Parte 1: Efecto del Acteoside como protector celular para producir un perro clonado

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 División de Ciencias Animales y Lácteas, Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Chungnam, Daejeon, República de Corea,

2 Departamento de Educación en Biología, Facultad de Educación,Universidad Nacional de Chonnam, Gwangju, República de Corea

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com

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Resumen

La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) es una técnica de laboratorio bien conocida. El principio de la SCNT implica la reprogramación de un núcleo somático mediante la inyección de una célula somática en un ovocito receptor cuyo núcleo se ha extraído. Por lo tanto, las células donantes de núcleo se consideran un factor crucial en SCNT. La sincronización del ciclo celular de las células donantes de núcleo en la etapa G0/G1 se puede inducir mediante la inhibición del contacto o la falta de suero. En este estudio,acteósido, un compuesto de glucósido fenilpropanoide, se investigó para determinar si es aplicable para inducir la sincronización del ciclo celular, la citoprotección y mejorar la eficiencia de SCNT en fibroblastos fetales caninos. Se trataron fibroblastos fetales caninos primarios conacteósido(10, 30, 50 μM) durante varios períodos de tiempo (24, 48 y 72 horas). La sincronización del ciclo celular en la etapa G0/G1 no difirió significativamente con el método de inducción:acteósidotratamiento, inhibición por contacto o privación de suero. Sin embargo, de estos tres tratamientos, la privación de suero dio como resultado un nivel significativamente mayor de especies reactivas de oxígeno (ROS) (99,5 ± 0,3 por ciento) y apoptosis. Los resultados también revelaron queacteósidoredujo los procesos de ROS y apoptosis, incluida la necrosis en fibroblastos fetales caninos, y mejoró la supervivencia celular. Fibroblastos fetales caninos tratados conacteósidofueron arrestados con éxito en la etapa G0/G1. Además, los embriones reconstruidos utilizando células de donantes de núcleo tratadas con acteósido produjeron un perro sano clonado, pero no los embriones producidos utilizando células de donantes de núcleo sometidas a inhibición por contacto. En conclusión,acteósidoLa sincronización del ciclo celular inducido de células donantes de núcleo sería un método alternativo para mejorar la eficiencia de SCNT canino debido a sus efectos citoprotectores.

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Introducción

La técnica SCNT se ha utilizado para producir animales genéticamente superiores o manipulados con fines agrícolas y como recursos biomédicos. Con la creciente necesidad de modelos animales de enfermedades, rescate de animales en peligro de extinción, células madre para medicina regenerativa, trasplante de órganos, etc., el interés por clonar animales mediante SCNT ha ido en aumento en los últimos tiempos [1–5]. Aunque la producción de animales clonados ha sido exitosa, la eficiencia de SCNT es aún muy baja [6]. Las causas de la baja competencia de desarrollo del embrión SCNT incluyen muchos factores que están relacionados con la calidad de los ovocitos receptores, la calidad de las células del núcleo del donante y la condición de la madre sustituta [7-10].

Se sabe que las especies reactivas de oxígeno (ROS) y la apoptosis están involucradas en los procesos reproductivos femeninos, incluido el desarrollo de ovocitos in vivo e in vitro [11–14]. Las ROS interrumpen el desarrollo del embrión al inducir la condensación citoplasmática, el daño del ADN y la apoptosis en los embriones. Los estudios de apoyo han informado que la reducción de ROS mejora la competencia de desarrollo embrionario SCNT durante el cultivo in vitro [15-17]. La apoptosis es un proceso fisiológico que ocurre espontáneamente durante el desarrollo embrionario normal previo a la implantación para mantener la homeostasis celular al eliminar las células dañadas o que funcionan mal en el ADN. ROS provoca la fragmentación del ADN y aumenta los blastómeros apoptóticos que alteran el desarrollo del embrión. El evento de ROS y apoptosis se observa con mayor frecuencia después de SCNT que después de la fertilización in vitro [18, 19]. Muchos estudios informaron que la capacidad de desarrollo del embrión SCNT se rescata al reducir los niveles de ROS y la apoptosis mediante el uso de antioxidantes como el selenio [20], la insulina-transferrina-selenio [17, 21], la melatonina [22] y el glutatión [23].

