Parte 1 Detección de productos medicinales Cistanches Herba (Rou Cong Rong) utilizando firmas de nucleótidos específicas de la especie

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Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* y Shi-lin Chen 3

1 Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministerio de Educación, Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales, Academia China de Ciencias Medicinales y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Beijing, China, 2 NHP Research Alliance, Instituto de Biodiversidad de Ontario (BIO ), Universidad de Guelph, Guelph, ON, Canadá,

3 Laboratorio clave de Beijing para la identificación y evaluación de la seguridad de la medicina china, Instituto de Materia Médica China, Academia China de Ciencias Médicas Chinas, Beijing, China

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Cistanches Herbaes una planta medicinal que tiene propiedades desintoxicantes y se usa comúnmente en Asia. Debido al desequilibrio entre la oferta y la demanda, con frecuencia se agregan adulterantes con fines de lucro. Sin embargo, no hay supervisión regulatoria porque las herramientas de control de calidad no son suficientes para identificar productos altamente procesados. Por lo tanto, se desarrolló una nueva herramienta molecular basada en firmas de nucleótidos y cebadores específicos de especies. Las regiones ITS2 de 251Cistanches Herbay se secuenciaron las muestras adulterantes. Sobre la base de los sitios SNP, se desarrollaron cuatro firmas de nucleótidos dentro de 30∼37 pb y seis cebadores específicos de especie, y se validaron mediante mezclas experimentales artificiales que constaban de seis especies diferentes y proporciones diferentes. Este método también se aplicó para detectar 66Cistanches Herbaproductos en el mercado, incluidos extractos y medicamentos de patente china. Los resultados demostraron la utilidad de las firmas de nucleótidos para identificar adulterantes en mezclas. El estudio de mercado reveló 36,4 por ciento de adulteración: 19,7 por ciento involucraba adulteración con Cynomorium songaricum oCistancheSinensis, y el 16,7 por ciento implicó la sustitución con Cy. songaricum, Ci. sinensis o Boschniakia rossica. Los resultados también revelaron que Cy. songaricum fue el adulterante más común en el mercado. Por lo tanto, recomendamos el uso de firmas de nucleótidos específicas de especie para regular la adulteración y verificar la garantía de calidad de las cadenas de suministro de medicamentos, especialmente para productos procesados ​​cuyo ADN está degradado.

Palabras clave: Cistanches Herba, medicina de patente china, firma de nucleótidos, ADN degradado, control de calidad de medicamentos

INTRODUCCIÓN

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) es un medicamento bien conocido registrado en la Farmacopea en Asia (Comisión de la Farmacopea China, 2015; Convención de la Farmacopea de Japón, 2016); este medicamento se deriva de los tallos suculentos secos deCistanche deserticaYC Ma oCistanche tubulosatónico, ya que no es tóxico y se puede tomar por largos periodos de tiempo (Li et al., 2016). Es más,CistanchesHerba recibió el honor de ser nombrada "Ginseng del desierto" debido a su gran valor medicinal, especialmente para fortalecer la función sexual masculina (Zhang y Su, 2014; Gu et al., 2016). Hay más de 100 medicamentos de patente chinos registrados en la Comisión de Farmacopea China (2015) y en otras normas oficiales locales promulgadas (Wang et al., 2012). A medida que aumenta la población de adultos mayores, existe una demanda considerable deCistanches Herbay sus productos medicinales. Sin embargo, los recursos de materias primas son cada vez más escasos. De hecho, las dos especies originales deCistanches Herbase han agregado al Libro Rojo de Datos de Plantas de China como plantas silvestres protegidas por el estado (categoría II) (Fu, 1991). Los materiales medicinales en el mercado se cultivan principalmente en el noroeste de China.

Debido al considerable desequilibrio entre la oferta y la demanda deCistanchesHerba, muchos adulterantes han entrado en el mercado; estos adulterantes son inconsistentes con los estándares y pueden amenazar la seguridad de los medicamentos. Los adulterantes conocidos incluyen los tallos suculentos secos de Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang en chino),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan y Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. y Flerov (Sun et al., 2012). Estos adulterantes tienen características morfológicas similares a las deCistanchesHerba, lo que dificulta la identificación taxonómica tradicional, particularmente después de que el material se procesa en productos medicinales. La identificación microscópica no está disponible porqueCistanchesHerbano tiene características microscópicas definitivas o únicas. Las herramientas actuales de química analítica no son suficientes para detectar la adulteración de Cistanches Herba porque también existen compuestos similares dentro de los adulterantes conocidos Ci. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) y Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Por lo tanto, se necesita con urgencia el desarrollo de un método molecular rápido para la autenticación de Cistanches Herba y sus productos para sistemas de control de calidad adecuados en la medicina de patente china y otras industrias de productos medicinales.

