción y acción de la hormona del crecimiento se enriqueció con seis regulados positivamente (ADCY6, CREB3L2, CREB5, FOS , MAPK13 y SOCS3) y un DEG regulado negativamente (BCAR1), y el metabolismo del ácido araquidónico contenía cinco DEG regulados positivamente (CYP2J2, GGT5, GPX3, PLB1 y TBXAS1). Varias vías asociadas con el proceso inmunológico/inflamatorio también se enriquecieron significativamente, nuevamente principalmente con DEG regulados positivamente. Estos incluían vías de señalización de quimiocinas, MAPK y TNF y cascadas de complemento y coagulación. Por ejemplo, la vía de señalización de quimiocinas contenía ocho DEG regulados positivamente (ADCY6, CCL16, CCR1, CXCL13, CXCR1, CXCR2, GNG7 y HCK) y dos DEG regulados negativamente (BCAR1 y CCR5), la vía de señalización de TNF contenía seis DEG regulados positivamente (CREB3L2, CREB5). , FOS, MAPK13, MMP9 y SOCS3), y las vías de señalización de MAPK contenían 12 DEG regulados positivamente, incluidos IL1A, MAP3K6 y MAPK13.

Tabla 7. Vías significativas identificadas por el enriquecimiento de la vía de Kegg asociadas con genes de leucocitos expresados ​​diferencialmente en las vacas primíparas a las que se les ofreció la dieta alta en concentrado (n=6) en comparación con aquellas a las que se les ofreció la dieta baja en concentrado (n=6).

3. Discusión

Las vacas lecheras posparto tienen mecanismos homeostáticos para controlar la partición de nutrientes entre la lactancia y otras funciones vitales importantes, como la inmunidad y el crecimiento [8]. La movilización de tejidos es una adaptación normal de los mamíferos para apoyar la lactancia, pero algunas vacas presentan un desequilibrio metabólico [35,37]. Estos animales experimentan una movilización excesiva del tejido adiposo, resistencia a la insulina e inflamación sistémica que contribuyen al deterioro de la inmunidad que a menudo se observa en este momento [38]. Esto se asocia con mediadores inflamatorios como el TNF y la IL6 [39,40]. El día 14 después del parto, cuando se recogieron las muestras de leucocitos circulantes en este estudio, las células habían sido expuestas a un período de estimulación inflamatoria. Hemos demostrado mediante secuenciación de próxima generación y análisis bioinformáticos que las dietas con diferentes proporciones de concentrado produjeron diferentes efectos sobre el transcriptoma de leucocitos circulantes en vacas PP y MP al comienzo de la lactancia. Esto se asoció con diferencias en su salud y fertilidad. Esta información ha agregado nuevos hallazgos a nuestro informe anterior sobre los efectos de la dieta sobre la producción de leche y la inmunidad [32].

3.1. Comparación de los efectos de las dietas altas y bajas en concentración en vacas multíparas

Las vacas MP con dietas HC tuvieron un CMS más alto que las vacas MC y LC y esto se asoció con concentraciones circulantes más altas tanto de glucosa como de IGF{{0}}. Esto llevó a que las vacas HC tuvieran una ENB menos grave y produjeran más leche. La dieta HC fue formulada para satisfacer los requerimientos de energía y proteínas tanto para la lactancia como para el mantenimiento de la homeostasis corporal y las mediciones de metabolitos confirmaron que su estado metabólico era de hecho mejor que el de las vacas LC, con un menor requerimiento de movilización de tejido para satisfacer las demandas de energía. Esto debería ayudar a acelerar la resolución de los procesos inflamatorios posparto, ya que muchas enfermedades inflamatorias en la lactancia temprana están asociadas o causadas por trastornos metabólicos [38] y anteriormente demostramos que la inflamación uterina se resolvió más rápidamente en vacas con un mejor estado de equilibrio energético. [2]. En el presente estudio, no hubo diferencias en la proporción de PMN a células epiteliales en la luz uterina según la dieta en las vacas MP. Este índice a menudo se toma como un indicador de endometritis citológica [41]. Sin embargo, se observaron diferencias según la dieta en la glándula mamaria, ya que las vacas LC tuvieron un mayor SCC y esto se asoció con una mayor proporción de ellas que experimentaron mastitis clínica durante los primeros 16 DIM (28,6% vs. 0% en las LC vs. .grupos HC).

La mayoría de los DEG identificados en el análisis del transcriptoma de leucocitos estaban involucrados en procesos inmunes y/o metabólicos, como se esperaba en una población de células inmunes. La vía KEGG más importante fue la cascada del complemento y la coagulación, que incluía seis de los genes más regulados a la baja en las vacas HC. De estos, CFB codifica el factor B del complemento, un componente de la vía alternativa de activación del complemento. FGA, FGB y FGG codifican tres subunidades del factor de coagulación fibrinógeno, un componente clave del coágulo sanguíneo que también es importante para unir las bacterias a las plaquetas [42]. La forma de cininógeno de alto peso molecular, codificada por KNG1, también es esencial para la coagulación de la sangre, y el cininógeno libera bradicinina, un péptido con diversas funciones, incluida la actividad antibacteriana y antifúngica. La vitronectina, codificada por VTN, también participa en la regulación de la vía de coagulación y la cicatrización de heridas, mientras que su dominio de unión a heparina proporciona propiedades antimicrobianas. PROC codifica una glicoproteína plasmática cuya forma activada contiene un dominio de serina proteasa que funciona en la degradación de las formas activadas de los factores de coagulación V y VIII, mientras que SERPINA1 codifica un inhibidor de serina proteasa cuyos objetivos incluyen plasmina, trombina y activador del plasminógeno. La regulación positiva del complemento y la cascada de coagulación se ha demostrado previamente en el tejido mamario como una respuesta temprana del huésped a E. coli o Staph. aureus infección [43]. Como esta vía se expresó más en las vacas con la dieta LC, esto respalda la evidencia de una mayor incidencia de mastitis en estos animales.

