Xican Li 1,2,*,† ID, Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 y Dongfeng Chen 3,4

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com

1 Escuela de Medicina Herbal China, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou 510006, China; xieyulu1900@163.com (YX); xiehongxh1@163.com (HX); 15622178307@163.com (QG); 15228738137@163.com (PX); pandiphd@163.com (YM)

2 Laboratorio de Investigación y Desarrollo Innovador de TCM, Universidad de Medicina China de Guangzhou,

Cantón 510006, China

3 Escuela de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou 510006, China; ys1090992678@163.com (KL); chen888@gzucm.edu.cn (DC)

4 El Centro de Investigación de Medicina Integrativa Básica, Universidad de Medicina China de Guangzhou,

Cantón 510006, China

5 Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad Farmacéutica de Guangdong, Guangzhou 510007, China

6 Facultad de Medicina de Zhongshan, Universidad Sun Yat-sen, No. 74 Zhongshan Road. 2, Cantón 510080, China; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 Departamento de Histología y Embriología, Universidad Médica del Sur, Guangzhou 510515, China;

† Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

Recibido: 24 de enero de 2018; Aceptado: 20 de febrero de 2018; Publicado: 23 febrero 2018

Resumen: El estudio trató de explorar el papel de los residuos de azúcar y los mecanismos de fenólicofenilpropanoideantioxidantes. Acteósido, junto con su apiosido forsythoside B y ramnosido

poliumósido, se investigaron comparativamente usando varios ensayos de antioxidantes. En tres ensayos basados ​​en transferencia de electrones (ET) (FRAP, CUPRAC, PTIO·-barrido a pH 4,5), los niveles relativos de antioxidantes se determinaron aproximadamente comoacteósido >forsythoside B > poliumoside. Tal orden también se observó en

Ensayo de barrido de PTIO· implicado en transferencia de H+ a pH 7,4, y en tres ensayos de barrido de radicales implicados en múltiples vías, es decir, ABTS más barrido de ·, barrido de DPPH· y barrido de ·O2. En los espectros UV-vis, cada uno de ellos mostró un desplazamiento hacia el rojo a 335 364 nm y dos picos débiles (480 y 719 nm), cuando se mezclaron con Fe2 plus; sin embargo,acteósidodio la absorción más débil.

En la cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con el análisis de espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo cuadrupolo de ionización por electropulverización (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS), no se encontró ningún pico de formación de aductos radicales (RAF). El ensayo MTT reveló que el poliumósido exhibió la mayor viabilidad de las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea sometidas a estrés oxidativo. En conclusión,acteósido, forsythoside B y poliumoside pueden estar involucrados en múltiples vías para ejercer la acción antioxidante, incluida la ET, la transferencia de H+ o la quelación de Fe2+, pero no la RAF. La transferencia de ET y H plus puede verse obstaculizada por restos ramnosilo y apiosilo; sin embargo, el potencial quelante de Fe2 plus puede mejorarse mediante dos residuos de azúcar (especialmente el resto ramnosilo). El efecto general de los restos ramnosilo y apiosilo es mejorar los efectos antioxidantes o citoprotectores.

Palabras clave:acteósido; apiosil; forsytósido B;fenilpropanoideglucósidos; poliumósido; ramnosilo

la cistanche tiene el efecto de la anti-oxidación

1. Introducción

Recientemente, acteoside (verbascoside, Figura 1), un fenólicofenilpropanoideglucósidoque se encuentra en la verbena y otras plantas [1], mejoró la eficiencia de la transferencia nuclear de células somáticas caninas (SCNT) durante el proceso de clonación de perros [2]. Además, el acteósido podría proteger a las células SH-SY5Y del neuroblastoma humano contra el daño inducido por -amiloide [3] ya los fibroblastos de la piel humana contra el daño inducido por rayos X [4]. Su apiosido forsythoside B (Figura 1) también se distribuye en las plantas [5] y se ha observado que ejerce potentes efectos neuroprotectores con una ventana de tiempo terapéutica favorable [6]. Se cree que estos efectos beneficiosos sobre las células y los tejidos están asociados con la protección de algunas biomoléculas, como los lípidos y el ADN. De hecho, se ha demostrado que el acteósido y su análogo cistanósido F inhiben la peroxidación lipídica mitocondrial en ratas [7]. Se sabe que la peroxidación de lípidos es el resultado del estrés oxidativo celular y, en última instancia, de las especies reactivas de oxígeno (ROS).