Estudios anteriores informaron que el uso de células de donantes detenidas en la etapa G{{0}}/G1 mejoró la eficiencia de SCNT [7, 9, 24–28]. La cromatina en las células del donante en la etapa G0/G1 se ha considerado la más eficaz para la competencia de desarrollo embrionario SCNT. Para sincronizar el ciclo celular del donante, se han utilizado con frecuencia la inhibición por contacto, la inanición de suero y los tratamientos químicos [7, 25, 29, 30]. Sin embargo, la falta de suero reduce la supervivencia celular y aumenta la fragmentación del ADN, lo que conduce a la apoptosis [31]. La inhibición química es otra estrategia para detener el ciclo celular en la etapa G0/G1 utilizando inhibidores como la roscovitina [29, 32], el dimetilsulfóxido (DMSO) [33] y la cicloheximida (CHX) [34]. La eficacia del método utilizado para la sincronización se ve afectada por los tipos y especies de células donantes. Para una sincronización óptima de las células donantes, es necesario evaluar cuidadosamente varios aspectos de los métodos utilizados.

Acteósido(también conocido como verbascósido) [{{0}}(3, 4-dihidroxifeniletilo)-1-OaL-ramnopiranosil-(1/3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] se aísla de las flores violetas de Syringa vulgaris. Se sabe que las plantas que contienen acteósido tienen actividades antimicrobianas y antifúngicas [35–37] y previenen la inflamación. De hecho, el acteósido exhibe varias actividades biológicas in vitro e in vivo, como actividad antioxidante, actividad antiapoptótica, citotoxicidad contra varias células tumorales y sincronización del ciclo celular en la etapa G0/G1 como ciclina dependiente. inhibidor de la cinasa (CDK) [38]. Por ejemplo Lee et al.[38] informaron que el tratamiento con acteoside puede inhibir la proliferación de células de leucemia promielocítica humana HL-60 al inducir la detención del ciclo celular en la etapa G0/G1. Sin embargo, aún no se ha estudiado el efecto de las células de donantes tratadas con acteoside sobre la eficacia de la SCNT canina.

En este estudio, los efectos deacteósidoen la sincronización del ciclo celular, ROS, yapoptosisen fibroblastos fetales caninos fueron investigados. El análisis de la sincronización del ciclo celular, ROS y apoptosis se realizó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Para demostrar la eficacia de las células del donante tratadas con el acteósido, se cultivaron embriones SCNT y se transfirieron a un perro receptor y se produjo con éxito un perro sano clonado.

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Materiales y métodos

Declaración de Ética

En este estudio, se usaron 44 perras mestizas (de 1 a 6 años de edad) como donantes de ovocitos y sustitutos de transferencia de embriones, y se usó una beagle (de 2 años de edad) para el establecimiento de líneas celulares de fibroblastos fetales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Chungnam (Número de aprobación: CNU-00487) y se realizaron de acuerdo con "La guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" publicada por IACUC de la Universidad Nacional de Chungnam. Los perros se criaron en interiores en jaulas separadas con un sistema de control de temperatura y ventilación. Los perros fueron alimentados con una dieta comercial una vez al día y se les proporcionó agua ad libitum. En todos los experimentos con animales, los perros fueron anestesiados inicialmente con 6 mg/kg de ketamina y xilazina y se mantuvieron en condiciones de anestesia con isoflurano al 2 por ciento. Al final de la cirugía se administraron antibióticos (Penicilina G Procaínica, Penicilina G Benzatínica y Sulfato de Dihidroestreptomicina) para prevenir cualquier infección. Después de la cirugía, los perros fueron trasladados a sus propias jaulas individuales con agua dulce, monitoreados y brindados cuidados especiales por parte del veterinario a cargo, para que pudieran administrar los tratamientos necesarios si los animales lo necesitaban.

quimicos

Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.), a menos que se indique lo contrario. Acteoside se obtuvo de Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. en China.