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Otra función principal resumida por el navegador GO fue el proceso de eliminación de patógenos (interacción entre especies entre organismos), que se asoció con 14 DEG regulados negativamente en las vacas HC (Tabla 4). Esto incluyó una serie de genes implicados en la actividad antiviral (IFI6, IFNB1, ISG15, MX2, OAS1Y, OAS1Z, OAS2 y RSAD2) que se expresaron en niveles más bajos. De estos, IFNB1 codifica interferón beta 1, mientras que los demás son todos genes estimulados por interferón [44,45]. Todos ellos también forman parte de la vía de señalización del receptor tipo NOD (NLR). Los NLR son receptores de reconocimiento de patrones citosólicos que se activan mediante varios componentes no propios, incluido el peptidoglicano bacteriano, que potencialmente inician la expresión dependiente de NF-kappa B-/AP-1-de citocinas proinflamatorias, la expresión de interferones tipo I, la autofagia y inflamación [46]. Nuestro estudio reciente demostró que esta vía estaba regulada positivamente en los leucocitos de vacas infectadas con E. coli [47]. Otro gen identificado fue el MPO, que codifica la mieloperoxidasa, una enzima almacenada en gránulos azurófilos de PMN y macrófagos. Se libera al líquido extracelular durante los procesos inflamatorios y se ha utilizado como marcador de inflamación y estrés oxidativo [48]. IL1R2 codifica un miembro de la familia de receptores de interleucina 1 y fue uno de los DEG con regulación negativa más significativa identificados en las vacas MP. Esto puede unirse a IL1A, IL1B y al receptor de interleucina 1, tipo I (IL1R1/IL1RA), pero actúa como un receptor señuelo para inhibir la actividad del ligando.

El gen con expresión diferencial más significativa entre las vacas MP en las diferentes dietas fue FCER1A, con menor expresión en las vacas HC. Esto codifica una subunidad del receptor de IgE, que es el iniciador de respuestas alérgicas que podrían haber evolucionado para promover la defensa del huésped contra los parásitos mediante la liberación de mediadores como la histamina [49]. Curiosamente, FCER1A fue uno de los 18 genes cuyo nivel de expresión se identificó como discriminatorio entre la fertilidad de las novillas de carne [50]. Su papel preciso en el ganado sigue indeterminado, pero en un ensayo de vacuna con terneros infectados experimentalmente con el nematodo parásito económicamente importante Ostertagia ostertagi, sus niveles de expresión en sangre se correlacionaron positivamente con el recuento de mastocitos y negativamente con el número de gusanos [51]. Otros tres genes regulados positivamente en las vacas HC con alguna función inmune fueron ALAS2, GZMB y LIF. ALAS2 codifica la 50 -aminolevulinato sintasa 2, una enzima ubicada en la mitocondria específica de los eritroides que cataliza el primer paso limitante de la velocidad en la vía biosintética del hemo. El hemo es un cofactor esencial en una variedad de procesos clave, incluido el transporte de oxígeno, mientras que las mutaciones en este gen se han relacionado con una variedad de enfermedades humanas, incluida la anemia [52]. GZMB codifica una preproproteína secretada por células asesinas naturales y linfocitos T citotóxicos y se procesa para generar una proteasa activa que induce la apoptosis de las células diana y también procesa citoquinas y degrada proteínas de la matriz extracelular [53]. El factor inhibidor de la leucemia citoquina, codificado por LIF, se identificó inicialmente a través de su participación en la diferenciación de macrófagos, pero también se ha demostrado que desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario y el establecimiento de la preñez en una variedad de especies, incluido el ganado [54].

Los DEG derivados de la comparación HC versus LC en las vacas MP también se enriquecieron con varias vías importantes asociadas con el metabolismo de la glucosa, las proteínas y los ácidos grasos. Estos incluyeron cuatro DEG regulados negativamente involucrados en las vías de señalización de PPAR (APOA2, APOC3, FABP1 y PCK1). En este estudio, se detectaron tres isoformas principales de PPAR (A, D, G) en la población de leucocitos. Aunque la expresión de los PPAR en sí no se vio influenciada por la dieta, esta vía puede influir en la expresión de genes implicados en el metabolismo de la glucosa y los lípidos, la diferenciación de los adipocitos y las respuestas inflamatorias [55,56] y contribuye a la adaptación metabólica a un suministro limitado de nutrientes mediante genes inductores implicados en la -oxidación [57]. La vía metabólica del retinol también estaba regulada negativamente en las vacas HC, con una menor expresión de RBP4 y TTR (que codifican la proteína de unión al retinol y la transtiretina, respectivamente), las cuales actúan como transportadores de retinol en la sangre. La interacción del retinol con la vía de señalización PPAR influye en la transcripción de muchos otros genes posteriores [58]. APOA2 y APOC3 junto con APOH también forman parte de la vía metabólica del colesterol. El colesterol es un componente importante de la membrana plasmática e influye tanto en su organización como en su función [59,60]. Estudios recientes han subrayado un papel emergente del colesterol como un importante modulador de la actividad inmune innata y adaptativa [61].