Chen et al. primero sugirió el espaciador transcrito interno 2 (ITS2) como un código de barras universal para plantas medicinales (Chen et al., 2010). sol et al. verificó la región ITS2 como un código de barras de ADN preferible para identificarCistanchesHerba y sus adulterantes (Sun et al., 2012). Sin embargo, ITS2 no se puede utilizar para distinguir la medicina de patente china del ADN degradado. Recientemente, un número creciente de estudios ha demostrado que el "mini código de barras" es un método útil para amplificar el ADN degradado (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Sin embargo, las firmas de nucleótidos son más apropiadas que los minicódigos de barras, ya que los primeros se refieren a uno o más nucleótidos que son exclusivos de una especie y pueden utilizarse de manera efectiva mediante muchas técnicas moleculares, como sondas de ADN, microfluidos y amplificación isotérmica mediada por bucle ( de Boer et al., 2015). Han et al. desarrolló firmas de nucleótidos para Panax ginseng, Angelica Sinensis y Lonicera japonica e identificó con éxito los medicamentos patentados chinos asociados (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

productos funcionales que contienenCistanchesHerba. Específicamente, (1) desarrollamos cuatro firmas de nucleótidos y seis pares de cebadores específicos para diferenciar auténticosCistanchesHerba y adulterantes conocidos, (2) validaron las cuatro firmas de nucleótidos en experimentos que incluyeron mezclas de cupones taxonómicos conocidos utilizados para preparar productos Cistanches Herba que contienen ingredientes tanto auténticos como adulterados, y (3) realizaron una encuesta de mercado de 66Cistanchesproductos Herba a través de sus firmas de nucleótidos.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección y preparación de muestras

En total, se recolectaron 251 muestras de Mongolia Interior, Xinjiang y Ningxia, entre otras áreas; estas muestras incluyeron 214Cistanches Herbay 37 adulterantes y se detallan en la Tabla complementaria S1. Los taxonomistas validaron las muestras correspondientes y las depositaron en el Herbario del Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales de la Academia China de Ciencias Médicas, Beijing, China. Un total de 35 lotes de polvos, especias y extractos deCistanchesLos herba se compraron en tiendas en línea y farmacias físicas en Beijing y Chengdu (Tabla 1). En total, 31 lotes de medicamentos de patente china que contienenCistanchesHerba se compró en diferentes farmacias (Tabla 2), y las composiciones declaradas de diferentes medicamentos chinos patentados se muestran en la Tabla complementaria S3. Las diferentes características morfológicas de las diferentes formas de dosificación se muestran en la Figura 1.

Muestras mixtas: Polvos de Ci.deserticola, ci.tubulosa, Ci. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica y O. coerulescens se mezclaron artificialmente en diferentes combinaciones (en una proporción de 1:1) antes de la extracción. Los detalles de estas muestras mixtas se muestran en la leyenda de la Figura 3. Además, los polvos de cuatro adulterantes se mezclaron con el Ci genuino. deserticola en diferentes proporciones de peso: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 y 60000:1 (Tabla 3). Y los dos productos genuinos se mezclan en las mismas proporciones.

Decocción: Rodajas de Ci. deserticola y Cy. se utilizó songaricum para preparar la decocción. Las rebanadas (10 g) se hirvieron en 300 ml de agua bidestilada durante 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min y luego se usaron para la extracción de ADN.