Figura 1. Las estructuras (izquierda) y los modelos de bola y palo basados ​​en conformación preferencial (derecha) de tresfenilpropanoideglucósidos(actósido, forsytósido B y poliumósido).

Desde el punto de vista de la protección del ADN, el acteósido y sus derivados pueden reparar rápidamente los radicales del ADN, como la 2'-desoxiadenosina-5'-monofosfato (dAMP) y la 2'-desoxiguanosina-5'-monofosfato (dGMP) [ 8]. Estos radicales desoxinucleótidos secundarios pueden dañar aún más las células por oxidación, lo que lleva a la mutagénesis y la carcinogénesis [9]. El estudio biofísico indicó que el acteósido y sus derivados podrían acoplarse a los surcos menores del ADN y reparar rápidamente dicho daño oxidativo del ADN [10]. El modelo ball-stick basado en la conformación preferencial propone (Figura 1, derecha) que estas moléculas son alargadas y pueden alcanzar fácilmente el bucle de ADN y, por lo tanto, pueden reparar rápidamente el daño de los radicales de ADN [8].

Sin embargo, desde el punto de vista de la bioquímica, la reparación se lleva a cabo esencialmente a través de una vía de eliminación de ROS (es decir, antioxidante). Como se mencionó anteriormente, la generación de cationes radicales de desoxinucleótidos se debe en última instancia al ataque de ROS, incluidos los radicales libres (p. ej., radical ·OH [11]) y moléculas oxidantes (p. ej., H2O2 [12]). Se cree que la eliminación de ROS reduce de manera eficiente el estado oxidativo celular [13,14] y mejora la calidad de las células madre [12,15]. Por lo tanto, es necesario estudiar su capacidad antioxidante y discutir más a fondo los posibles mecanismos.

En este estudio, tres compuestos fenólicosfenilpropanoideglucósidos(actósido, forsytósido B y poliumósido) se investigaron comparativamente usando varios ensayos de antioxidantes, incluido el 2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil{{6 }}ensayo de captación de radicales de óxido (PTIO·), ensayo de potencia antioxidante reductora de iones férricos (FRAP), ensayo de capacidad antioxidante reductora de cúprico (CUPRAC), 2,2→-azino-bis(3-etilbenceno-tiazolina{{13 }}ensayo de eliminación de radicales de ácido sulfónico (ABTS plus ·),

Ensayo de 1,1-difenil-2-picril-hidrazina (DPPH·) y ·ensayo de barrido de O2, así como análisis de espectro UV de Fe2 más quelantes. Posteriormente, sus productos de reacción con DPPH· se determinaron mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento acoplada con análisis de espectrometría de masas en tándem de cuadrupolo de ionización por electrospray (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS). Finalmente, se estimó su efecto citoprotector frente a las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (bmMSC) utilizando el

Ensayo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilo (MTT). Como se ve en la Figura 1, la diferencia entre los tres compuestos fenólicosfenilpropanoideglucósidos(es decir, acteoside, forsythoside B, y poliumoside) es el tipo de glucósido: forsythoside B es un apioside de acteoside, mientras que poliumoside es un ramnósido de acteoside. Por lo tanto, este estudio comparativo también ayuda a comprender los roles de apiosyl y ramnosyl enantioxidanteefectos

cistanche efecto blanqueador sobre la piel a la anti-oxidación

2. Resultados

2.1. Ensayos de reducción de metales (FRAP y CUPRAC)

En el estudio, llevamos a cabo dos ensayos de reducción de metales, es decir, ensayo FRAP y ensayo CUPRAC. Como se ilustra en Supl. 1, el acteósido y sus derivados aumentaron los porcentajes relativos de FRAP (o Cu2 más poder reductor) a 0–10 g/L de forma dependiente de la dosis. Su orden de niveles relativos de reducción de metales disminuyó aproximadamente en el orden de acteoside > forsythoside B > poliumoside (Tabla 1).

