PARTE 1 El extracto de Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight mejora el rendimiento de las extremidades posteriores y atenúa la expresión de la cadena pesada de miosina IId/IIx en ratones inmovilizados con yeso

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1División de Ciencias Neuromédicas, Instituto de Medicina Natural, Universidad de Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japón 2Departamento de Medicina Oriental Japonesa, Facultad de Medicina y Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Toyama, 2630 Sugitani, Toyama {{5 }}, Japón

La correspondencia debe dirigirse a Chihiro Tohda; chihiro@inm.u-toyama.ac.jp

Recibido el 14 de junio de 2019; Revisado el 13 de septiembre de 2019; Aceptado el 17 de septiembre de 2019; Publicado el 22 de octubre de 2019

Editor académico: Wen-yi Kang

Copyright © 2019 Yoshiyuki Kimbara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución Creative Commons, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite correctamente el trabajo original.

La atrofia del músculo esquelético se encuentra en muchas condiciones clínicas, pero aún no se ha establecido un tratamiento farmacológico.Cistanche tubulosa(Schenk) Wight es un medicamento a base de hierbas utilizado en la medicina tradicional japonesa y china. En el estudio actual, investigamos el efecto deExtracto de C. tubulosa(CTE) en músculo atrofiado in vivo. También investigamos la inmovilización con yeso de las patas traseras en ratones e ideamos un nuevo tipo de yeso para inmovilizar las patas traseras, que consiste en una cinta similar a una esponja y un tubo de plástico delgado. Usando este método, 3 de 4 grupos de ratones (n 11 para cada grupo) se inmovilizaron con yeso en las patas traseras y se les administró CTE o vehículo durante 13 días. Se realizó un procedimiento simulado en los ratones del cuarto grupo a los que se administró el vehículo. A continuación, se extirparon los músculos tríceps sural (TS). Para analizar el efecto del nuevo sistema de yeso y la administración de CTE sobre la atrofia muscular, evaluamos el peso húmedo de TS y el área transversal de miofibras (CSA). También determinamos los niveles de expresión de MyHC IId/IIx mediante transferencia Western, ya que su aumento es un sello distintivo de la atrofia muscular por desuso, lo que sugiere un cambio de tipo de miofibras de lento a rápido. Además, realizamos dos pruebas de rendimiento de las patas traseras. El nuevo método de inmovilización con yeso redujo significativamente el peso húmedo de TS y la CSA de miofibras. Esto estuvo acompañado por el deterioro de la función de las patas traseras y un aumento en la expresión de MyHC IId/IIx. La administración de CTE no alteró el peso húmedo de TS ni la CSA de miofibras; sin embargo, mostró una tendencia de mejora de la pérdida de la función de las patas traseras y de supresión del aumento de la expresión de MyHC IId/IIx en ratones inmovilizados con yeso. Nuestro novedoso método de inmovilización con yeso de las patas traseras indujo con eficacia la atrofia muscular. La CTE no afectó la masa muscular, pero suprimió el cambio de tipo de miofibra lenta a rápida en ratones inmovilizados con yeso, lo que mejoró el deterioro de la función de las patas traseras.

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1. Introducción

Las condiciones fisiopatológicas asociadas con la atrofia del músculo esquelético incluyen sarcopenia [1], caquexia [2] y atrofia del músculo esquelético inducida por glucocorticoides [3]. La atrofia del músculo esquelético también es causada por el desuso prolongado [4], que puede deberse al reposo en cama [5], la aplicación de yesos para el tratamiento de fracturas o lesiones de ligamentos [6] o vuelos espaciales [7]. Dado que varias enfermedades pueden causar esta condición, afecta a un gran porcentaje de la población.

El ejercicio adecuado y las terapias nutricionales son esenciales para tratar la atrofia muscular [8]. Además, algunos estudios han informado que las contramedidas farmacológicas, incluidos los moduladores selectivos de los receptores de andrógenos, los anticuerpos monoclonales humanos contra la miostatina y los agonistas selectivos de los receptores de grelina, son eficaces [9]; sin embargo, estos enfoques aún no están establecidos.

Las condiciones de atrofia muscular descritas anteriormente se acompañan de un cambio en el perfil del tipo de miofibras y una reducción de la masa muscular. El desuso muscular causado por la pérdida de la influencia neural y la descarga mecánica induce un cambio de tipo de miofibra de lento a rápido y un cambio en el perfil de isoforma de la cadena pesada de miosina (MyHC) [10], señalado por el incremento de los niveles de expresión de MyHC IId/IIx [11, 12]. En cambio, la administración de glucocorticoides, la caquexia, la sepsis y otros factores inducen un cambio de tipo de miofibra de rápido a lento [10].