Extracción de ADN, amplificación y secuenciación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Especímenes, decocción y muestras mixtas: Las muestras (40–50 mg) se molieron en polvo fino mediante un molino mezclador de laboratorio Retsch MM400 (Retsch Co., Alemania) a una frecuencia de 30 Hz. El ADN genómico se extrajo posteriormente con un Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co., China) según las instrucciones del fabricante. ITS2 fue amplificado por los cebadores universales 2F/3R (Chen et al., 2010).

en paralelo por lote. El polvo de la medicina de patente china se lavó con 700 µl de tampón de prelavado [Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 20 mM, pH 8,0;

NaCl 700 mM; 2 por ciento de polivinilpirrolidona (PVP)-40; y mercaptoetanol al 0,4 por ciento] varias veces hasta que el sobrenadante era transparente e incoloro, después de lo cual la mezcla se centrifugó a 7500 × g durante 5 min a temperatura ambiente. El precipitado se usó posteriormente para extraer el ADN genómico a través del Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al final, el ADN de cada lote se concentró en un tubo. Seis pares de cebadores específicos de especie: SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR y LDF/LDR: fueron diseñados a través de Primer Premier

6.0 software (Premier Co., Canadá) para amplificar Cistanches Herba y sus adulterantes (los detalles se muestran en la Tabla 4). La PCR se realizó en una reacción de 50 µL de volumen que contenía 1 µL de

KOD FX (Toyobo Co., Japón), 25 µL de tampón de PCR 2 ×, 10 µL de dNTP (2 mM), 1,5 µL de cada cebador (10 µM) y 4 µL (∼50 ng) de plantilla de ADN; el volumen restante consistía en agua bidestilada. Las reacciones fueron realizadas por

un termociclador (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., EE.UU.); los programas térmicos se enumeran en la Tabla 4. Los productos de PCR se examinaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 3 por ciento y se purificaron para secuenciación bidireccional con un secuenciador ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) de acuerdo con el método de secuenciación de Sanger. Luego, se probó la sensibilidad de los seis cebadores a través del ensayo PCR en tiempo real cuantitativo (qRT-PCR) con un sistema en tiempo real CFX96 (Bio-rad Lab., EE. UU.). El sistema calculó automáticamente los umbrales del ciclo a través del modelo "Ajuste de la curva sustraída de la línea base de PCR". qRT-PCR se realizó en una reacción de 15 µL de volumen que contenía 7,5 µL de SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Japón), 1.0 µL de cada cebador (10 µM) y 1,0 µL de plantilla de ADN; el volumen restante consiste en agua doblemente destilada. La qRT-PCR se realizó con tres réplicas técnicas en función de las cuales se calculó el error estándar.

Análisis de secuencias: las secuencias se editaron y ensamblaron manualmente a través de CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., EE. UU.).

Las secuencias ITS de GenBank se anotaron a través del modelo Hidden Markov (HMM) para obtener las secuencias ITS2 (Keller et al., 2009). Luego, las secuencias se alinearon con el software MEGA 5.0 a través del método de alineación "Muscle" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

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RESULTADOS

Desarrollo de firmas de nucleótidos y pares de cebadores específicos de especie para Cistanches Herba y adulterantes

Las tasas de éxito de secuenciación y amplificación por PCR de las 251 muestras fueron del 100 % cuando se utilizó el par de cebadores 2F/3R. La longitud alineada del Cy. Las secuencias de songaricum ITS2 eran de 229 pb (Figura complementaria S1). El análisis de las secuencias de las especies de herbario y las de especies estrechamente relacionadas recuperadas de GenBank (Tabla complementaria S2) reveló dos sitios de polimorfismo de nucleótido único (SNP) para Cy. songaricum. Sobre la base de los SNP, un Cy. Se desarrolló la firma de nucleótidos 30- pb específica de songaricum (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') (Figura 2A). Los resultados de la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) en NCBI demostraron que esta firma de nucleótidos era exclusiva de Cy. songaricum (Cuadro 5). Con un análisis similar de las secuencias de especies estrechamente relacionadas, se descubrieron uno o dos SNP de Ci. sinensis, B. rossica y O. coerulescens. Sobre la base de los SNP, las firmas de nucleótidos para los otros tres adulterantes también se desarrollaron de manera similar, incluida una firma de 34 pb (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) para Ci. Sinensis, una firma de 37 pb (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') para B. rossica, y una firma de 31 pb (5′-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg g-3′) para O. coerulescens (Figuras 2BD). El análisis BLAST en NCBI también reveló que estas firmas de nucleótidos eran específicas y no estaban presentes en ninguna otra especie (Tabla 5).

Cistanches Herbay sus adulterantes podrían amplificarse simultáneamente a partir de mezclas a través del par de cebadores universales 2F/3R. Por lo tanto, diseñamos cebadores específicos de especie para la amplificación de la firma de nucleótidos alineando las secuencias ITS2. Se diseñaron cuatro pares de cebadores específicos (SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR y LDF/LDR) para amplificar las firmas de nucleótidos de Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis y O. coerulescens, respectivamente (Cuadro 4). Las longitudes de los amplicones fueron 123, 72, 131 y 71 pb, respectivamente.

