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PARTE 2: El polisacárido Cistanche Deserticola inhibe la pérdida ósea inducida por OVX en ratones y la osteoclastogénesis inducida por RANKL

Mar 02, 2022

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com

La osteoporosis es una enfermedad ósea grave que afecta a la población que envejece. Cistanche deserticola (CD), un alimento tónico y medicinal ampliamente utilizado en China, ha demostrado ser un tratamiento eficaz para la osteoporosis.Cistanche deserticola polisacárido(CDP), extraído de CD, posee varias propiedades farmacológicas, pero se desconoce su papel en la formación y función osteoclástica, así como en la osteoporosis. El propósito de este estudio fue extraer y purificar CDP(Cistanche deserticola polisacárido)para explorar más a fondo su posible mecanismo de acción sobre la osteoporosis. Los resultados mostraron que el CDP(Cistanche deserticola polisacárido) el tratamiento previno la osteoporosis inducida por OVX y mejoró la pérdida ósea al reprimir la actividad y función de los osteoclastos. Además, CDP(Cistanche deserticola polisacárido)el tratamiento inhibió significativamente la osteoclastogénesis inducida por RANKL. resorción ósea y expresión génica específica de osteoclastos. Mecanicistamente, CDP(Cistanche deserticola polisacárido)inhibió la activación de las vías de señalización de NF-xB y MAPK inducidas por RANKL y, en consecuencia, afectó la activación de NEATc1 aguas abajo. Los resultados de este estudio sugieren que la CDP(Cistanche deserticola polisacárido)es un fármaco potencialmente seguro para el tratamiento de la osteoporosis.

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Tratamiento para la osteoporosis: Cistanche Deserticola Polysaccharide

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3. Resultados

3.1. CDP(Cistanche deserticola polisacárido)previene la pérdida ósea inducida por OVX in vivo

Utilizamos un modelo de ratón con osteoporosis inducida por OVX para investigar los efectos de la CDP.(Cistanche deserticola polisacárido)tratamiento de la osteoporosis in vivo. En comparación con el grupo Sham, el peso corporal de los ratones OVX aumentó significativamente mientras que el índice uterino disminuyó, lo que indica que el modelo de osteoporosis se construyó con éxito (Fig. 1B y D). El análisis de micro-CT de las tibias en el grupo OVX mostró una gran pérdida ósea. En comparación con el grupo OVX, el número de trabéculas óseas aumentó en el grupo CDP-L, mientras que el aumento en los grupos CDP-H y E2 fue más significativo, y las trabéculas en los dos últimos grupos se volvieron más gruesas y la brecha se hizo más pequeña. El análisis cuantitativo confirmó que varios parámetros histomorfométricos óseos, incluidos BMD, BV/TV, BS/TV y Tb. N había aumentado significativamente los valores, mientras que Tb. Sp mostró valores disminuidos en el grupo CDP-H (Fig. 1E y F). El examen histopatológico con tinción H&E reveló que el número de trabéculas óseas en los grupos CDP-H y E2 fue significativamente mayor que en el grupo OVX, mientras que no hubo una mejora significativa en el grupo CDP-L (Fig. 1G). Además, la tinción TRAcP mostró que el número de osteoclastos aumentó notablemente en el grupo OVX pero disminuyó en los grupos CDP-H y E2 (Fig. 1H). Los grupos CDP-L, CDP-H y E2 inhibieron el aumento del contenido de P inducido por OVX pero aumentaron el contenido de Ca en el suero sanguíneo. Los marcadores de absorción ósea, RANKL y TRAcP-5b mostraron una tendencia decreciente en el CDP-L.

