Parte 1: El echinacósido inhibe la liberación de glutamato al suprimir la entrada de Ca2 más dependiente del voltaje y la proteína quinasa C en terminales nerviosas cerebrales de rata

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Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 y Su Jane Wang 3,*

Resumen:

El sistema glutamatérgico puede estar involucrado en los efectos de las terapias neuroprotectoras.echinacósido, un glucósido feniletanoide extraído de la hierba medicinal chinaHerba Cistanche, tiene efectos neuroprotectores. Este estudio investigó los efectos deechinacósidosobre 4-la liberación de glutamato evocada por aminopiridina en terminales nerviosas cerebrocorticales de rata (sinaptosomas). El echinacósido inhibió la liberación de glutamato provocada por aminopiridina dependiente de Ca2 plus, pero no independiente de Ca2 plus, de una manera dependiente de la concentración. El echinacósido también redujo el aumento provocado por 4-aminopiridina en la concentración de Ca2+ libre citoplasmático, pero no alteró el potencial de la membrana sinaptosómica. El efecto inhibitorio del equinacósido sobre la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina fue impedido por la o-conotoxina MVIIC, un bloqueador de amplio espectro de los canales Cav2.2 (tipo N) y Cav2.1 (tipo P/Q) , pero fue insensible a los inhibidores de la liberación intracelular de Ca2 más dantroleno y 7-cloro-5-(2-clorofenilo)-1,5-dihidro-4 ,1-benzodiazepina-2(3H)-ona (CGP37157). Además, el equinacósido disminuyó la fosforilación de la proteína quinasa C inducida por 4-aminopiridina, y los inhibidores de la proteína quinasa C abolieron el efecto del equinacósido sobre la liberación de glutamato. De acuerdo con estos resultados, sugerimos que el efecto inhibitorio del equinacósido sobre la liberación evocada de glutamato está asociado con la reducción de la entrada de Ca2 plus dependiente del voltaje y la subsiguiente supresión de la actividad de la proteína quinasa C.

Palabras clave:equinacósido; liberación de glutamato; terminales nerviosas cerebrocorticales; canales de Ca2+ dependientes de voltaje; proteína quinasa C

1. Introducción

echinacósidoes un importante glucósido feniletanoide presente enHerbaCistanche, una conocida medicina tradicional china utilizada para tratar el olvido, la impotencia y el estreñimiento crónico [1].echinacósidoPosee diversas bioactividades, como antioxidantes, antiinflamatorias, anticancerígenas, hepatoprotectoras y moduladoras inmunitarias [2–4]. En particular, el equinacósido tiene efectos neuroprotectores; por ejemplo, puede proteger contra el estrés oxidativo o la neurotoxicidad inducida por neurotoxinas en neuronas corticales primarias de rata, células SH-SY5Y de neuroblastoma humano y células de feocromocitoma (PC12) [5–8]. Además, el equinacósido atenúa el daño cerebral y mejora la función cognitiva en modelos animales de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y oclusión de la arteria cerebral media [9-12]. Sin embargo, el mecanismo a través del cualechinacósidoinduce la neuroprotección no se entiende completamente.

La neuroprotección es un proceso complejo de preservación de la estructura y función neuronal ante agresiones tóxicas. La reducción de la excitotoxicidad del glutamato se considera un mecanismo potencial involucrado en la neuroprotección cerebral. El glutamato, un neurotransmisor de aminoácidos excitatorios, tiene un papel crucial en varias funciones cerebrales [13]. Sin embargo, la sobreactivación de los receptores de glutamato bajo altas concentraciones de glutamato causa una sobrecarga de Ca2+ intracelular, disfunción mitocondrial, producción de radicales libres y muerte neuronal [14,15]. Este proceso patológico está implicado en numerosos trastornos cerebrales, como la isquemia cerebral, la lesión cerebral traumática, la epilepsia y las enfermedades neurodegenerativas [16,17]. Por lo tanto, los inhibidores que bloquean la transmisión glutamatérgica fisiopatológica se consideran fármacos neuroprotectores potenciales. Ejemplos notables de estos son los antagonistas de los receptores de glutamato [18,19]; sin embargo, los ensayos clínicos de estos fármacos han fracasado debido a su menor eficacia y efectos secundarios no deseados o incluso citotóxicos [20,21]. Además del bloqueo directo del receptor de glutamato, la inhibición de la liberación de glutamato puede ser una estrategia eficaz para la neuroprotección. Varios neuroprotectores (p. ej., memantina y riluzol) pueden reducir la liberación de glutamato en tejidos cerebrales de rata [22–24].