La vía de glucólisis/gluconeogénesis se asoció con tres DEG regulados negativamente en las vacas alimentadas con HC (ADH1C, ALDOB y PCK1). De estos, PCK1 codifica la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1, que actúa como el principal punto de control para la regulación de la gluconeogénesis. Esta enzima, junto con el GTP, cataliza la formación de fosfoenolpiruvato a partir de oxalacetato, con liberación de dióxido de carbono y GDP. La activación de las vías inmunes/inflamatorias promueve la transcripción de genes gluconeogénicos a través del receptor tipo peaje 4 (TLR4) [62]. Esto puede hacer que las células inmunes cambien su metabolismo de la glucosa de la fosforilación oxidativa a la glucólisis para producir la energía y los nutrientes necesarios para la proliferación y la producción de moléculas inmunes [12,63]. Esto conduce a una mayor demanda de glucosa que compite con el requisito de producción de lactato [64].

En resumen, las diferencias en la expresión genética entre las vacas MP con las dietas HC y LC proporcionan evidencia de una mayor actividad inmune regulada e inflamación en las vacas LC. Esto estuvo acompañado de una mayor incidencia de mastitis. Por el contrario, los genes que codifican algunas proteínas que probablemente beneficien la salud y la fertilidad, como ALAS2 y LIF, estaban regulados positivamente en las vacas HC. Esto respalda los índices metabólicos medidos que muestran que hubo una mejora en el estado de EBAL en las vacas MP con las dietas HC, lo que probablemente ayudó a protegerlas contra el desarrollo de enfermedades infecciosas o metabólicas.

3.2. Comparación de los efectos de las dietas altas y bajas en concentración en vacas primíparas

De manera similar a las vacas MP, las vacas PP con la dieta HC también tuvieron un CMS más alto, de aproximadamente 4 kg/d, pero la producción de leche no aumentó significativamente. No hubo diferencias significativas en las concentraciones circulantes de glucosa, NEFA, BHB o IGF-1, y solo la urea fue más alta en la dieta LC. En contraste, hubo diferencias más significativas en la expresión del gen de los leucocitos entre los grupos dietéticos que en las vacas MP, con 460 versus 173 DEG identificados en las comparaciones HC versus LC, de los cuales el 83% estaban regulados positivamente en las vacas PP con la dieta HC. Sólo una pequeña proporción de los DEG se superpusieron entre los dos grupos de edad (Figura 3), lo que sugiere que los cambios en la función de los leucocitos a la dieta de lactancia temprana fueron más sensibles en las vacas PP que en las vacas MP. Esperábamos que la dieta HC beneficiara a las vacas PP al aumentar su CMS y cumplir plenamente con los requerimientos dietéticos calculados de proteínas no degradables y metabolizables. De hecho, EBAL mejoró con la dieta HC, pero el análisis de expresión genética mostró una regulación positiva mucho mayor de los genes implicados en la defensa inmune. Las vacas alimentadas con HC también tuvieron una mayor proporción de PMN: UEC en el útero junto con un SCC numéricamente mayor y más casos de mastitis. Esto sugiere que en realidad eran más propensos a las enfermedades, y no menos. Anteriormente encontramos que los neutrófilos recolectados de las vacas PP en este estudio en las primeras tres semanas de lactancia tenían un índice fagocítico y un índice de explosión oxidativa significativamente más altos en comparación con las vacas MP, pero 2-los efectos de la dieta y la paridad en estas mediciones no fueron reportadas [32].

Los procesos del sistema inmunológico identificados en la comparación HC versus LC incluyeron la regulación positiva del receptor de la superficie celular y las vías de señalización de reconocimiento de patrones, quimiotaxis, producción de citoquinas y migración de leucocitos en las vacas alimentadas con HC. Los DEG identificados se asociaron con una variedad de mecanismos de defensa inmune, incluidos una variedad de péptidos antimicrobianos (AMP) (CATHL6, CXCL13, DEFB1, LTF, PGLYRP1, PGLYRP4, SA100A8, SA100A9, S100A1 y SLC11A1). Estos no sólo pueden matar directamente a los organismos invadidos, sino que también ayudan a modular otros procesos inmunitarios y antimicrobianos [65-67]. La regulación positiva de los péptidos antimicrobianos en los perfiles transcriptómicos de los leucocitos se ha demostrado previamente en vacas con mastitis clínica [47,68] y metritis/endometritis [69,70]. La función de adhesión de leucocitos se asoció con 16 DEG regulados positivamente y cinco DEG regulados negativamente en los animales alimentados con HC. La adhesión de los leucocitos a las paredes capilares es un primer paso vital para permitirles transmigrar desde la sangre y circular hacia sitios de daño tisular, infección e inflamación [71]. Tanto las interacciones célula-célula como célula-matriz influyen en el fenotipo de los leucocitos, y la desregulación de las vías de adhesión puede conducir a una activación persistente de los leucocitos con inflamación no resuelta [72]. De los DEG regulados positivamente identificados, ADAM8, ANGPTL3, CD24, ICAM3 y THY1 están involucrados en la extravasación [73,74], mientras que FN1, NRP1, TNFAIP6 y VCAN tienen funciones potenciales en el tráfico de células leucocitarias y funcionan en tejidos inflamados [72, 75]. Los genes que codifican los receptores de quimiocinas CXCR1 y CXCR2 también estaban regulados positivamente en las vacas alimentadas con HC; Ambos son importantes para estimular la quimiotaxis de los PMN hacia los sitios de infección, así como para activar procesos bioquímicos que matan las bacterias invasoras [76].