3.2. CDP(Cistanche deserticola polisacárido) suprime la osteoclastogénesis inducida por RANKL in vitro

Monitoreamos la proliferación celular deCDPBMM tratadas con un analizador de imágenes de células vivas dinámicas en tiempo real a largo plazo. En comparación con el grupo de control, la confluencia celular en elCDP-los grupos tratados no cambiaron en una dosis<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Cistanche deserticola polisacárido)sobre la osteoclastogénesis inducida por RANKL, las BMM se estimularon con RANKL y M-CSF en presencia deCDPfor 7 days. TRAcP, a characteristic enzyme of osteoclasts, is considered an indicator of osteoclast function (Minkin, 1982). TRAcP staining showed that the osteoclasts treated with>1,25 µg/mLCDP(Cistanche deserticola polisacárido)mostró un tamaño y número significativamente reducidos. Estos resultados mostraron que CDP(Cistanche deserticola polisacárido)inhibió eficazmente la osteoclastogénesis inducida por RANKL esperada sin afectar la viabilidad celular.

3.3. CDP(Cistanche deserticola polisacárido)inhibe la actividad de reabsorción osteoclástica inducida por RANKL y la expresión génica específica de osteoclastos

Además determinamos los efectos de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)tratamiento de la actividad de reabsorción ósea de los osteoclastos utilizando placas recubiertas de hidroxiapatita. La resorción ósea es la función principal y estándar para medir la actividad y capacidad de los osteoclastos (Novack & Faccio, 2011). Los resultados mostraron que CDP(Cistanche deserticola polisacárido)puede reducir significativamente el área de reabsorción ósea de los osteoclastos de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que la CDP(Cistanche deserticola polisacárido)inhibió la actividad de resorción ósea inducida por RANKL (Fig. 3A y B). En particular, el área de reabsorción ósea osteoclástica disminuyó a aproximadamente un 6,3 % después del tratamiento con 10 µg/mL de CDP.(Cistanche deserticola polisacárido). Para descubrir mejor el obstáculo de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)en la osteoclastogénesis, medimos los niveles de transcripción de los genes relacionados con los osteoclastos. Sin tratamiento con CDP(Cistanche deserticola polisacárido), la inducción con RANKL promovió la expresión de los genes NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 y Mmp9. Por el contrario, la aplicación concomitante de CDP y RANKL reguló significativamente estos cinco genes.

3.4. CDP(Cistanche deserticola polisacárido)inhibe la activación de NFATc1 inducida por RANKL

La tinción TRAcP reveló que CDP(Cistanche deserticola polisacárido)el tratamiento redujo significativamente el aumento esperado en el número de osteoclastos maduros después de la estimulación con RANKL durante 3 a 7 días (Fig. 4A y B). Además, investigamos si el tratamiento con CDP puede afectar efectivamente la diferenciación de osteoclastos al inhibir la expresión de NFATc1. Los resultados mostraron que NFATc1 se expresó en gran medida después de la estimulación con RANKL durante 5 días, lo que se inhibió significativamente después de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)tratamiento (Fig. 4C y D). Además, el tratamiento con CDP suprimió los niveles de expresión de CTSK, una proteína requerida para la formación y función normal de los osteoclastos (Bossard et al., 1996) (Fig. 4E y F). Seleccionamos una representación puntual de la estimulación RANKL durante 5 días para investigar más a fondo el efecto de 10 µg/ml de CDP.(Cistanche deserticola polisacárido)tratamiento de la translocación NFATc1. Como era de esperar, CDP(Cistanche deserticola polisacárido)el tratamiento inhibió significativamente la translocación nuclear NFATc1 inducida por RANKL.

3.5. CDP(Cistanche deserticola polisacárido) inhibe la activación inducida por RANKL de las vías de señalización de NF-κB y MAPK

Para dilucidar los mecanismos involucrados en la inhibición de la diferenciación de osteoclastos inducida por CDP, examinamos el impacto de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)tratamiento en las vías NF-κB y MAPKs. Los resultados revelaron que CDP(Cistanche deserticola polisacárido)el tratamiento tuvo efectos supresores sobre la degradación de IκB- y la fosforilación de p65 de una manera dependiente de la dosis. La fosforilación de tres miembros de la familia MAPK, específicamente la quinasa regulada por señal extracelular (ERK), la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y p38, se regularon positivamente.