Cistanchees un medicamento a base de hierbas procedente deCistanche deserticaYC Ma,C. tubulosa(Schenk) Wight, o C. salsa (CA Mey) Beck, según la farmacopea japonesa [13]. En la medicina tradicional japonesa (Kampo) y china, se utiliza para tratar el "síndrome de insuficiencia renal", caracterizado por infertilidad, debilidad muscular sistémica (especialmente en la espalda y las extremidades inferiores) y debilidad ósea [14, 15]. Se sabe que contiene varios componentes, incluidos el acteósido, el equinacósido y el isoactósido [16]. El extracto de esta hierba, o sus componentes químicos, ha mostrado efectos cardioprotectores, hepatoprotectores y neuroprotectores; efectos antienvejecimiento, antifatiga, vasodilatadores y afrodisíacos; actividad antioxidante y antiinflamatoria; y la capacidad de mejorar la memoria y el aprendizaje [15, 16]. Sin embargo, no se ha confirmado la eficacia de esta hierba para prevenir o tratar enfermedades de desgaste muscular. Por lo tanto, en el presente estudio, investigamos los efectos deC. tubulosa(CTE) como tratamiento para la atrofia muscular.

Con este fin, utilizamos la inmovilización con yeso de las patas traseras para inducir la atrofia muscular en ratones, centrándonos, en particular, en los materiales utilizados en el yeso. Se ha informado sobre una variedad de sistemas de yeso, incluidos yeso de París [17], yesos de fibra de vidrio [18], tubos de microcentrífuga de polipropileno [19], dispositivos similares a trajes de inmovilización hechos de malla de algodón y acero [20], pipetas de plástico con relleno de esponja [21], yesos hechos de cinta de vendaje no elástica y alambre de acero recubierto de vinilo [22], inserción de alambre combinada con placas de metal [23] y el uso de una grapadora quirúrgica de piel [24]. Un yeso ideal debe ser mínimamente invasivo y no traumático para evitar cambios inflamatorios porque la inflamación puede inducir atrofia muscular [25]. Además, las pruebas de desempeño de las patas traseras con el yeso deberían ser posibles en las etapas finales del experimento. Además, el yeso debe ser fácil de manejar sin conocimientos ni habilidades especiales; debe ser liviano, económico, fácil de comprar y no debe requerir dispositivos especiales para su aplicación y remoción.

Se han informado diferentes modelos animales de pérdida de masa muscular. La descarga de las patas traseras se ha utilizado con frecuencia [11, 12] pero tiene varios problemas, incluida la necrosis de la cola, que puede inducir inflamación sistémica [25]; desviación de los fluidos corporales hacia el lado caudal, lo que produce anomalías en los vasos sanguíneos de las patas traseras [26]; microgravedad extraordinaria en las patas traseras, que puede afectar fuertemente la expresión de proteínas, incluida la de las enzimas mitocondriales [27]. Todos estos factores pueden influir en el curso de la atrofia muscular. Un método diferente induce la atrofia muscular al privar al músculo de entradas neuronales (por ejemplo, a través de la sección del nervio ciático) [28]; dado que los músculos están sujetos a factores tróficos de las neuronas terminales [29], este método, que conduce a un estado inusual de denervación casi total, puede alterar el proceso de atrofia muscular. Los animales que están sujetos a perturbaciones sistémicas que provocan atrofia muscular, como diabetes mellitus [30], insuficiencia renal [31], administración de corticosteroides [32] y envejecimiento o senescencia acelerada [33, 34], pueden utilizarse como modelos de humanos. enfermedades; sin embargo, estas condiciones sistémicas también pueden interferir con el proceso de atrofia muscular.

Por lo tanto, seleccionamos la inmovilización con yeso de las patas traseras para inducir la atrofia muscular y buscamos crear un método novedoso para realizarlo en ratones, mediante el cual investigamos los efectos de la CTE en la atrofia muscular.

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2. Materiales y métodos

2.1. Material Vegetal y Extracción.

CTE se adquirió de Alps Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Hida, Gifu, Japón).

Se recolectaron tallos carnosos de C. tubulosa de Shinjang Uyghur Aptonom Rayon, República Popular de China. Se sumergió un total de 193 kg de polvos mixtos de C. tubulosa en 1.883 l de etanol al 30 por ciento. La mezcla se sometió a reflujo durante 2 h a 55-64 grados. El rendimiento del extracto fue del 7,2 por ciento y contenía un 3,36 por ciento de acteósido y un 12,72 por ciento de equinacósido.

