Parte 1 Discriminación química y genética de Cistanches Herba basada en UPLC-QTOF/MS y código de barras de ADN
Mar 03, 2022
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Resumen
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), conocido como ''Ginseng del desierto'', tiene un sorprendente efecto curativo sobre la fuerza y la nutrición, especialmente en el refuerzo renal para fortalecer el yang. Sin embargo, los dos orígenes vegetales de Cistanches Herba, Cistanche deserticola y Cistanche tubulosa, varían en términos de acción farmacológica y componentes químicos. Para discriminar el origen vegetal de Cistanches Herba, en este estudio se empleó en primer lugar un sistema de método combinado de química y genética (tecnología UPLC-QTOF/MS y código de barras de ADN). Los resultados indicaron que se obtuvieron tres compuestos marcadores potenciales (un isómero de campneósido II, cistanosido C y cistanosido A) para discriminar los dos orígenes mediante análisis PCA y OPLS-DA. El código de barras de ADN permitió diferenciar dos orígenes con precisión. El árbol NJ mostró que dos orígenes se agruparon en dos clados. Nuestros hallazgos demuestran que los dos orígenes de Cistanches Herba poseen diferentes composiciones químicas y variaciones genéticas. Esta es la primera evaluación informada de dos orígenes de Cistanches Herba, y el hallazgo facilitará el control de calidad y su aplicación clínica.
Introducción
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), conocido como ''Ginseng del desierto'', se origina a partir de tallos suculentos secos deCistanche deserticaYC Ma yCistanche tubulosa(Schrenk) Peluca según la Farmacopea China (edición de 2010), y es popular por tonificar el riñón-yin, beneficiar la esencia vital y relajar el intestino. Corrientemente,Cistanches Herbase distribuye principalmente en los desiertos áridos y cálidos del noroeste de China, particularmente en las provincias de Xinjiang y Mongolia Interior. Sin embargo, los dos orígenes deCistanches Herbadifieren en términos de su actividad farmacológica y componentes químicos. Tu et al. investigó la decocción de tres especies de Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, Salsa Cistanche) y encontró queC. tubulosamostró el efecto más bajo en el modelo de ratón con deficiencia de Yang [1]. Zhang et al. comparó la actividad farmacológica entreC. deserticola, C. tubulosa,yC salsa,y descubrió que estas especies tenían funciones medicinales como antifatiga y tolerancia a la hipoxia, pero no en la misma medida [2]. Investigaciones anteriores informaron el componente químico e indicaron la diferencia del componente químico y el contenido para los orígenes vegetales deCistanches Herba[3]. En cuanto a la aplicación clínica y circulación en el mercado, como tónico,C. tubulosase ha utilizado tradicionalmente como agente promotor de la circulación sanguínea y en el tratamiento de la impotencia, la esterilidad, el lumbago y la debilidad corporal en Japón [4–8]. En consecuencia, es de gran importancia discriminar dos orígenes deCistanches Herbapara control de calidad y aplicación clínica. Sin embargo, no hay investigaciones que se centren en la discriminación de dos orígenes deCistanches Herba. Se han utilizado muchos métodos investigados, incluida la microscopía, la detección ultravioleta e infrarroja, el método de repeticiones de secuencia intersimple para identificar el género deCistanches, pero no solo para dos orígenes especialmente [9–20]. Aquí, utilizamos conjuntamente técnicas químicas y moleculares para distinguir dos orígenes de Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS (cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo) y código de barras de ADN. UPLC-QTOF/MS proporciona información de manera más rápida y eficiente en comparación con otras técnicas. La alta selectividad y sensibilidad de UPLC-QTOF/MS han resultado en su aplicación para análisis tanto cuantitativos como cualitativos, así como en el análisis de metabolitos y la identificación de compuestos complejos en la Medicina Tradicional China [21–22]. El análisis de componentes principales (PCA) y la proyección ortogonal al análisis discriminante de estructura latente (OPLSDA) también se desarrollan para identificar posibles compuestos marcadores. El código de barras de ADN, una tecnología de marcadores moleculares más sencilla y universal, utiliza un fragmento de ADN para identificar especies o géneros. Es objetivo, más preciso y más fácil de realizar que los métodos de identificación tradicionales y otras tecnologías de marcadores moleculares. Además, el código de barras de ADN se ha aplicado con éxito para identificar animales y plantas, incluidas las plantas medicinales [23–26]. El propósito de esta investigación es establecer un sistema de método científico, combinado UPLC-QTOF/MS y código de barras de ADN, para la discriminación de dos orígenes vegetales deCistanches Herba.