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4. Discusión

La osteoporosis es una enfermedad ósea común y degenerativa. En la actualidad, existen muchos fármacos de síntesis química que se utilizan en los tratamientos clínicos de la osteoporosis, como los estrógenos y los bisfosfonatos. Sin embargo, el uso a largo plazo de estos medicamentos debilitará gradualmente la eficacia clínica e incluso causará muchos efectos secundarios graves, incluido un mayor riesgo de cáncer de ovario, mama y endometrio y osteonecrosis de la mandíbula (Beral, 2003; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). Durante este estudio, seleccionamos CDP(Cistanche deserticola polisacárido), un componente eficaz extraído de la CD, como agente terapéutico y demostró que la CDP(Cistanche deserticola polisacárido)tenía un efecto protector contra

pérdida ósea en ratones OVX e inhibió la formación y función de osteoclastos inducida por RANKL. Mientras tanto, según la teoría de la medicina tradicional china del "riñón que gobierna el hueso", la pérdida ósea se atribuye a deficiencias renales. Como alimento médico que tonifica los riñones, se ha demostrado que la CD proporciona un tratamiento eficaz para la osteoporosis (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li y Zhang, 2016). Así, CDP(Cistanche deserticola polisacárido)extraída de esta hierba natural es una opción de medicamento mejor y más segura.

Actualmente, el modelo de ratón OVX es un modelo clásico de pérdida ósea posmenopáusica en mujeres, investigando las causas de la pérdida ósea y realizando intervenciones (Wehrle et al., 2015). En consecuencia, realizamos una ovariectomía bilateral en ratones hembra C57BL/6J para construir un modelo de osteoporosis. En estudios anteriores, las dosis de CDP administradas a los animales fueron de 50 a 200 mg/kg (dosis baja) y de 1800 mg/kg (dosis alta) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Aquí, la alta dosis de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)en ratones fue de 600 mg/kg, que se basó en la dosis clínica alta de 30 g de CD en decocción; por lo tanto, es similar a la práctica clínica actual. En este estudio, el tratamiento con CDP(Cistanche deserticola polisacárido)inhibió significativamente el aumento de peso corporal inducido por OVX, que es un fenómeno común observado en ratones OVX (Davis et al., 2019). Mediante el uso de escaneo micro-CT y reconstrucción 3D, encontramos que OVX condujo a una reducción notable en BMD, BV/TV, BS/TV y Tb. N, y un aumento de Tb. Sp, mientras que el tratamiento con CDP revirtió todas estas alteraciones. En particular, en comparación con el fármaco positivo, la CDP podría mejorar significativamente la DMO de los ratones OVX, que es un marcador importante de la calidad ósea y se usa para reflejar el grado de osteoporosis (Fuggle et al., 2019), lo que indica que la CDP tiene una ventaja sobre el fármaco positivo en la mejora de la DMO. Además, los resultados histológicos indicaron que el tratamiento con CDP podría reducir la mayor cantidad de osteoclastos positivos para TRAcP inducidos por OVX. Estos resultados sugieren que la administración de CDP mitigó eficazmente la pérdida ósea en la osteoporosis inducida por OVX, posiblemente al inhibir la formación de osteoclastos. De acuerdo con los resultados anteriores, encontramos que CDP inhibía de forma dependiente de la dosis la formación y función osteoclástica inducida por RANKL, mientras que CDP tenía poco efecto sobre la proliferación de células precursoras de osteoclastos inducida por M-CSF en nuestros experimentos in vitro.