2.2. Ratones.

Se alojaron ratones macho adultos ddY (12 semanas de edad) (Japan SLC, Shizuoka, Japón) por separado en jaulas de plástico y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12-h en un vivero con temperatura regulada (25 ± 2 grados). A todos los animales se les permitió acceso ad libitum a agua y comida (stock Labo MR; Nosan Corporation, Yokohama, Kanagawa, Japón).

Todos los experimentos y protocolos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio del campus de Sugitani de la Universidad de Toyama. El número de aprobación para los experimentos con animales es A2016INM-3. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados.

2.3. Inducción de atrofia muscular de miembros posteriores y administración de CTE.

Los ratones se dividieron en 4 grupos (n 11 por grupo): en el día 2, todos los ratones fueron anestesiados y se les eliminó el vello desde el muslo hasta el tobillo con una crema depilatoria (crema Epilat; Kracie, Tokio, Japón). A continuación, 3 de los 4 grupos de yeso (más) se inmovilizaron con yeso de acuerdo con el siguiente procedimiento, como se muestra en las Figuras 1(a)–1(g):

Paso 1. Corte una cinta selladora de espuma de caucho EPDM (Cemedine Corporation, Tokio, Japón) en una tira de 12 8 25 mm (Figura 1(a)).

Paso 2. Sostenga una pata trasera en la posición plantar del tobillo y envuélvala muy suavemente en la articulación del tobillo con una cinta de sellado (Figura 1 (b)).

Paso 3. Corte una tapa de aislamiento de PVC blando TIC-22 (Nichifu Corporation, Osaka, Japón) y cubra el manguito de cinta de sellado. Utilice cinta adhesiva de doble cara (PRO SELF cinta de doble cara cortada a mano J-1300; Nitoms Inc., Tokio, Japón) para que se adhieran (Figura 1(c)).

Paso 4. Reúna los extremos cortados de la tapa; corte la cinta adhesiva resistente al agua de alto rendimiento (power tape; Asahipen Corporation, Osaka, Japón) a aprox. 4 48 mm y fije los extremos fruncidos (Figura 1(d)).

Paso 5. Coloque un trozo pequeño (aprox. 5 30 mm) de cinta de papel de aluminio (AL-30; Nichiban Corporation, Tokio, Japón) en la parte frontal del extremo superior de la tapa (Figura 1 (mi)).

Paso 6. Corte la cinta de plástico (cinta de aislamiento eléctrico de vinilo n.° 21; Nitto Denko Corporation, Osaka, Japón) a aprox. 19 × 40 mm y envuelva la tapa (Figura 1(f )).

Paso 7. Realice el mismo procedimiento en la pata trasera contralateral (Figura 1(g)).

El período de inmovilización utilizado en el presente estudio fue de 13 días, y los yesos se reemplazaron si ocurría una o más de las siguientes condiciones: edema grave del pie, necrosis de las patas traseras, ulceraciones cutáneas graves, aflojamiento del yeso debido a la destrucción o dislocación del yeso del tobillo. En el grupo restante, solo se realizó depilación (procedimiento simulado) y se administró vehículo (solución salina fisiológica) durante 13 días a partir del día siguiente a la depilación (día 2). Entre los 3 grupos yesos (más), a 2 se les administró CTE (50 y 100 mg/kg/día; grupo yeso (más)/CTE-50 y grupo yeso (más)/CTE-100), ya uno se le administró vehículo (molde (más)/grupo vehículo), también desde el día 2. La CTE se disolvió en solución salina fisiológica y se administró diariamente por sonda oral durante 13 días.

2.4. Evaluación de la función de las extremidades posteriores y la fuerza muscular de las extremidades posteriores.

El día 14, los ratones del grupo yeso (plus) se anestesiaron de nuevo después de la administración de CTE y se retiraron los yesos. Al día siguiente (día 15), se evaluó la función de las patas traseras y la fuerza muscular de todos los ratones mediante las siguientes dos pruebas:

2.4.1. Medición de la Velocidad de la Marcha.

Una plataforma de madera cuadrada de 15 mm de ancho se mantuvo horizontalmente a aproximadamente 50 cm del suelo. Luego se colocó el ratón en la plataforma y se evaluó la velocidad de la marcha a medida que el animal atravesaba la plataforma registrando manualmente con un cronómetro el tiempo para caminar una distancia de 50 cm. De antemano, cada ratón se habituó a la plataforma atravesándola dos veces como sesión de entrenamiento.