De los genes regulados negativamente asociados con la adhesión en vacas alimentadas con HC, BCAR1 codifica una proteína multifuncional conocida como cas con participación en la motilidad celular, la apoptosis y el control del ciclo celular [77]. Los polimorfismos en BCAR1 se han asociado previamente con SCC y resistencia a la mastitis [78]. ADGRG1 (también conocido como GPR56) codifica un receptor acoplado a proteína G que se une al colágeno 3 y a la transglutaminasa 2, ambos componentes del estroma tisular. Se demostró que ADGRG1 desempeña un papel en las células asesinas naturales (NK) humanas, en las que inhibe su citotoxicidad [79]. Su propia expresión se regula negativamente después de la activación inducida por citocinas, lo que estaría de acuerdo con los resultados que se muestran aquí. La proteína CD96 también actúa como un receptor de punto de control inhibidor en las células NK [80]. Estudios previos sobre cambios en el transcriptoma de leucocitos durante el período de transición también han encontrado cambios en la expresión génica relacionados con la migración transendotelial, aunque con conclusiones diferentes, informando activación después del parto [81] o inhibición [82], respectivamente. Nuestro análisis también identificó una serie de diferencias en las vías de señalización de signos del metabolismo de los aminoácidos en vacas PP con la dieta HC en comparación con aquellas con la dieta LC, asociadas con enzimas codificadas por cinco DEG regulados positivamente (ARG2, ASS1, GPT2, SDS y SDSL). . De estos, ASS1 codifica la arginina succinato sintasa 1, que cataliza el penúltimo paso de la vía biosintética de la arginina, mientras que ARG2 codifica la arginasa, que cataliza la hidrólisis de la arginina a ornitina y urea. La L-arginina también se puede convertir en óxido nítrico, una molécula de señalización que desempeña un papel clave en la patogénesis de la inflamación [83]. La transaminasa glutámico-pirúvica 2 (GPT2) es una enzima mitocondrial que cataliza la transaminación reversible entre alanina y 2-oxoglutarato para generar piruvato y glutamato. Este gen está regulado positivamente en condiciones de estrés metabólico y desempeña un papel en el impulso de la gluconeogénesis a partir del metabolismo de los aminoácidos [84]. La serina deshidratasa (SDS) codifica una enzima que convierte la L-serina en piruvato y amoníaco, mientras que se prevé que la serina deshidratasa (SDSL) participe en la vía de biosíntesis de isoleucina a partir de treonina.

La vía del metabolismo del colesterol se asoció con cuatro DEG regulados positivamente en la dieta HC (ANGPTL3, LRP1, SCARB1 y SORT1). Esto podría conducir a la acumulación de colesterol en los leucocitos de las vacas alimentadas con HC y promover la inflamación, incluido el aumento de la señalización de TLR, la activación del inflamasoma y una mayor producción de monocitos y neutrófilos en la médula ósea y el bazo [85]. La vía del metabolismo del ácido araquidónico con cinco DEG regulados positivamente (como se enumeran anteriormente) conduce a la producción de cascadas de productos pro y antiinflamatorios, como prostaglandinas y leucotrienos [86]. La vía del metabolismo de los glicerolípidos se asoció con cuatro DEG regulados positivamente (DGAT2, DGKG, GK y GPAT3) que codifican genes lipogénicos implicados en la síntesis de triacilglicerol. Su acumulación puede inducir activación e inflamación de los leucocitos [87,88]. Todos estos hallazgos respaldan la conclusión de que la dieta HC reguló positivamente las vías metabólicas de los leucocitos en las vacas PP de una manera que aumentó sus respuestas inmunes/inflamatorias. Trabajos previos en vacas se han centrado principalmente en el período seco y han demostrado que la sobrealimentación y un alto nivel de CC en este momento promueven la movilización posterior de lípidos y una mayor respuesta inflamatoria durante el período periparto [34]. En el presente estudio, la relación PMN uterina: UEC y la tendencia hacia un mayor SCC respaldan la sugerencia de que hubo una mayor migración de leucocitos al útero y la glándula mamaria en las vacas PP que recibieron la dieta HC. Si bien este es un componente esencial de la defensa inmune, la sobreactivación puede contribuir a la hiperinflamación. Se requieren más estudios con un tamaño de muestra más grande para confirmar estos hallazgos.