La unión de RANKL y RANK puede conducir al reclutamiento de TRAF6 y la posterior activación de varias vías de señalización aguas abajo, como NF-κB y MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). La vía de señalización de NF-κB juega un papel importante en la regulación de la diferenciación de osteoclastos, y el silenciamiento de genes que codifican proteínas clave en esta vía puede conducir a un desarrollo óseo anormal (Leibbrandt & Penninger, 2008). Está bien establecido que NF-κB está presente en el citoplasma de las células no estimuladas en un complejo con IκB pero ingresa rápidamente al núcleo después de la estimulación con RANKL (Boyle et al., 2003). El IκB liberado luego se degrada rápidamente, mientras que el NF-κB activa la transcripción de genes específicos, lo que promueve la diferenciación, maduración y apoptosis de los osteoclastos (Abdelmagid et al., 2015). En este estudio, los resultados mostraron que CDP(Cistanche deserticola polisacárido)el tratamiento suprimió la activación inducida por RANKL de la vía de señalización de NF-κB, como lo demuestra la inhibición de la degradación de IκB y la fosforilación de p65 de manera dependiente de la dosis, lo que puede implicar su efecto antiosteoclastogénico. Además, la vía de señalización de las MAPK, incluidas ERK, JNK y p38, están estrechamente involucradas en la osteoclastogénesis inducida por RANKL (Li et al., 2002). Además, los inhibidores dominantes de p38 y JNK pueden prevenir la osteoclastogénesis inducida por RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), mientras que ERK desempeña un papel importante en la supervivencia de los osteoclastos (Miyazaki et al., 2000). Está bien establecido que RANKL activa la vía de señalización de MAPK al aumentar la fosforilación de ERK, JNK y p38 (Mizukami et al., 2002). En nuestro estudio, demostramos que CDP suprimió la fosforilación inducida por RANKL de proteínas clave en la vía de señalización de MAPK. En conjunto, estos resultados indican que la inhibición de la activación de las vías de señalización de NF-κB y MAPK contribuye al efecto inhibidor de la CDP contra la osteoclastogénesis.

La activación de las vías de señalización de NF-κB y MAPK promueve la expresión de varios factores de transcripción clave, como el oncogén celular fos, la proteína activadora 1 y NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, un miembro importante de la familia NFAT, participa en la diferenciación de osteoclastos terminales como un regulador transcripcional maestro (Asagiri et al., 2005). Se ha informado que las células madre embrionarias deficientes en NFATc1- no pueden diferenciarse en osteoclastos bajo la estimulación de RANKL y la expresión ectópica de NFATc1 hace que las células precursoras se diferencien sin pasar por la señalización de RANKL, lo que sugiere que NFATc1 tiene un papel crítico en diferenciación de osteoclastos (Takayanagi et al., 2002). Los resultados de nuestro estudio mostraron el efecto supresor de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)sobre la expresión de NFATc1 y su siguiente proteína CTSK. Curiosamente, observamos que el nivel de expresión de proteína de NFATc1 primero aumentó y luego disminuyó, alcanzando el nivel más alto el quinto día después de la estimulación con RANKL. Esto fue consistente con los resultados de Baek et al. (2014), quienes observaron la degradación de NFATc1 inducida por M-CSF durante la osteoclastogénesis en etapa tardía a través de la ubiquitinación de NFATc1 inducida por Cbl de una manera dependiente de la quinasa Src. Los resultados del ensayo de inmunofluorescencia respaldaron consistentemente el efecto inhibidor de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)en la activación transcripcional de NFATc1. Además, los genes específicos de osteoclastos, incluidos CTSK, Acp5, Mmp9 y Atp6v0d2, están todos regulados directamente por NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), y fueron suprimidos por CDP. Estos hallazgos ilustran que NFATc1 es un objetivo del efecto inhibidor de CDP(Cistanche deserticola polisacárido)en las vías de señalización de NF-κB y MAPKs.

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5. Conclusión

En resumen, extrajimos y purificamos el polisacárido activo de CD y demostramos que CDP(Cistanche deserticola polisacárido)exhibió un efecto protector sobre la osteoporosis inducida por OVX y mejoró la pérdida ósea al reprimir la actividad y función de los osteoclastos. Además, CDP(Cistanche deserticola polisacárido)puede inhibir la diferenciación y la función de los osteoclastos inducida por RANKL al interferir con las vías de señalización de NF-κB y MAPK y, en consecuencia, afectar la activación de NFATc1 corriente abajo. En conclusión, nuestros hallazgos sientan las bases para la expansión y aplicación de CDP en el tratamiento de la osteoporosis.

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