Teniendo en cuenta el papel del glutamato en la excitotoxicidad y el perfil neuroprotector del equinacósido, el presente estudio utilizó terminales nerviosas aisladas (sinaptosomas) purificadas de la corteza cerebral de rata para investigar el efecto del equinacósido en la liberación de glutamato y exploró más a fondo los posibles mecanismos. La preparación de la terminal nerviosa aislada es un modelo bien establecido para estudiar la regulación presináptica de la liberación de neurotransmisores por fármacos en ausencia de efectos postsinápticos [25]. Mediante el uso de este modelo, evaluamos el efecto del equinacósido sobre la liberación de glutamato, el potencial de membrana, el flujo de entrada de Ca2 presináptico y la actividad de la proteína quinasa C. Según nuestra revisión de la literatura, este es el primer informe que documenta el mecanismo a través del cual el equinacósido inhibe la liberación endógena de glutamato a nivel presináptico.

2. Resultados

2.1. echinacósidoInhibe la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina de las terminales nerviosas cerebrocorticales de rata mediante la reducción de la exocitosis vesicular

La figura 1 ilustra el efecto dependiente de la concentración del equinacósido sobre la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina de sinaptosomas cerebrocorticales de rata purificados. En sinaptosomas incubados con CaCl2 1 mM, 4-aminopiridina 1 mM evocó una liberación de glutamato de 7,4 ± {{1{{20}}}},1 nmol/mg/5 min, que se redujo por 1, 5, 10, 30 y 50 uM de equinacósido a 6,5 ​​± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,

4,1 ± 0,1 o 2,3 ± 0,4 nmol/mg/5 min, respectivamente (F(5,24)=67,1, p=0. 000). El valor IC50 para la inhibición mediada por equinacósido de la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina, derivada de una curva de dosis-respuesta, fue de 24 uM. Además, la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina 1 mM en una solución extracelular libre de Ca2+ que contiene 300 uM de etilenglicol bis(-aminoetil éter)-N,N,N/,N/-ácido tetraacético (EGTA) fue 2.1 0.2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000),

y este componente independiente de Ca2 plus de la liberación de glutamato provocado por 4-aminopiridina no se vio afectado por 20 uM de equinacósido (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p {{1 0}}.58; Figura 1). En los sinaptosomas tratados con 0,1 uM de bafilomicina A1, un inhibidor del transportador vesicular [26], la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina se redujo significativamente (2,2 ± 0,2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249.518, p=0.000). En presencia de bafilomicina A1, el equinacósido 20 uM no logró inhibir significativamente la liberación de glutamato (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; Figura 1). Por el contrario, 10 uM de DL-treo-beta-bencil-oxiaspartato (DL-TBOA, un inhibidor de la recaptación de glutamato) [27], aumentó la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina a 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, p=0.000). Incluso en presencia de DL-TBOA, el equinacósido 20 uM inhibió significativamente la liberación de glutamato provocada por aminopiridina 4- (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.000; Figura 1).

2.2 El equinacósido reduce la concentración de Ca2+ citosólico pero no altera el potencial de la membrana sinaptosómica

La despolarización del sinaptosoma causada por 4-aminopiridina 1 mM aumentó la concentración de Ca2+ (p=0.000; Tabla 1). La aplicación de equinacósido 20 uM no afectó significativamente la concentración basal de Ca2 plus (t(8)=0.06, p=0.95) pero redujo significativamente el aumento inducido por 4-aminopiridina en Ca2 más concentración (t(10)=6.16, p=0.000). Además, 4-aminopiridina 1 mM aumentó la fluorescencia de yoduro de 3',3',3'-dipropiltiadicarbocianina [DiSC3(5)] (p=0.000). La adición de equinacósido 20 uM no alteró el potencial de membrana en reposo (t(8)=0.976, p=0.36) ni cambió significativamente el aumento de DiSC3 mediado por 4-aminopiridina (5) fluorescencia (t(8)=-0.014, p=0.99; Tabla 1).

2.3 La reducción del flujo de entrada de Ca2 más a través de los canales Cav2.2 (tipo N) y Cav2.1 (tipo P/Q) puede estar asociada con la inhibición de la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina por el equinacósido

La Figura 2 muestra que 2 uM de o-conotoxina MVIIC, un bloqueador de canales de Ca2 plus de tipo N y P/Q, redujo la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina de 7,4 ± {{10}}. 2 a 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 min (t(9)=25.35, p=0.000). En presencia de o-conotoxina MVIIC, el efecto del equinacósido 20 uM sobre la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina no fue significativo (1,8 2± más 0,2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06, p=0.32). Dantroleno (10 uM), un inhibidor de la liberación de Ca intracelular del endoplásmico

reticulum [28], reducción de la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, pág=0.000). Sin embargo, en presencia de dantroleno, el equinacósido 20 uM aún podría inhibir significativamente la liberación de glutamato (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Se observaron resultados similares usando 7-cloro-5-(2-clorofenia)-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepina 100 uM -2(3H)-ona (CGP37157), un bloqueador permeable a la membrana del intercambio mitocondrial de Na más/Ca2 más. En las cinco preparaciones sinaptosómicas examinadas, el equinacósido 20 uM combinado con CGP37157 100 uM redujo la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en un 48,3 por ciento ± 5,2 por ciento (F(2,13) ​​= 136.79, p {{ 49}}.000), similar a la inhibición del echinacósido solo (46,2 % ± 2,3 %; p=0,89; Figura 2).