3.3. Similitudes en respuesta a la dieta de vacas multíparas y primíparas

In terms of metabolic changes, both the MP and PP cows had higher circulating concentrations of urea when on the LC diet. Blood urea in both late pregnancy and early lactation may rise following mobilization of amino acids stored in skeletal muscle [89] or when dietary protein supply exceeds energy availability or protein needed [90], so these situations could have applied here. Elevated levels of urea have been associated with reduced fertility, but only at >4,5 mmol/L, superior a las concentraciones alcanzadas en los animales alimentados con LC en el presente estudio [91]. Con respecto a los datos de transcripción de genes de leucocitos, es interesante observar que los DEG derivados de la comparación HC vs LC en ambos grupos de edad se enriquecieron con la vía de digestión y absorción de proteínas, en la que los genes que codifican varias isoformas de colágeno desempeñan papeles importantes. . Entre ellos, había tres genes de colágeno regulados positivamente (COL1A1, COL1A2 y COL3A1) en las vacas MP y PP, y un gen de colágeno regulado negativamente (COL5A3) en las vacas MP. Sus valores de expresión en las muestras fueron pequeños, pero las diferencias fueron significativas. Parte de este ARN podría provenir de fibrocitos, una población celular que comprende solo el 0.1–0.5% de las células no eritrocíticas en la sangre periférica [92,93]. El colágeno es un potenciador inmunológico de larga data involucrado en muchos procesos inmunológicos/inflamatorios [93,94]. Por lo tanto, su producción regulada positivamente en la sangre circulante por la dieta HC puede afectar la función de los leucocitos.

3.4. Implicaciones para la fertilidad

Muchos estudios previos han informado que el estado metabólico e inmunológico interrelacionado y la incidencia de enfermedades de las vacas en la lactancia temprana tienen una influencia importante en su fertilidad posterior (p. ej., [38,95]). Nuestro propio trabajo demostró que las vacas MP con una concentración baja de IGF-1 a las 14 DIM tenían menos probabilidades de concebir [37]. Más recientemente, informamos que el 63% de las vacas con IGF-1 bajo en este momento experimentaron más de un problema de salud durante sus primeros 35 DIM en comparación con solo el 26% de las vacas con IGF-1 alto. Esto incluyó más animales con infecciones uterinas y mastitis clínica [10]. Foley y cols. [69] diferenciaron entre vacas sanas, que fueron capaces de restaurar la homeostasis dentro de las 3 semanas posteriores al parto, y otras que experimentaron una respuesta inflamatoria más grave y prolongada que luego desarrolló endometritis clínica. Galvão et al. demostraron una asociación con la sangre periférica. [96] quienes demostraron que los neutrófilos de vacas en peor EBAL tenían un menor contenido de glucógeno a los siete DIM y estos animales experimentaron más enfermedades uterinas, potencialmente asociadas con la menor disponibilidad de combustibles oxidativos para las respuestas inmunes. La mastitis clínica al comienzo de la lactancia también se asocia con mayores tasas de pérdida de embriones antes de la implantación, con algunos indicios de que un BCS bajo aumenta aún más el riesgo [97]. Se han sugerido varios mecanismos asociados con la producción de citoquinas y prostaglandinas y otros mediadores inflamatorios que podrían afectar al ovario y/o causar un ambiente uterino desfavorable [98,99]. Los datos de fertilidad obtenidos de las vacas de nuestro estudio respaldaron los hallazgos relacionados con su estado inmunológico y su salud al comienzo de la lactancia. Las vacas MP con la dieta LC requirieron numéricamente más S/C de acuerdo con su EBAL más pobre junto con evidencia del análisis del transcriptoma de leucocitos de una defensa inmune más activa en progreso, respaldada por su mayor incidencia de mastitis. Por el contrario, las vacas PP con la dieta HC tardaron significativamente más en concebir y menos quedaron preñadas en comparación con las vacas alimentadas con LC. Tenían más evidencia de inflamación al comienzo del embarazo a pesar de que su EBAL calculado fue mejor. En la actualidad, los mecanismos subyacentes que causan su mal estado de salud y fertilidad son inciertos, aunque también hemos encontrado evidencia basada en la expresión genética global de una mayor inflamación y fibrosis hepática (Cheng, Little, Ferris, Takeda, Ingvartsen, Crowe y Wathes, observaciones no publicadas). .

3.5. limitaciones del estudio

Había menos vacas PP por grupo disponibles, y esto redujo el poder estadístico de los análisis relacionados con los fenotipos. Por lo tanto, se requieren más estudios con una muestra más grande para confirmar los efectos de la dieta sobre la reproducción y las enfermedades. En el presente estudio, extrajimos todo el ARN de sangre periférica completa utilizando tubos Tempus y su sistema de aislamiento. Esto ofrece facilidad de recolección para un estudio agrícola a gran escala, pero no separa los tipos de células, que incluirán linfocitos T y B, células asesinas naturales, plaquetas, monocitos, granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y fibrocitos. Por lo tanto, los datos de expresión genética presentados se han visto influenciados por posibles efectos del tratamiento en las proporciones relativas de tipos de células particulares, además de sus cambios transcripcionales individuales. Estos resultados también se basan en los niveles de transcripción de genes y no incluyen información sobre su procesamiento postraduccional, que también influirá en la cantidad de proteína funcional que se produce.