Aislamiento de fibroblastos fetales caninos

Se obtuvieron fibroblastos fetales caninos de fetos de {{0}}días. Brevemente, una beagle hembra fue inseminada artificialmente con el esperma de un beagle macho. A los 28 días se confirmó la gestación en la hembra beagle y se obtuvieron 5 fetos por celiohisterectomía. Los fetos se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, EE. UU.). La cabeza, los órganos internos y las extremidades de los fetos se extrajeron con un bisturí y las partes restantes del cuerpo se trituraron en PBS. Los fetos se lavaron dos veces mediante centrifugación a 400 × durante 5 min y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco) suplementado con penicilina-estreptomicina al 1 % (producto n.º P4458) y suero bovino fetal al 20 % (FBS; Gibco) a 39 grados en una atmósfera humidificada de 5 por ciento de CO2 y 95 por ciento de aire. Cuando las células alcanzaron la confluencia después de 5 a 7 días, se trataron con tripsina-EDTA al 0,25 por ciento (Gibco) durante 2 minutos y se recolectaron. Se establecieron dos líneas celulares de fibroblastos fetales caninos a partir de dos fetos individuales. Las células se congelaron en DMSO al 10 por ciento en FBS y se almacenaron en nitrógeno líquido a -196 grados hasta que se usaron.

Tratamiento celular

Los fibroblastos caninos congelados se descongelaron y cultivaron hasta un 80 por ciento de confluencia. Las células se recogieron y se pasaron de 4 a 7 veces para experimentos posteriores. Las células se sembraron a una concentración de 106/ml en placas de cultivo de 60 mm. Las células se cultivaron en (1) DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de penicilina-estreptomicina durante cinco días (inhibición por contacto), (2) DMEM suplementado con 0,5 % de FBS y 1 % de penicilina-estreptomicina durante cinco días (privación de suero) , o (3) DMEM suplementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina que contiene acteósido a 10 μM, 30 μM o 50 μM durante 24 h, 48 hy 72 h (tratamiento con acteósido).

Análisis del ciclo celular por citometría de flujo

Para el análisis de las etapas del ciclo celular, las células se recogieron usando {{0}}.25 por ciento de tripsina-EDTA y se lavaron 3 veces con PBS por centrifugación. Después del último lavado, se desecharon los sobrenadantes y las células se resuspendieron en 0,3 ml de PBS. Para la fijación, se añadieron gota a gota {{10}}0,7 ml de etanol absoluto frío a la suspensión de células, se mezcló con un vórtex suave y se almacenó durante la noche a 4 grados. Las células fijadas se centrifugaron y lavaron dos veces con PBS frío. Las células se resuspendieron en 0,25 ml de PBS complementado con 5 μl de 10 mg/ml de RNasa y se incubaron durante 1 hora a 37 grados. Luego, se agregaron 10 μL de yoduro de propidio (PI) 1 mg/mL. El ciclo celular se analizó mediante la cuantificación del contenido de ADN en poblaciones celulares en las fases G0/G1 (2n), S (entre 2n y 4n) y G2/M (4n) utilizando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , EE.UU).