2.4.2. Prueba de fallo de pie.

Para evaluar la fuerza de los músculos de las patas traseras, realizamos la "prueba de falla del pie", en la que cada ratón se colocó nuevamente en la plataforma y se tabuló el número de deslizamientos de las patas traseras de la plataforma. Esta prueba es una versión modificada de la prueba de varillas estáticas, en la que las varillas aéreas se fijan con una abrazadera en G y se hace que los ratones las atraviesen [35]. La prueba de fallas en los pies se realizó tres veces y se registró el número medio de pisadas en las tres sesiones. Hubo un intervalo de descanso de al menos 15 minutos entre sesiones.

2.5. Análisis histológicos y morfométricos del músculo tríceps sural.

Después de la evaluación de la función de las patas traseras, los ratones fueron profundamente anestesiados y sacrificados mediante perfusión salina fisiológica. A continuación, se extirparon los músculos tríceps sural (TS) de ambos lados de las patas traseras; las muestras de la pata trasera izquierda se fijaron en paraformaldehído al 4 % en solución de PBS durante 24 h, luego se transfirieron a una solución de sacarosa al 30 % en PBS y se incubaron para la crioprotección y el corte criogénico. Después de esto, se cortaron secciones de 12-μm de espesor a lo largo del eje menor de la región del vientre medio de cada músculo utilizando un criostato (Leica 3050S; Leica Systems, Nußloch, Alemania). Se montaron de siete a diez secciones secuenciales en portaobjetos de vidrio recubiertos con antistrips (MAS-GP Tipo A, Matsunami Glass Industry, Osaka, Japón), se secaron inmediatamente con un secador de pelo, se almacenaron a 30 grados y se tiñeron con hematoxilina-eosina (tinción HE). , ScyTek Laboratories, Logan, Utah, Estados Unidos). Se seleccionó una sección representativa por animal, en la que el corte del eje corto de cada miofibra era claramente visible, y se midió su área de sección transversal (CSA) utilizando la Imagen J (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, Estados Unidos) .

2.6. Transferencia occidental.

La proteína total del TS derecho se extrajo mediante el siguiente método. El TS correcto se trituró con tijeras y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido, se almacenó a 30 grados y luego se homogeneizó para hacer un lisado de tejido. Los músculos descongelados se incubaron en frío durante 30 min en 2 ml de solución de extracto de proteína de mamífero M-PER (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, EE. UU.) y luego se homogeneizaron. A continuación, los homogeneizados se centrifugaron a 4 grados y 4000 g durante 10 min y se recogieron los sobrenadantes.

Se cargó 10 ug de proteína total en cada lisado muscular y se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), seguido de electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa (0.2 μm, # 1620112, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, Estados Unidos). La unión no específica se bloqueó con leche descremada en polvo al 5 % (leche descremada en polvo, 190-12865, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 al 0,05 % (TBS-T). A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4 grados con un anticuerpo primario disuelto en solución potenciadora de inmunorreacción Can Get Signal 1 (Toyobo, Osaka, Japón). Después de agitar y enjuagar con TBS-T, las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP-) diluido en solución potenciadora de inmunorreacción Can Get Signal 2 (Toyobo, Osaka, Japón). Las señales en las membranas se detectaron mediante electroquimioluminiscencia usando luminol. Luego se realizó el análisis densitométrico utilizando el software CS Analyzer (Atto, Tokio, Japón). Los anticuerpos se eligieron y diluyeron de la siguiente manera: anticuerpo monoclonal anti-MyHC IId/IIx de ratón (1 : 1000, clon A4.1025, #05-716, Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, Estados Unidos), anticuerpo anti-GAPDH de ratón anticuerpo monoclonal de control de carga (1: 3500, G041 ABM, Vancouver, Canadá), y anticuerpo secundario policlonal H&L de cabra anti-ratón IgG conjugado con HRP (1: 2000, Abcam, Cambridge, Reino Unido).

2.7. Análisis estadístico.

Todos los resultados se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). La significación estadística de las comparaciones entre grupos se verificó mediante ANOVA unidireccional y pruebas post hoc de Dunnett o prueba HSD de Tukey; la prueba de Kruskal-Wallis y las pruebas post hoc de Dunn; o ANOVA de dos vías con medidas repetidas y prueba de Dunnett post hoc. Se utilizó la prueba de Smirnov-Grubb para excluir valores atípicos. Para todas las evaluaciones estadísticas, los valores de p inferiores a 0.05 se consideraron estadísticamente significativos y todos los análisis se realizaron con GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, California, Estados Unidos).