Cistanches raíces enteras
Materiales y métodos
Declaración de ética Confirmamos que los estudios de campo no involucraron especies protegidas o en peligro de extinción. Las coordenadas GPS se han incluido en la información de muestra, consulte la tabla 1".
Materiales vegetales y reactivos.
Se recolectaron tallos suculentos de Cistanches Herba de las regiones desérticas salvajes en Mongolia Interior, Provincias de Qinghai, Región Autónoma Uygur de Xinjiang, República Popular de China (Tabla 1) en mayo de 2012. Todas las muestras de la investigación se recolectaron en regiones desérticas salvajes, no en terrenos privados, donde no se requerían permisos específicos. Las identidades botánicas de los tallos fueron confirmadas por el Dr. Linfang Huang. Los especímenes de cupones se depositaron en el Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales. Se utilizaron acetonitrilo de grado de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y ácido fórmico (Tedia, EE. UU.) para el análisis UPLC. El agua desionizada se purificó utilizando un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Todos los demás productos químicos eran de grado analítico.
preparación de la muestra
Las muestras de Cistanches Herba (1,0 g, malla 65-) se transfirieron a un matraz cónico de 50-ml y se añadieron 50 ml de metanol al 70 por ciento. Después de remojar durante 30 min, se realizó ultrasonicación (35 kHz) a temperatura ambiente durante 30 min. Después de la centrifugación a 10,000 rev/min durante 10 min, el sobrenadante se almacenó a 4uC y se filtró a través de una membrana de 0,22-mm antes de inyectarlo en el sistema UPLC-QTOF/MS para su análisis.
UPLC-QTOF/MS
Para el análisis UPLC, se utilizaron los siguientes sistemas/parámetros: sistema Waters Acquity (Waters) equipado con una bomba binaria de suministro de disolvente, un muestreador automático y un detector PDA conectado a una estación de datos Waters Empower 2; ultrasonidos (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, China); y una balanza analítica electrónica modelo AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zurich, Suiza). Se utilizó una columna Waters Acquity UPLC BEH C18 (1,7 mm, 2,16100 mm, Waters) y una precolumna Waters C18 (mismo material, aguas) y se mantuvieron a 30 uC. La fase móvil fue una solución acuosa de ácido fórmico al 0,1 por ciento (A) y acetonitrilo (B) con un programa de gradiente de la siguiente manera: 0 a 3 min, 10 a 22 por ciento de B; 3–4 min, 22–23 por ciento B; 4–6 min, 23–35 por ciento B; 6–8 min, 35–37 por ciento B; 8–11 min, 37–42 por ciento B; 11 a 12 min, 42 a 48 por ciento B; 12–15 min, 48 % –50 % B a un caudal de 0,3 ml/min. El volumen de inyección fue de 5 ml.
El análisis UPLC/MS se realizó en un sistema QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manchester, Reino Unido) equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) operada en el modo de iones negativos. Se usó N2 como gas de desolvatación. La temperatura de desolvatación se fijó en 45{{10}}uC a un caudal de 800 L/h, y la temperatura de la fuente se fijó en 120uC. Los voltajes del capilar y del cono se ajustaron a 2500 y 40 V, respectivamente. Los datos se recolectaron entre 50 y 1200 Da con un tiempo de escaneo de 0.1-s y un retraso entre escaneos de 0.01-s durante un tiempo de análisis de 15-min. Se utilizó argón como gas de colisión a una presión de 7,06661023 Pa. Todos los datos de MS se recopilaron mediante el sistema LockSpray para garantizar la precisión y la reproducibilidad de la masa. El ion [MH]- de leucina-encefalina am/z 554,2615 se usó como masa de bloqueo en el modo ESI negativo.
Análisis de los datos
Se analizaron los datos de UPLC-QTOF/MS para muestras de Cistanches Herba para identificar posibles variables discriminantes. La búsqueda de picos, la alineación y el filtrado de datos sin procesar de ES se llevaron a cabo utilizando el administrador de aplicaciones Marker Lynx, versión 4.1 (Waters, Manchester, Reino Unido). Los parámetros utilizados fueron los siguientes: tiempo de retención (tR) de 0–15 min, masa de 50–1200 Da, tolerancia de tiempo de retención de 0,02 min y tolerancia de masa de 0,02 Da. Se utilizaron tres muestras repetidas recolectadas de cada ubicación geográfica (n=3). Se utilizaron un total de 6.339 variables para crear el modelo.