4. Materiales y métodos

4.1. Animales y dietas

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y estaban cubiertos por la Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior número PPL2754 y un Certificado de Designación para el Establecimiento. El trabajo también fue aprobado por el Comité de Ética y Bienestar del Instituto de Agroalimentación y Biociencias (AFBI, Belfast, Irlanda del Norte, Reino Unido). Se reclutaron sesenta y dos vacas lecheras Holstein-Friesian del rebaño AFBI. Entre ellas, 18 eran PP (lactancia 1) y 44 MP con números de lactancia 2 a 7 (3,5 ± 1,28) y todas las vacas estaban sanas según el examen del veterinario. El peso al parto fue de 680 ± 62 (Media ± STD) kg para las vacas MP y de 550 ± 39 kg para las vacas PP. Después del parto, las vacas PP y MP fueron asignadas por separado a tres grupos dietéticos, con la asignación en cada grupo de edad equilibrada para la capacidad de transmisión prevista de grasa más proteína (kg), BW antes del parto y BCS. Las vacas MP también estuvieron equilibradas en cuanto a paridad y producción de leche del día de la lactancia anterior 305-. A las vacas se les ofreció (1) concentrado bajo (LC, 30% de concentrado más 70% de ensilaje de pasto, n=6 para PP y n=14 para MP); (2) concentrado medio (MC, 50 % de concentrado más 50 % de ensilaje de pasto, n=6 para PP y n=15 para MP) o (3) concentrado alto (HC, 70 % de concentrado más 30 % ensilaje de pasto, n=6 para PP y n=15 para MP) dietas (porcentajes sobre la base de materia seca). El concentrado para cada tratamiento se formuló para lograr una concentración común de proteína cruda (PB) total de la dieta para cada uno de LC, MC y HC (152, 152 y 154 g/kg MS respectivamente), mientras que la energía metabolizable total calculada de la dieta ( ME) los contenidos fueron 12,0, 12,4 y 12,8 MJ/kg MS. Se estimó que las dietas suministraban 1556, 1997 y 2420 g/d de proteína degradable en el rumen efectiva; 559, 733 y 888 g/d de proteína dietética no degradable y 1346, 1817 y 2275 g/d de proteína metabolizable para LC, MC y HC, respectivamente. El acceso a las raciones de tratamiento se controló mediante un sistema de alimentación Calan Broadbent (American Calan Inc., Northwood, NH, EE. UU.) vinculado a un sistema de identificación electrónica, que permitió registrar diariamente el consumo individual de las vacas. Las dietas para cada tratamiento se ofrecieron al 107% de la ingesta de los días anteriores para asegurar el consumo ad libitum. A todas las vacas también se les ofreció 0,5 kg de concentrado adicional en cada ordeño a través de un sistema de alimentación en la sala para ayudar a mantener un flujo eficiente de las vacas. El presente estudio fue parte de un proyecto más amplio y los detalles completos de las dietas ofrecidas, el manejo de la alimentación y la composición de los alimentos se describieron previamente [32].

4.2. Recopilación de datos sobre el fenotipo de la vaca

Los pesos corporales se registraron dos veces por semana utilizando básculas. El BCS se estimó en alrededor de 14 DIM [100]. Todas las vacas fueron ordeñadas dos veces al día y se registraron sus rendimientos diarios. Las muestras de leche se analizaron dos veces por semana mediante análisis de infrarrojo medio para determinar las concentraciones de proteínas, grasas y lactosa, y se contaron las células somáticas de la leche. Se recogieron muestras adicionales de leche de la mañana (2 × 8 ml) dos veces por semana y se almacenaron a -18 ◦C para el análisis de LDH (EC. 1.1.1.27) y NAGasa (EC 3.2.1.30) mediante ensayos fluorométricos [101]. La producción de leche corregida por energía (ECM; kg/día) se calculó siguiendo los métodos utilizados en nuestro grupo [32]. La EBAL de cada vaca se estimó utilizando el método descrito anteriormente [102].

La mastitis clínica se diagnosticó utilizando métodos estándar basados ​​en observaciones diarias de cambios anormales en la apariencia de la leche (p. ej., escamas, coágulos), calidad, producción de leche y respuestas inflamatorias mamarias (enrojecimiento, hinchazón, calor o dolor). Se utilizaron lecturas de SCC de leche junto con los diagnósticos clínicos para clasificar a las vacas en tres grupos. Se definió que las vacas sanas tenían un RCS < 100,000 células/ml de leche y no presentaban síntomas clínicos. Las vacas con mastitis subclínica se definieron como aquellas que tenían un SCC entre 100,{3}} y 400,000 células/mL de leche y sin síntomas clínicos aparentes. Las vacas diagnosticadas con mastitis clínica tuvieron un SCC > 400,000 células/ml de leche y mostraron algunos de los síntomas clínicos anteriores. Las vacas fueron inseminadas en el momento del estro observado utilizando prácticas normales del rebaño y los datos de fertilidad durante la lactancia posterior o hasta que el animal fue sacrificado se recuperaron de los registros del rebaño. Los datos reportados incluyeron días hasta el primer servicio (DFS), días hasta la concepción (días abiertos), servicios por concepción y la proporción de vacas que concibieron. Además, los datos de concepción se calificaron utilizando una puntuación de 4-punto en la pantorrilla según (ICB) como (1)<100 days, (2) 100–200 days, (3) >200 días, o (4) no lograron concebir o fueron sacrificadas.