Tabla 1. Los valores IC50 de acteoside, forsythoside B y poliumoside en variosantioxidantesensayos

2.2. PTIO·-ensayo de barrido

El ensayo de eliminación de PTIO· fue desarrollado recientemente por nuestro laboratorio [16]. Se puede utilizar para evaluar los niveles de antioxidantes y explorar las vías antioxidantes. Como se muestra en Supl. 1, el acteósido y sus derivados podrían eliminar con éxito el PTIO· a pH 4,5 y pH 7,4. Sin embargo, según los valores de IC50 de la Tabla 1, sus niveles relativos de captación de PTIO· al mismo valor de pH eran diferentes entre sí. Además, cada acteósido y sus derivados exhibieron diferentes niveles de captación de PTIO· entre pH 4,5 y pH 7,4. En general, los niveles de captación de PTIO· a 7,4 fueron superiores a los de pH 4,5.

2.3. Ensayos de eliminación de ABTS plus ·-Scavenging y DPPH·-

ABTS plus ·-scavenging y DPPH·-scavenging ahora se utilizan ampliamente para los estudios antioxidantes de compuestos puros o extractos. Como se ve en Supl. 1, el acteósido y sus derivados aumentaron de forma dependiente de la concentración los porcentajes de eliminación de ABTS más · o DPPH ·.

Sin embargo, en términos de los valores IC50 de la Tabla 1, sus niveles relativos de ABTS más eliminación de β se encontraron en el orden de acteósido > forsytósido B > poliumósido > Trolox. También se pudo observar un orden similar en el ensayo de eliminación de DPPH·.

2.4. UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS Análisis de productos de reacción DPPH·

El producto de reacción de DPPH· con cada uno de los tresfenilpropanoideglucósidosse exploró utilizando el análisis UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. En el análisis (Suplemento 2), ninguno de los tres glicósidos fenilpropanoides produjo el pico del producto RAF. En comparación, se encontró que el ácido cafeico produce un producto dímero (m/z 359–360, suplemento 2).

2.5. Análisis de espectros UV-Vis de Fe2 plus -Productos quelantes

Dado que los espectros UV-vis-pueden caracterizar complejos metálicos, el estudio utilizó espectros UV-vis-para analizar la posible reacción de quelación de Fe2 plus con tresfenilpropanoide glucósidos. Como se muestra en la Figura 2, cada uno de ellos podría producir un cambio batocrómico (335 nm 364 nm) en los espectros UV. Mientras tanto, cada uno de ellos podría proporcionar dos picos de espectros visibles débiles en los espectros visibles (480 nm y 719 nm) y dar lugar a una apariencia verde claro. Sin embargo, la intensidad máxima fue en orden descendente de poliumósido > forsythoside B > acteósido.

2.6. Ensayo de autooxidación de pirogalol para la eliminación del anión superóxido (·O2.)

Nuestro laboratorio mejoró el ensayo de autooxidación de pirogalol en 2012 [17]. Se utilizó para estimar el potencial de captación de ·O2.- en el presente estudio. Como se ve en Supl. 1, todos los acteósidos y sus derivados podrían aumentar de forma dependiente de la dosis los porcentajes de captación de ·O2. Sin embargo, la bioactividad relativa disminuyó en el orden de poliumósido > forsytósido B > acteósido, según los valores de IC50 de la Tabla 1.

2.7. Efecto citoprotector frente a bmMSC estresadas oxidativamente (ensayo MTT)

Para evaluar los efectos citoprotectores del acteósido y sus derivados, realizamos un ensayo MTT. En el ensayo, las bmMSC fueron dañadas por el reactivo oxidante H2O2, las bmMSC dañadas luego fueron tratadas con acteósido y sus derivados. Los valores de A490nm se usaron para evaluar los efectos citoprotectores relativos. Como se ve en la Tabla 2, cada acteósido y sus derivados aumentaron los valores de A490nm de forma dependiente de la dosis. Sin embargo, a la misma concentración, el poliumósido dio los valores más altos de A490nm.

