Parte 2 Discriminación química y genética de Cistanches herba basada en UPLC-QTOF/MS y códigos de barras de ADN

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OPLS-DA e identificación de marcadores Para identificar posibles marcadores químicos de discriminación de las dos especies, se generó el diagrama S de OPLS-DA (Fig. 3). En el gráfico S, cada punto representa un par de iones tR-m/z. Los ejes X e Y representan la contribución y la confianza del ion, respectivamente; cuanto más lejos esté la distancia que el par de iones tR-m/z apunte desde cero, mayor será la contribución/confianza de este icono a la diferencia entre los dos grupos. Así, el ion tR-m/z que apunta a los dos extremos de la 'S' representa los marcadores característicos con mayor confianza en cada grupo. Los resultados de OPLS-DA mostraron que UPLC-QTOF/MS podría usarse para distinguirCistanche deserticolaDeCistanche tubulosa(Fig. 3). Se determinaron un total de seis marcadores creíbles y significativos para facilitar la discriminación de estos grupos (Tabla 3). Las identidades de tres marcadores potenciales fueron asignadas tentativamente. Los componentes correlacionados con estos tres iones se identificaron tentativamente como isómeros de campneoside II, cistanoside C y cistanoside A. Los compuestos marcadores a, b y c podrían usarse para distinguir las dos especies de plantas, como las intensidades de iones de a y b enCistanche deserticolafue mayor que enCistanche tubulosa(Fig. 4A, 4B), y el marcador c se pudo detectar enCistanche tubulosa, pero no enCistanche deserticola(Fig. 4C).

Código de barras de ADN: información de secuencia y eficiencia de identificación

La información de secuencia se mostró en la Tabla 4. La distancia genética promedio de psbA-trnH (0.1732) fue mayor que las otras dos regiones (0.0740, 0.1197) significativamente. El contenido promedio de GC de psbA-trnH (20,64%) fue menor que el de las otras dos regiones (55,00%, 55,00%). Aunque la tasa de éxito de ITS e ITS2 no se obtuvo en este estudio, la región psbA-trnH tuvo un buen desempeño en la amplificación y secuenciación de PCR (100%, 87.23%). La eficiencia de identificación se logró mediante el análisis BLAST1 y el método de distancia más cercana, y reflejó principalmente la tasa de éxito de los códigos de barras. La región psbA-trnH fue claramente más alta que los otros dos códigos de barras en la eficiencia de identificación basada en dos métodos. La escasez de secuencias es probablemente la razón por la que la región ITS exhibió una eficiencia de identificación del 100% basada en el método BLAST1, y 0 basada en el método de distancia más cercana.

Análisis de la divergencia genética utilizando seis parámetros

Se utilizaron seis parámetros para analizar la variación intraespecífica y la divergencia interespecífica utilizando tres códigos de barras (Tabla 5). La diferencia significativa entre las variaciones inter e intraespecíficas fue indicativa de la utilidad de los códigos de barras de ADN. Aquí, la distancia interespecífica mínima de tres códigos de barras fue mayor que la distancia intraespecífica máxima. Además, la región psbA-trnH tenía una distancia intraespecífica máxima y una distancia interespecífica promedio más grandes que los otros dos códigos de barras, lo que indica que la región psbA-trnH funcionó bien en la discriminación de dos orígenes de Cistanches Herba.

Análisis de la brecha de códigos de barras para identificar

Cistanche deserticolayCistanche tubulosaLa brecha de códigos de barras presenta la notable variación de inter e intraespecies y demuestra distribuciones separadas y no superpuestas entre muestras intra e interespecíficas. En este estudio (Fig. 5), el rango de distancia se estableció en 0–0.45, debido a la mayor distancia K2P de psbA-trnH entreCistanche deserticolayCistanche tubulosaestuvo cerca de 0,45. Los tres códigos de barras mostraron brechas distintas en las distribuciones de la variación intra e interespecífica. Además, la brecha de psbA-trnH fue significativamente mayor que los otros dos códigos de barras. Por lo tanto, la región psbA-trnH podría ser un código de barras ideal para discriminar dos orígenes deCistanchesHerba.

Árbol de unión de vecinos (NJ)

Un árbol NJ ilustra la relación entre las especies y facilita la determinación de su agrupamiento. En este estudio, el árbol NJ de tres códigos de barras se construyó en base al modelo K2P (Fig. 6). Los resultados demostraron que dos orígenes de Cistanches Herba se agruparon en dos clados por separado. Por lo tanto, el árbol nj distingue claramente entreCistanche deserticolayCistanche tubulosa.