4.3. Análisis de citología uterina

Se tomó una muestra de citocepillo uterino (Minitube, Minitüb GmbH, Tiefenbach, Alemania) de cada vaca alrededor de las 14 DIM para evaluar la citología endometrial, como se describió anteriormente [103]. Se guió manualmente un citocepillo de doble protección a través del cuello uterino hasta el útero, se extruyó la protección interna de la protección externa y se giró suavemente el cepillo contra la pared endometrial. Luego se retiró el cepillo dentro de la protección interior y se retiró. Se prepararon portaobjetos para examen citológico haciendo rodar el citocepillo sobre un portaobjetos de vidrio limpio para microscopio y fijando la muestra con fijador de citología Fisherbrand™ CytoPrep™ (Fishers Scientific, Blanchardstown, Irlanda). Los portaobjetos fijos se enviaron a la Facultad de Medicina Veterinaria de la UCD, University College Dublin, Irlanda, para su procesamiento y se tiñeron con tinción de Giemsa modificada. La evaluación citológica se realizó contando las UEC de PMN con un aumento de 400 × (Leitz Labourlux-S, Wetzlar, Alemania) y determinando su proporción, con un promedio de 10 campos de alta potencia por portaobjetos.

4.4. Análisis de metabolitos circulantes e IGF-1

A los 14 ± 2 (media ± STD) días después del parto, se recogieron 10 ml de muestras de sangre de la vena yugular de todas las vacas en tubos de heparina Na para plasma y tubos simples para suero. Tras la separación del plasma o suero con centrifugación, se almacenaron a -20 ◦C hasta el análisis. Las concentraciones plasmáticas de glucosa, urea, BHB, NEFA y colesterol se midieron utilizando los métodos descritos anteriormente [20,25]. Brevemente, la concentración sérica de NEFA se determinó con el método ACS-ACOD utilizando kits NEFA C (Wako, Neuss, Alemania). La glucosa plasmática se cuantificó con un método enzimático (ADVIA 1800 Clinical Chemistry System, Siemens Healthcare Diagnostics, Ballerup, Dinamarca). El BHB sérico se determinó midiendo la absorbancia a 340 nm debido a la producción de NADH a pH alcalino en presencia de BHB deshidrogenasa. La urea sérica se analizó mediante espectrofotometría. Los coeficientes de variación (CV) intra e interensayo estuvieron en todos los casos por debajo del tres y el cuatro por ciento, respectivamente, tanto para las muestras de control bajas como para las altas. Las concentraciones de IGF-1 en suero se cuantificaron con radioinmunoensayo después de la extracción con etanol ácido [104]. El CV intraensayo fue de 12,4, 7,5 y 9,9 % para las muestras de control bajo, medio y alto, respectivamente.

4.5. Extracción de ARN en sangre

Se recogieron muestras de sangre para la extracción de ARN mediante venopunción yugular de todas las vacas a 14 ± 2 DIM en tubos de ARN sanguíneo Tempus (Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido). Los tubos se agitaron vigorosamente durante 15–20 segundos inmediatamente después de la recolección, luego se congelaron y almacenaron a −80 ◦C para la extracción de ARN. El ARN de sangre total se extrajo utilizando los kits de aislamiento de ARN Tempus Spin (Thermo-Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante como se describió anteriormente [20]. Se utilizó un Agilent BioAnalyzer 2000 (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, Reino Unido) con el Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, Reino Unido) para evaluar la cantidad e integridad del ARN. Además, la cantidad y pureza se validaron con un NanoDrop 1000 (Thermo Fischer). Los datos de calidad se resumen en el archivo complementario S3. Esto demostró que todas las muestras de ARN tenían una integridad razonable (número RIN > 8,7, 9,3 ± 0,3) y pureza (260/280 entre 2,01 y 2,15, media ± STD 2,10 ± 0,03), por lo que no se eliminaron animales del análisis. El ARN se almacenó a -80 ◦C para su posterior secuenciación.

4.6. Secuenciación, mapeo y cuantificación de ARN

El ARN de leucocitos extraído se secuenció en la plataforma Illumina NextSeq 500 como se describió anteriormente [68]. Brevemente, utilizando la estación de trabajo de manipulación de líquidos epMotion (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), se transcribieron de forma inversa 750 ng de ARN total en bibliotecas de secuenciación de ADNc con el kit Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Ribo-Zero Gold (Illumina, San Diego, CA, EE. UU. ). Las bibliotecas de ADNc agrupadas se secuenciaron en un secuenciador Illumina NextSeq 500 con lecturas de un solo extremo de 75 nucleótidos de longitud para alcanzar un promedio de 33,5 millones de lecturas por muestra. Los archivos FASTQ sin procesar se depositaron en el Archivo Europeo de Nucleótidos (E-MTAB-9347 y E-MTAB-9431). Todos los análisis de secuenciación se llevaron a cabo utilizando CLC Genomic Workbench v21 (Qiagen, Manchester, Reino Unido). Cada muestra contenía las lecturas de cuatro carriles y se fusionaron en un archivo fastq. La calidad de los archivos fastq sin procesar y recortados se evaluó siguiendo un Illumina Pipeline 1.8 y se eliminó cualquier lectura fallida. Luego, las lecturas se asignaron a un ensamblaje del genoma de referencia de Bos taurus (ARS-UCD1.2 proporcionado por RefSeq en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, consultado el 1 de enero de 2021) y se cuantificaron como lecturas por gen. lecturas por kilobase millón (RPKM) y transcripciones por kilobase millón (TPM). Estos se almacenaron como archivos de expresión genética (GE) en CLC Genomics Workbench para usarse en el siguiente análisis de expresión genética diferencial.