3. Discusión

Se sabe que la acción antioxidante de los compuestos fenólicos naturales está involucrada en la transferencia de electrones (ET) [18,19]. Por lo tanto, algunos ensayos de reducción de metales basados ​​en ET se han utilizado ampliamente para evaluar los niveles de antioxidantes de los compuestos fenólicos, como los ensayos FRAP y CUPRAC. Las pautas de ensayo de FRAP deben cumplirse con un pH inferior a 3,6. Tal ambiente ácido ha suprimido con éxito la ionización de H+ de los compuestos fenólicos; por lo tanto, el ensayo FRAP se considera un mero proceso de ET [20,21]. La efectividad del acteósido y sus derivados en el ensayo FRAP implica que, cuando el acteósido y sus derivados actúan comoantioxidantes, pueden utilizar la vía ET para ejercer su acción antioxidante.

Además, también realizamos un ensayo CUPRAC en un tampón de pH 7,4. Como se ve en Supl. 1, el acteósido y sus derivados aumentaron en función de la dosis sus porcentajes de poder reductor de Cu2+, lo que indica que podrían permanecer con potencial ET a pH fisiológico. Sin embargo, sus potenciales ET disminuyeron en el siguiente orden: acteósido > forsytósido B > poliumósido (Tabla 1). Esta dinámica sugiere claramente que el resto apiosil en forsythoside B y el resto ramnosyl en poliumoside redujeron el potencial de ET.

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Para probar la posibilidad de que ET ocurra durante sus procesos de captación de radicales, se introdujo en el estudio un radical libre centrado en el oxígeno PTIO·. La evidencia de voltamperometría cíclica reveló que la eliminación de PTIO· por debajo de pH 5.0 es una reacción redox de un solo electrón [22]. La observación de que el acteósido y sus derivados podrían eliminar eficientemente el radical PTIO· a pH 4,5 sugiere la posibilidad de ET durante sus procesos de eliminación de radicales. Obviamente, este hallazgo respalda aún más los resultados antes mencionados de los ensayos FRAP y CUPRAC, y los resultados anteriores de que un electrón donador (e) es una característica de los compuestos fenólicos.antioxidantes[23]. Sin embargo, a un pH fisiológico de 7,4, el ensayo de captación de PTIO no es simplemente una vía de ET, sino que también incluye una vía de transferencia de protones (H+). Durante el proceso, se ha sugerido que PTIO acepte H plus de los fenoles para producir el pico del producto ([PTIO-H] plus) [16]. Debido a que la transferencia de H+ siempre va acompañada de ET en mecanismos escalonados o sincrónicos [24], el producto realista (o final) es una molécula de [PTIO-H] [22]. La captación de PTIO· a pH 7,4 (suplemento 1) implica que el acteósido y sus derivados también poseen un potencial de transferencia de H+. Los valores de IC50 (Tabla 1) indicaron que la

los potenciales relativos de transferencia de H+ estaban en orden descendente de acteósido > forsytósido B > poliumósido. Claramente, los restos apiosil y ramnosilo también debilitaron el potencial de transferencia de H+ durante el proceso antioxidante.

Como se mencionó anteriormente, durante el proceso antioxidante de los compuestos fenólicos, la ET suele ir acompañada de la transferencia de protones (H+) para formar varios mecanismos antioxidantes [24], como la transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) [23,25–27], la transferencia secuencial de electrones. -transferencia de protones (SEPT) [26,27], transferencia secuencial de un solo electrón con pérdida de protones (SPLET) [26] y transferencia de electrones acoplados a protones (PCET) [24–26,28].