Detección de ROS por citometría de flujo

El ROS en células vivas se evaluó utilizando un kit de detección de especies reactivas de oxígeno Image-iT™ Live Green (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.). Brevemente, las células se lavaron en PBS después de retirar el medio de cultivo y se añadieron 2 ml de la solución de trabajo de hidroperóxido de terc-butilo (TBHP) 100 μM. Después de la incubación a 37 grados durante 1 h, se eliminó la solución de trabajo de TBHP y las células se lavaron suavemente 3 veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco tibia (DPBS; Gibco). Luego, las células se incubaron en una solución de trabajo de diacetato de 7-diclorodihidro-fluoresceína (carboxi-H2DCFDA) de 25 μM 5-(y-6)-carboxi-2, a 37 grados durante 30 minutos en la oscuridad. . Cuando se oxida, el carboxi-H2DCFDA emite fluorescencia verde, lo que facilita la evaluación de ROS mediante citometría de flujo. TBHP, que es un inductor de la producción de ROS, se utilizó como control positivo. Los núcleos de las células se tiñeron con Hoechst 33342. Después de lavar 3 veces con PBS, las células se recolectaron por tripsinización, se suspendieron en PBS y se usaron para detectar ROS usando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE. UU. ). La tasa de formación de ROS se calculó dividiendo el número de células positivas para ROS por el número total de células y convirtiendo los valores en porcentajes.

Análisis de apoptosis por citometría de flujo

El análisis de apoptosis se realizó utilizando un Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.). Brevemente, las células se recogieron por tripsinización y se lavaron 2 veces con PBS frío. A partir de entonces, se agregaron a las células 100 μL de tampón de unión a anexina 1x, 5 μL de anexina V Alexa Fluor 488 y 1 μL de PI. Después de la incubación durante 15 min a temperatura ambiente, se añadieron 400 μL de tampón de unión a anexina 1X y la suspensión celular se mezcló suavemente. La anexina V, que es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de Ca2 plus, tiene una gran afinidad por la fosfatidilserina (PS). En las células vivas, el PS se localiza en la membrana citoplasmática interna y se transloca a la membrana citoplasmática externa en las células apoptóticas. Las células apoptóticas se distinguen por la anexina V marcada con Alexa Fluor 488 que se une a PS en la membrana externa. Además, el PI, que es un colorante que se une al ácido nucleico, tiñe las células necróticas con fluorescencia roja. Por lo tanto, las células apoptóticas con fluorescencia verde, las células necróticas con fluorescencia roja y las células vivas con poca o ninguna fluorescencia en las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, San José, CA, EE. UU.). Las tasas se calcularon dividiendo el número de células vivas, necróticas o apoptóticas por el número total de células y convirtiendo los valores calculados en porcentajes.

Colección de ovocitos madurados in vivo

Para detectar la ovulación en cada perra, se midió la concentración sérica de progesterona (P4) utilizando un kit de radioinmunoensayo de tubo recubierto de progesterona DSL-3900ACTIVE (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, EE. UU.). Como se describió anteriormente [39, 40], el día en que la concentración de P4 superó los 4 ng/mL se consideró como el día de la ovulación. A las 72 h después de la ovulación, los ovocitos se recuperaron por laparotomía utilizando procedimientos quirúrgicos asépticos. Se abordó la fimbria del oviducto a través de la hendidura bursal y se canuló utilizando una aguja de acero con bulbo con reborde invertido (calibre 18, 7,5 cm). Se insertó un catéter intravenoso (IV) de calibre 24 (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seúl, Corea) en el istmo del oviducto cerca de la unión uterotubárica, y medio 199 (Gibco) complementado con penicilina-estreptomicina al 1 por ciento y Se introdujo FBS al 5 por ciento en el oviducto a través del catéter intravenoso. Los ovocitos fueron transportados inmediatamente al laboratorio. Se recogieron un total de 316 ovocitos de 31 perros.