4.7. Análisis de la expresión genética diferencial entre los grupos dietéticos.

Antes del análisis de expresión diferencial para el efecto de la dieta, utilizamos el análisis de componentes principales (PCA) con los valores de RPKM para identificar los valores atípicos, y esto mostró que dos vacas (Blood020009, MP y Blood020103, PP) eran valores atípicos de la población. y, por lo tanto, fueron excluidos de análisis adicionales (Archivo complementario S4A). El análisis de componentes principales también mostró que solo había una superposición limitada en el patrón general de expresión genética entre las vacas PP y MP (Archivo complementario S2B). Esto apoyó el diseño del estudio original para analizar cada grupo de edad por separado. Por lo tanto, los archivos GE derivados de todas las muestras individuales se separaron por grupo de edad (PP, n=5–6 por grupo y MP, n=14–15 por grupo). Los DEG entre los grupos dietéticos en vacas PP o MP se identificaron con CLC Genomics Workbench V21 mediante un procedimiento similar a ANOVA unidireccional. Las tasas de descubrimiento falso (FDR) para pruebas múltiples se ajustaron con Benjamini-Hochberg (BH) y se consideró significancia en p <0,05. Los cambios en veces (FC) se calcularon como la relación de expresión génica del grupo de concentrado superior al grupo de concentrado inferior (p. ej., HC frente a LC, MC frente a LC o HC frente a MC) si el valor del grupo de concentrado superior fue mayor que el del grupo de concentrado inferior (cambio positivo, regulación positiva). Si el valor del grupo de concentrado inferior era mayor que el del grupo de concentrado superior, se utilizaba la proporción del grupo de concentrado inferior con respecto al grupo de concentrado superior (p. ej., LC frente a HC, MC frente a HC y LC frente a MC). ) (cambio negativo, regulación negativa). Los DEG regulados hacia arriba y hacia abajo con un cambio absoluto mayor o igual a 1,5 entre grupos dietéticos se seleccionaron para análisis adicionales.

4.8. Análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO)

Los DEG derivados de comparaciones de pares entre los grupos dietéticos se ingresaron en Partek Genomics Suite V7.1 (Partek Incorporation, Chesterfield, MO, EE. UU.) para el análisis de enriquecimiento de GO para la investigación de las funciones biológicas y las interacciones entre los DEG y la Enciclopedia de Kyoto asociada de Vías de genes y genomas (KEGG) con un genoma de Bos taurus ARS-UCD1.2. Se utilizó la prueba exacta de Fisher con ajuste de BH y se consideró significancia estadística p < 0.05.

4.9. Análisis estadístico de datos de fenotipo

Los datos derivados de todas las vacas se dividieron primero por grupo de edad (vacas PP y MP), según el diseño del estudio. Los valores de DMI, BW, parámetros de la leche, EBAL, BCS, metabolitos circulantes (glucosa, urea, BHB, NEFA, colesterol e IGF{{0}}), SCC (transformado logarítmicamente) y recuentos de células uterinas y sus proporciones se resumieron como media ± error estándar de la media (SE). Se utilizó un análisis estadístico para comparar las diferencias entre los grupos dietéticos utilizando un ANOVA unidireccional integrado en el paquete de software SPSS V28 (Chicago, IL, EE. UU.). La homogeneidad de la varianza para cada variable se probó con la estadística de Levene antes del ANOVA. Los resultados mostraron que no se logró la homogeneidad entre grupos para ECM, EBAL, glucosa, urea, BHB e IGF-1 en las vacas PP, por lo que se aplicó transformación logarítmica para estas variables. Cuando ANOVA mostró significación, se llevaron a cabo comparaciones múltiples con el método LSD de Fisher para identificar la fuente de las diferencias. Como no se pudo lograr la homogeneidad de la varianza de los datos de SCC de leche y citología uterina después de la transformación logarítmica, estas variables se probaron utilizando un ANOVA unidireccional de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn. Los datos de fertilidad se probaron con el método de Wilcoxon. En todos los casos se consideró significancia p < 0,05.

5. Conclusiones

Este estudio respalda trabajos anteriores que demostraron vínculos claros entre el estado metabólico de las vacas al comienzo de la lactancia y su función inmune. La mayoría de las investigaciones anteriores destinadas a mejorar la salud posparto a través de una mejor nutrición se han centrado en el período preparto y han demostrado que la sobrealimentación y un alto nivel de BCS en este momento promueven la movilización posterior de lípidos y una mayor respuesta inflamatoria durante el período periparto [34]. En cambio, hemos evaluado si es posible alterar la funcionalidad inmune después del parto alterando la dieta de lactancia. Encontramos que la respuesta a la inclusión adicional de concentrado, que proporcionó una dieta formulada para satisfacer los requerimientos energéticos y proteicos del animal, produjo diferentes efectos sobre el transcriptoma de leucocitos en vacas MP y PP. En las vacas MP, la dieta HC fue claramente beneficiosa, ya que los leucocitos de la vaca LC tenían una regulación positiva del complemento y la cascada de coagulación y mecanismos de defensa inmune innatos contra los patógenos. Por el contrario, los leucocitos en las vacas PP con la dieta HC mostraron mayores respuestas inmunes/inflamatorias y tenían una relación PMN:UEC más alta, lo que sugiere una mayor migración de leucocitos al útero. Posteriormente, estas vacas tuvieron un intervalo más largo entre el parto y la concepción, lo que indica una fertilidad más pobre. Se justifica seguir trabajando con un mayor número de vacas para confirmar el hallazgo de un efecto de la dieta sobre la fertilidad y comprender más completamente cómo las respuestas metabólicas de la dieta posparto difieren en los animales más jóvenes.

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