Por ejemplo, ABTS más ·-barrido, una reacción dominada por la transferencia de un solo electrón (SET) [29], también se ha demostrado recientemente que se ve afectada por los niveles de H+ [30]. ABTS plus ·-scavenging es, por lo tanto, un ensayo antioxidante basado en múltiples vías [21,31]. El hecho de que el acteósido y sus derivados puedan eliminar los radicales ABTS plus · indica que su acción antioxidante también puede estar mediada por vías múltiples. Esta hipótesis se confirma aún más con la evidencia del ensayo de eliminación de DPPH·, una reacción que comprende múltiples vías HAT, ET, SEPT y PCET [26,32]. Sin embargo, el análisis cuantitativo basado en los valores de IC50 (Tabla 1) reveló que en los aspectos de eliminación de ABTS más ·-depuración y DPPH·-basados ​​en múltiples vías, el acteósido fue superior a su apiosido para el sitósido B y el poliumósido de ramnósido. Por lo tanto, se puede deducir que los restos apiosilo y ramnosilo finalmente obstaculizan los potenciales de múltiples vías (especialmente la transferencia de ET y H+) durante el proceso de eliminación de radicales libres. Como señalaron los autores y otros [14,26], durante el proceso antioxidante, también puede ocurrir una reacción RAF. Sin embargo, para verificar la posibilidad de la RAF, tresfenilpropanoideglucósidosjunto con el ácido cafeico se estudiaron mediante análisis UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Se encontró que el ácido cafeico produce un producto dímero, mientras que tresfenilpropanoideglucósidosno produjo ningún pico de producto RAF.

Este hallazgo sugiere claramente que tresfenilpropanoideglucósidosno pueden pasar por la vía RAF para ejercer su acción antioxidante. Dado que tres glucósidos de fenilpropanoide pueden considerarse los ésteres del ácido cafeico (Figura 1), tal diferencia entre el ácido cafeico y los ésteres de ácido cafeico también indica que una fracción enorme puede dificultar la generación de RAF.

En conjunto, desde el punto de vista de la eliminación de radicales libres, el acteósido y sus derivados pueden experimentar múltiples vías para ejercer su acción antioxidante. Estas vías antioxidantes al menos están involucradas en la transferencia de ET y H+ (pero no RAF). Nuestros hallazgos están respaldados en parte por el estudio teórico de que el acteósido podría ejercer la acción antioxidante a través de la vía SPLET. En el proceso, el actósido podría primero desprotonarse (transferencia de H+) para producir un anión. Se cree que la desprotonación ocurre en los restos de catecol con acidez débil. Posteriormente, el anión donó electrones para dar lugar a la forma radical fenoxi [33]. Sin embargo, los radicales fenoxi con conjugación pu son estables hasta cierto punto. Por supuesto, a este respecto, se necesita más trabajo experimental en el futuro.

Cabe mencionar que el estrés oxidativo celular también puede originarse a partir de metales de transición (especialmente Fe2 plus). Sin embargo, el ion Fe2 más puede transformar la molécula de H2O2 en radicales · OH muy dañinos a través de la reacción de Fenton (Fe2 más más H2O2 ● Fe3 más más ·OH más OH.). Por lo tanto, la atenuación de los niveles de Fe2 plus puede inhibir eficazmente los radicales ·OH para liberar el estrés oxidativo celular. De hecho, el quelante de hierro por compuestos fenólicos naturalesantioxidantesahora se ha convertido en una terapia eficaz para algunas enfermedades de estrés oxidativo [34,35].

En el presente estudio, el acteósido y sus derivados se sugirieron como quelantes efectivos de Fe2 plus por los cambios en la espectroscopia y los colores de la solución (Figura 2). Sin embargo, el acteósido es inferior a los dos glucósidos en la quelación de Fe2 plus y el forsytósido B con resto apiosilo es inferior al poliumósido con resto ramnosilo. Con base en la comparación de sus conformaciones preferenciales (Figura 1, derecha), se propone que el resto apiosilo (o ramnosilo) puede ayudar al ligando principal (fenilpropanoidegrupo) en la quelación de Fe2 plus . Tal efecto sinérgico sin duda fortalece la capacidad de quelación de Fe2 plus y aumenta los picos UV-vis. Sin embargo, el ramnosilo es más efectivo que el apiosilo en su capacidad de quelación de Fe2 plus. La diferencia se puede atribuir al hecho de que el ramnosilo se presenta en forma hexocíclica (es decir, /-L-ramnopiranosilo), mientras que el apiosilo se encuentra en forma pentacíclica (es decir, -D-apiofuransilo). Se sabe que una forma hexocíclica es más grande y más estable. Por lo tanto, el ramnosilo hexocíclico es más efectivo en comparación con el apiosilo pentacíclico en su capacidad de quelación de Fe2 plus.