Código de barras de ADN: extracción de ADN, amplificación por PCR y secuenciación
Muestras tomadas de tallos carnosos secos de C. deserticola y C. tubulosa (30 mg) se frotaron durante 2 minutos a una frecuencia de 30 r/s. El ADN se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tiangen). Específicamente, se modificó el protocolo de manera que se reemplazó el cloroformo por una mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1 en el mismo volumen) y solución tampón GP2 con isopropanol (mismo volumen). El polvo frotado se puso en tubos eppendorf de 1,5 ml, se añadieron 700 ml de GP1 precalentado a 65 ºC y 1 ml de b-mercaptoetanol para mezclar con vortex durante 10–20 s, y se incubó durante 60 minutos a 65 ºC; Agregar 700 mL de mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), centrifugar por 5 minutos a 12000 rpm(,134006g); Pipetee el sobrenadante en un tubo nuevo, agregue 700 ml de isopropanol y mezcle durante 15 a 20 minutos; Canalizar toda la mezcla a la columna de centrifugación CB3 y centrifugar durante 40 s a 12000 rpm; Desechar el filtrado y agregar 500 mL de GD (agregar etanol anhidro cuantitativo antes de usar), centrifugar a 12000 rpm por 40 s; descartando el filtrado y agregando 700 mL PW (agregando etanol anhidro cuantitativo antes de usar) para lavar la membrana, centrifugar por 40 s a 12000 rpm; Desechar el filtrado y agregar 500 mL PW, centrifugar por 40 s a 12000 rpm; Desechar el filtrado y centrifugar durante 2 minutos a 12000 rpm para eliminar el tampón de lavado residual PW; Transferir la columna de centrifugación CB3 a un tubo eppendorf limpio de 1,5 ml y secar a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos; Centrifugar durante 2 minutos a 12000 rpm para obtener el ADN total. Los cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se basaron en las secuencias informadas anteriormente [4,5]. Las mezclas de reacción de PCR contenían 2-mL de plantilla de ADN, 8.5- mL de ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., China), 1/{{57 }}mL de cebadores directo/inverso (F/R) (2,5 mM), en un volumen final de 25 mL. La amplificación por PCR se realizó según lo descrito por Kress et al. [4]. Los cebadores de la reacción de PCR fueron fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) y rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). Los productos de PCR se separaron y detectaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 por ciento. Los productos de PCR se purificaron siguiendo el protocolo del fabricante y se sometieron directamente a la secuenciación.
El principal compuesto efectivo de la cistanche: Acteoside
Resultados
Asignación tentativa de picos por UPLC-QTOF/MS En la Figura 1 se muestran cromatogramas representativos de C. deserticola y C. tubulosa de diferentes áreas productoras. El cromatograma de huella dactilar indicó similitudes entre las muestras de Cistanches Herba. Se detectaron un total de 23 picos de masa calificados y se identificaron 16 picos haciendo coincidir los tiempos de retención y los espectros de masas con los informados anteriormente (Tabla 2) [29–35]. Los picos 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 y 23 se identificaron tentativamente como cistanósido F, mussaenosido ácido, cistanbulósido C1/C2, campneósido II , isómero de campneósido II, echinacósido, cistanósido A, acteósido, isoactósido, siringalida A-39-aL-ramnopiranósido, cistanósido C, 29-acetilacteosido, osmanthusido B, cistanósido D, tubulosido B y cistancinenside A, respectivamente . Se determinó que los constituyentes químicos eran principalmente glucósidos de feniletanoide (PhG), mientras que un compuesto, el ácido de mussaenosido, era un polisacárido iridoide. Los PhG son los principales compuestos activos en términos de tratamiento de la deficiencia renal y efectos antioxidantes y neuroprotectores [36]
PCA de C. deserticola y C. tubulosa
PCA se empleó para distinguir muestras de diferentes especies de plantas. PCA es un método de análisis de datos multivariante no supervisado que tiene como objetivo visualizar las similitudes y/o diferencias dentro de los datos multivariados de la composición de metabolitos secundarios [37]. El modelo PCA de dos componentes representó acumulativamente el 46,04 por ciento de la variación (PC1, 36,43 por ciento; PC2, 9,61 por ciento). La Figura 2 muestra que 24 muestras se agruparon en dos grupos en las puntuaciones de PCA trazadas según el origen de la especie, lo que indica que la composición química de C. deserticola y C. tubulosa difería significativamente.
El principal compuesto eficaz de la cistanche: Echinacoside