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3. Resultados

3.1. Salud Animal y Efecto del CTE en el Peso Corporal.

En apariencia visual, las patas traseras de los ratones inmovilizados con yeso estaban todas atróficas, en comparación con las de los ratones del grupo de yeso ( )/vehículo. La inmovilización con yeso resultó en pérdidas significativas de peso corporal al final de la fase de estudio. Por el contrario, los cambios de peso corporal no fueron significativos en los ratones del grupo cast ( )/vehículo. Los dos grupos (más)/CTE no exhibieron cambios significativos en el peso corporal en comparación con el grupo (más)/vehículo (Figura 2).

No se observaron complicaciones graves en las patas traseras de los ratones inmovilizados, como necrosis de la piel o gangrena, ni comportamiento anormal en el bioterio. Sin embargo, en todos los ratones inmovilizados con yeso se observaron complicaciones leves, como edema del pie, ulceraciones superficiales de la piel y rubor de las patas traseras (Figura 1(h)). En la mayoría de los casos, también se observó aflojamiento y dislocación del yeso, lo que llevó al reemplazo del yeso.

3.2. Efecto de la CTE sobre la Fuerza Muscular y el Rendimiento Muscular.

El grupo de yeso (más)/vehículo exhibió un número significativamente mayor de resbalones en las patas traseras en la prueba de falla en el pie (Figura 3(a)), y la velocidad de la marcha fue significativamente más lenta que la del grupo de yeso ( )/vehículo (Figura 3(b) )).

El tratamiento con CTE resultó en una tendencia dependiente de la dosis hacia la disminución de los deslizamientos de las patas traseras. En el grupo de yeso ( plus )/CTE-100, el tratamiento tendió a reducir (p 0.0604) los deslizamientos de las patas traseras en comparación con el grupo de yeso ( plus )/vehículo (Figura 3(a)). En cuanto a la velocidad de la marcha, los grupos cast ( plus )/CTE-50 y cast ( plus )/CTE-100 no mostraron diferencias significativas en la velocidad de la marcha en comparación con el grupo cast ( plus )/vehículo, aunque hubo hubo una ligera tendencia dependiente de la dosis, no significativa, hacia una velocidad más rápida (Figura 3(b)).

3.3. Peso húmedo de TS y Myofiber CSA.

El peso húmedo del TS disminuyó significativamente con la inmovilización del yeso en comparación con el grupo del yeso ( )/vehículo (Figura 4(a)). La administración de CTE no influyó en el peso húmedo de TS.

También se analizó la media de CSA de miofibras en cada grupo. En el grupo de yeso ( plus )/vehículo, se encontró una reducción significativa en el CSA de miofibras en comparación con el grupo de yeso ( )/vehículo (Figura 4(b)). Myofiber CSA se clasificó y analizó aún más por distribución de frecuencia, como se muestra en la Figura 4(c). La clase CSA más frecuente en el grupo cast ( )/vehículo fue mayor que la del grupo cast ( plus )/vehículo; el porcentaje de miofibras en la clase 1350- 2250 μm2 CSA fue, o tendió a ser, significativamente mayor en el grupo fundido ( )/vehículo que en el grupo fundido ( más )/vehículo, y la tendencia opuesta fue evidente en la clase CSA 0 900 grupos μm2 (Figura 4(c)). La distribución de CSA no se vio influida por la administración de CTE en los dos grupos (más)/CTE, en comparación con el grupo de yeso (más)/vehículo (Figura 4(c)). En la Figura 4(d) se muestran imágenes representativas de miofibras.

3.4. Efecto de CTE en los niveles de expresión de MyHC IId/IIx en el TS.

La transferencia de Western se realizó en seis muestras representativas de cada grupo (Figura 5 (a)). Estas muestras fueron seleccionadas en base a su derivación de animales que exhibieron un rendimiento en la prueba de fallo de pie más cercano a los valores medios de sus respectivos grupos.

En el grupo de reparto ( plus )/vehículo, MyHC IId/IIx aumentó significativamente en comparación con el grupo de reparto ( )/vehículo. Este aumento fue suprimido de forma dependiente de la dosis por la administración de CTE. En el grupo cast ( plus )/CTE-100, la expresión de MyHC IId/IIx tendió a disminuir en comparación con el grupo cast ( plus )/vehículo (p 0.0810) (Figura 5(b)) . La expresión de GAPDH, que se usó como control interno, no fue significativamente diferente entre los grupos (Figura 5(c)).

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