Para probar si el acteósido y sus derivados pueden eliminar ROS, realizamos un ensayo de autooxidación de pirogalol. Como se ve en Supl. 1, todos podrían eliminar eficientemente el ·O2. radical, un ROS típico que ocurre en las células. Sin embargo, la bioactividad relativa disminuyó en el orden poliumósido > forsythoside B > acteósido. Este orden también es paralelo al de los efectos citoprotectores (tabla 2). Este hallazgo indica que el efecto general del resto ramnosilo o del resto apiosilo es mejorar los efectos citoprotectores o de eliminación de ROS.

cistanchetener elfuncióndeblanqueopiel

4. Materiales y Métodos

4.1. Químicos y Animales

Acteoside (número CAS: 61276-17-3, 97 por ciento), forsythoside B (número CAS: 81525-13-5, 97 por ciento) se obtuvieron de BioBioPha (Kunming, China, suplemento 3). Nuestro equipo aisló el poliumósido (número CAS: 94079-81-9, 97 por ciento) de la hierba china tradicional Callicarpa pei HT Chang (suplemento 3). El DPPH·, (o)-6-hidroxilo-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Trolox), 2,9-dimetil{{ 16}},10-fenantrolina (neocuproína), 2,4,6-tripyridyltriazine (TPTZ) y pirogalol se adquirieron de Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Shanghai, China). (NH4)2ABTS [2,2→-azinobis (3-etilbenceno-tiazolina-6-sal de diamonio del ácido sulfónico)] se obtuvo de Amresco Chemical Co. (Solon, OH, EE. UU.). El radical PTIO· se adquirió de TCI Development Co., Ltd. (Shanghai, China). El ácido cafeico se compró al Instituto Nacional para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos (Beijing, China). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal (FBS) y la tripsina se adquirieron de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). El kit de ensayo de anexina V/yoduro de propidio (PI) se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). Todos los demás reactivos eran de grado analítico.

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (SD) de 4 semanas de edad del Centro Animal de la Universidad de Medicina China de Guangzhou. El protocolo de este experimento se realizó bajo la supervisión del Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad China de Guangzhou (Número de aprobación 20170306A).

4.2. Ensayos de reducción de metales (FRAP y CUPRAC)

Los ensayos de reducción de metales incluyen el ensayo de poder reductor de Fe3 plus y el ensayo de poder reductor de Cu2 plus. El ensayo de reducción de Fe3 plus fue establecido por Benzie y Strain y se denomina formalmente FRAP [20]. El protocolo experimental de este ensayo se describió en un informe anterior [9]. Brevemente, el reactivo FRAP se preparó recientemente mezclando TPTZ 10 mM, FeCl3 20 mM y tampón acetato 0,25 M en una proporción de 1:1:10 a pH 3,6. La muestra de prueba (x=4–20 L, 0.05 mg/mL) se agregó a (20 . x) L de etanol al 95 por ciento seguido de 80 L de reactivo FRAP. Después de una incubación de 30-min a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 595 nm utilizando un lector de microplacas (Multiskan FC, Thermo Scientific, Shanghái, China). El poder reductor relativo de la muestra se calculó mediante la siguiente fórmula:

donde Amax fue la absorbancia máxima de la mezcla de reacción con la muestra, y Amin es la absorbancia mínima en la prueba. A es la absorbancia de la muestra.

El poder reductor de Cu2 plus también puede caracterizar el nivel de antioxidantes y, por lo tanto, se denomina CUPRAC. Este ensayo se llevó a cabo de acuerdo con un método publicado previamente [36]. Brevemente, 12 L de solución acuosa de CuSO4 (10 mmol/L), 12 L de solución etanólica de neocuproína (7,5 mmol/L) y (75 . x) L de solución tampón de CH3COONH4 (0). 1 mol/L, pH 7,5) a pozos con diferentes volúmenes de muestra (0,05 mg/mL, 4–20 L). Se midió la absorbancia a 450 nm después de 30 min utilizando el lector de microplacas antes mencionado. La potencia relativa de CUPRAC se calculó utilizando la fórmula para FRAP. Amax fue la máxima absorbancia de la mezcla de reacción con la sample, y Amin es la absorbancia mínima en la prueba. A es la absorbancia de la muestra.

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