Además, se analizaron un total de 214 secuencias ITS2 de materiales experimentales de Cistanches Herba. Dos cebadores específicos cortos: HMRCF/HMRCR y GHRCF/GHRCR para Ci. deserticola y Ci. tubulosa, respectivamente, fueron diseñados para amplificar las regiones cortas de las muestras degradadas (Tabla 4). Las longitudes de los amplicones fueron de 132 y 134 pb, respectivamente.

Validación de la firma de nucleótidos y el método de cebador específico de especie basado en mezclas artificiales y decocción

Las eficiencias de amplificación de los nuevos pares de cebadores se validaron a partir de la mezcla. Los productos de PCR se obtuvieron a través de cada par de cebadores para cada especie objetivo, como se muestra

Se pudieron obtener valores de cq de B. rossica u O. coerulescens incluso con una proporción de muestras de 30000:1 o 40000:1, y los resultados de amplificación de Ci. sinensis, Ci.tubulosa, y Ci deserticola se pudo detectar cuando la proporción fue de 20000:1. Pero no se pudieron obtener resultados detectables para Cy. songaricum cuando constituía la proporción de 20000:1.

Para verificar si el método de firma de nucleótidos funciona con materiales procesados, las decocciones de Ci. deserticola y Cy. se prepararon songaricum. Los resultados mostraron que el código de barras corto de Ci. deserticola podría amplificarse, incluso después de hervir las muestras durante 210 min. Además, la firma de nucleótidos de Cy. songaricum pudo amplificarse después de hervir las muestras durante 150 min, mientras que no se detectaron productos de PCR después de hervir las muestras durante 210 o 240 min (Figura 4). Los resultados de la secuenciación demostraron que la firma de nucleótidos cortos se obtuvo con éxito a partir de la decocción.

Encuesta de mercado de la adulteración a través de la firma de nucleótidos y cebadores específicos

El método anterior se aplicó para la detección deCistanchesProductos Herba en el mercado. Treinta y cinco lotes deCistanchesLas rebanadas, los polvos y los extractos de Herba se amplificaron y secuenciaron mediante el uso de seis cebadores específicos diseñados (los resultados de la electroforesis en gel de agarosa se muestran en la Figura complementaria S2 y las secuencias se enumeran en la Hoja de datos complementaria 1). El análisis de las secuencias a través de sus firmas de nucleótidos reveló que cinco lotes de cortes eran auténticos. Un lote de rebanadas y un lote de polvo se sustituyeron con Cy. songaricum y un extracto fueron sustituidos con Ci. sinensis. Los otros seis lotes de polvos eran mezclas: cinco estaban adulterados con Cy. songaricum y Ci. sinensis y uno fueron adulterados con Cy. songaricum (Cuadro 1). Además, un lote de rebanadas se sustituyó con Salvia miltiorrhiza.

El Cistanches Herba en los medicamentos de patente china se somete a varios procesos que dificultan la autenticación. Se probó la capacidad de los seis pares de cebadores para amplificar las regiones de firma de nucleótidos específicas de la especie de los medicamentos de patente chinos (los resultados de la electroforesis en gel de agarosa se muestran en la Figura complementaria S2). La mayoría de los medicamentos de patente chinos contienen componentes de diferentes tipos de especies. Por ejemplo, las píldoras Shihu Yeguang (ZCY34) contienen 25 ingredientes, incluidos Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) y Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). A partir de estos ingredientes, Cistanches Herba podría amplificarse específicamente a través del par de cebadores GHRCF/GHRCR. La secuenciación directa de los productos de PCR reveló trazas muy limpias. Sin embargo, no se pudo obtener una banda visible con el par de cebadores HMRCF/HMRCR.

Otro ejemplo son las pastillas Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). Hay ocho ingredientes además deCistanchesHerba en este medicamento chino patentado, pero no hubo bandas visibles obtenidas por GHRCF/GHRCR o HMRCF/HMRCR, lo que significa que noCistanches Herbaera presente. Sin embargo, la región adulterante de Cy. songaricum fue amplificado con éxito por el par de cebadores específicos SYF1/SYR1. Los resultados de la secuenciación demostraron la firma de nucleótidos cortos de Cy. songaricum se obtuvo con éxito.

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