Discusión y conclusiones

Cistanches Herba es un importante material medicinal comúnmente utilizado para nutrir a la comunidad asiática [38]. Sin embargo, los dos orígenes deCistanchesHerba,Cistanche deserticolayCistanche tubulosa, tienen diferentes composiciones químicas y actividades farmacológicas respectivamente. Al mismo tiempo, los dos orígenes difieren en la aplicación clínica y el mercado de productos básicos. La clasificación de Cistanche es confusa y los sustitutos masivos y adulterantes inundan el mercado debido a la escasez de recursos y el entorno de cultivo especial para Cistanches Herba. Se acepta que el género Cistanche incluye cuatro especies y una variante:Cistanche deserticola,Cistanche tubulosa,Cistanche sinensis,Cistanche salsayCistanchesalsavar. albiflora [39]. Investigadores en Japón consideraron el origen deCistanchesHerba comoCistanche salsa[40–43], mientras que fue identificado comoCistanche deserticolapor Tu [44–46]. Por lo tanto, se confunde en la clasificación de Cistanche, y es difícil discriminar los dos orígenes de Cistanches Herba. Los métodos tradicionales para el control de calidad de Cistanches Herba son la identificación morfológica [47,48], la identificación microscópica [49] y TLC (Cromatografía de Capa Delgada) [50,51], FTIR (Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier) [14], HPLC (Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento) [52,53]. El método morfológico y microscópico puede diferenciar fácilmente especies de diferentes géneros o familias que poseen grandes diferencias en las características morfológicas y microscópicas, mientras que es difícil distinguir especies hermanas. TLC y FTIR pueden discriminar claramente especies que poseen diferentes tipos de composiciones químicas, mientras que es difícil determinar el componente químico y el contenido. El HPLC se utiliza principalmente para diferenciar especies con diferentes contenidos de elementos químicos, sin embargo, el tiempo de análisis es más largo y la sensibilidad es relativamente menor en comparación con el UPLC. En consecuencia, la tecnología UPLC-QTOF/MS fue más rápida y precisa en la determinación de la composición química que otros métodos químicos. Los métodos de identificación molecular se exhiben bien en la discriminación basada en la variación genética, como SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55,56]. Sin embargo, estos métodos moleculares no son fáciles de operar y no son universales. En consecuencia, el código de barras de ADN podría discriminar especies de manera más universal, rápida y precisa que otros métodos moleculares. Para las especies del mismo género y una estrecha relación genética, esos métodos por sí solos pueden no funcionar bien en la identificación.

Aquí, combinamos UPLC-QTOF / MS y códigos de barras de ADN para identificarCistanche deserticolayCistanche tubulosay evaluó los marcadores químicos y moleculares que permitirían discriminarlos. Se detectaron 23 picos de masa calificados y 16 se identificaron mediante el uso de UPLC-QTOF / MS, y en primer lugar se encontraron tres compuestos marcadores potenciales para facilitar la discriminación de dos orígenes mediante el análisis PCA y OPLS-DA. Además, la tecnología de códigos de barras de ADN evaluó cuatro indicadores en términos de su capacidad para diferenciar dos orígenes: eficiencia de identificación, eficiencia genética, brecha de códigos de barras y análisis de árboles NJ. La región psbA-trnH fue apoyada como un código de barras de ADN adecuado para discriminarCistanche deserticolayCistanche tubulosa. En conclusión, primero establecimos un nuevo método combinado de análisis molecular y químico para la discriminación y el control de calidad en dos orígenes de Cistanches Herba. El código de barras de ADN puede discriminar dos orígenes en la variación genética y autenticar especies de manera universal y precisa; La tecnología UPLC-QTOF/MS puede analizar la composición química para evaluar la calidad de los materiales medicinales de forma rápida y precisa. El método combinado de código de barras de ADN y la tecnología UPLC-QTOF/MS garantizan la identificación en múltiples fuentes de materiales medicinales de manera más precisa y científica y pueden servir como método para identificar otras especies o géneros confusos en la clasificación.

Contribuciones de los autores

Concibió y diseñó los experimentos: LFH SHZ LBW. Realizó los experimentos: SHZ LBW. Analizados los datos: SHZ LBW. Reactivos/materiales/herramientas de análisis aportados: LFH. Escribió el artículo: SHZ XJ LBW. Revisa el manuscrito: ZHW.

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