La transferencia nuclear de células somáticas y la transferencia de embriones SCNT se realizaron como se describió anteriormente [39]. Brevemente, para eliminar las células del cúmulo de los ovocitos madurados in vivo, se pipetearon repetidamente complejos de cúmulo-ovocitos (COC) en 0,1 por ciento de hialuronidasa. El primer cuerpo polar y los cromosomas en metafase II se extrajeron por aspiración. La enucleación se confirmó mediante tinción con Hoechst 33342 (bisbenzimida). Se trataron fibroblastos fetales caninos con acteósido 30 μM durante 48 h y luego se recolectaron con 0,25 por ciento de tripsina-EDTA. Se transfirió una sola célula, que tiene una membrana celular lisa, al espacio perivitelino de cada ovocito enucleado. Los pareados eran medio de infusión equilibrado, que es 0medio de manitol 0,26 M que contiene 00,1 mM HEPES, 00,5 mM MgSO4 y 0,05 % de BSA, y se fusionaron mediante dos pulsos de corriente continua (69-75 V durante 15 μs) de un aparato Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japón). Estas parejas se incubaron en medio 199 suplementado con FBS al 10 por ciento durante 1 h 30 min. Los embriones SCNT fusionados se comprobaron y se indujo la activación química incubándolos en ionóforo de calcio 10 μM (producto n.º C7522, Sigma) durante 4 min. Los embriones SCNT se lavaron y luego se colocaron en un medio fluido oviductal sintético modificado (mSOF) [41] que contenía 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) 1,9 mM durante 3 h 30 min. Los embriones modificados se transfirieron quirúrgicamente a los oviductos de madres sustitutas sincronizadas con el estro dentro de las 4 h posteriores a la SCNT. El embarazo se confirmó mediante ultrasonografía a los 26 días (como mínimo) después de la transferencia de embriones.

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Cultivo in vitro de embriones clonados

Después de SCNT, los embriones clonados se cultivaron en microgotas de 40 μL de un medio fluido oviductal sintético modificado (mSOF) (10 embriones clonados por microgota) recubiertos con aceite mineral a 38,5 grados en 5 % de CO2 y 95 % de aire. El desarrollo del embrión SCNT se observó desde el día 2 hasta el día 8.

Análisis de microsatélites y ADN mitocondrial de un perro clonado

El ADN total se extrajo de las células del donante nuclear y de la piel de los perros donantes de ovocitos, los perros sustitutos y el perro clonado mediante el kit de extracción de ADN genómico G-spin™ (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Corea) de acuerdo con las pautas del fabricante. y luego se eluyó en 100 μl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). La cantidad de ADN se midió con el espectrofotómetro BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Japón).

Para el genotipado de microsatélites, se seleccionaron los siguientes 7 genes específicos: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 y FH2079. La PCR se realizó con desnaturalización inicial durante 10 minutos a 95 grados, 20 ciclos compuestos por desnaturalización durante 30 segundos a 95 grados, 30 segundos de hibridación a 58 grados (-0,1 grado/ciclo), 1 minuto de extensión a 72 grados, y 15 ciclos más compuestos por desnaturalización por 30 segundos a 95 grados, 30 segundos de recocido a 56 grados, 1 minuto de extensión a 72 grados y extensión final a 72 grados por 10 minutos.

Para la secuenciación del ADN mitocondrial, utilizando las secuencias de nucleótidos completas del ADNmt canino (número de acceso de GenBank: U96639), se sintetizaron los siguientes cebadores de oligonucleótidos: región del citocromo b (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG,R: AGTTCCGATATAAGGGATGGCAGAG; subunidad II de la citocromo c oxidasa (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; ARNr 16S (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Región de bucle D (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Los ciclos de PCR para este análisis incluyeron: desnaturalización inicial de 95 grados durante 5 minutos, 5 ciclos de desnaturalización de 30 segundos a 95 grados, 40 segundos de hibridación a 60 grados (-1 grados/ciclo), 1 minuto de extensión a 72 grados, y los siguientes 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95 grados, 40 segundos de recocido a 55 grados, 1 minuto de extensión a 72 grados y extensión final a 72 grados durante 10 minutos. Los fragmentos de PCR de los diversos experimentos se analizaron utilizando un analizador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems Inc., EE. UU.). El ensamblaje de secuencias, las alineaciones múltiples y el recorte de alineación para las regiones de control se realizaron con el software BioEdit (v.7.0.5.3).

acteósidoencistanchepuede estimular el sistema inmunológico