2.4 echinacósidoInhibe la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina mediante la señalización a través de la proteína quinasa C

Como se ilustra en la Figura 3, 10 uM 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimida (GF109203X), un inhibidor general de la proteína quinasa C [29], redujo la 4-liberación de glutamato provocada por aminopiridina (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{{17 }}). En los sinaptosomas tratados con GF109203X, el equinacósido 20 uM redujo la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en solo un 5,5 % ± 1,8 % (p=0,89), menos que el equinacósido solo (42,4 % ± 2,3 por ciento; p=0.000). Se obtuvieron resultados similares con 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrolo[3 ,4-c]carbazol-12-propanonitrilo (Go6976), un selectivo para las isoformas de la proteína quinasa C dependiente de Ca2 plus ( , I, II, y) [29]. En presencia de Go6976 3 uM, el equinacósido 20 uM redujo la liberación de glutamato en un 11,9 % ± 2,9 % (p=0,59), lo que significa una reducción significativa en comparación con el equinacósido solo (42,4 % 2,3 %; p {{ 65}}.000;Figura 3). Por el contrario, rottlerin 3 uM, un inhibidor de la proteína quinasa C6 independiente de Ca2 plus [30], no alteró significativamente la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (1 mM) (p=0.45). No obstante, en presencia de rottlerin, el echinacósido 20 uM causó efectivamente una inhibición promedio del 37,1 % ± 5,6 % de la liberación (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{88 }}), similar a la del echinacósido solo (p=0.41; Figura 3). Además, el inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógeno 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopirano-4-ona) (PD98059 ) (50 uM) y el inhibidor de la proteína quinasa A N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-isoquinolinasulfonamida (H89) (100 uM) redujo la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (p=0.000). Incluso en presencia de PD98059 o H89, el echinacósido 20 uM redujo efectivamente la liberación (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; Figura 3).

La Figura 4 muestra que la 4-aminopiridina 1 mM aumentó la fosforilación de la proteína quinasa C en los sinaptosomas (t(4)=-6.871, p=0.002). Cuando los sinaptosomas se pretrataron con equinacósido 20 uM durante 10 minutos antes de agregar 4-aminopiridina, la 4-aminopiridina indujo la fosforilación de la proteína quinasa C disminuyó considerablemente (F(2,6)=29.202 , p= 0.001).

2.5 La inhibición de la liberación de glutamato mediada por equinacósido no involucra un receptor de ácido gamma-aminobutírico tipo A (GABAA)

En la Figura 5, se comparó el efecto del equinacósido sobre la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en ausencia o presencia de SR95531 (un antagonista del receptor GABAA). Además, SR95531 100 uM no alteró significativamente la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (1 mM). En los sinaptosomas tratados con SR95531-, la aplicación de equinacósido 20 uM dio como resultado una inhibición del 43 por ciento en la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), que no fue significativamente diferente de la inhibición producida por el equinacósido solo (40 por ciento; p=0.000). Se obtuvo un resultado similar con otro antagonista del receptor GABAA, bicuculina (50 uM). La liberación medida en presencia de bicuculina y equinacósido fue significativamente diferente de la obtenida en presencia de bicuculina sola (p=0.000).

3. Discusión

En este estudio,echinacósido, un compuesto activo en HerbaCistanche, inhibió 4-la liberación de glutamato evocada por aminopiridina en las terminales nerviosas de la corteza cerebral de rata. Los posibles mecanismos subyacentes de laechinacósidoLa inhibición mediada por la liberación de glutamato se investiga y analiza más a fondo aquí.

3.1 Mecanismos subyacentes a la inhibición de la liberación de glutamato mediada por equinacósido

La liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina consta de dos componentes: un componente dependiente de Ca2+ fisiológicamente relevante, que se produce a través de la exocitosis de vesículas sinápticas que contienen glutamato; y un componente independiente de Ca2+, que se origina a partir de una despolarización prolongada que provoca un cambio mediado por el potencial de membrana del estado estacionario del transportador de glutamato hacia el exterior, lo que afecta el flujo de salida de glutamato citosólico [31]. Aquí, observamos que el equinacósido no inhibió significativamente la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en presencia de un medio libre de Ca2+ (liberación independiente de Ca2+). Además, la inhibición mediada por el equinacósido observada de la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina fue efectivamente prevenida por la bafilomicina A1 (que agota el contenido de glutamato de las vesículas sinápticas), pero no por DL-TBOA (que inhibe de manera no selectiva todos los aminoácidos excitadores). subtipos de transportadores). Estos resultados sugieren que el equinacósido afecta la exocitosis de la liberación de glutamato dependiente de Ca2 plus sin afectar el eflujo citosólico de glutamato independiente de Ca2 plus a través de la inversión del transportador de glutamato de la membrana plasmática terminal nerviosa. En las terminales sinápticas, la inhibición de los canales de Na+ o la activación de los canales de K+ estabiliza la excitabilidad de la membrana y, en consecuencia, reduce la entrada evocada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores [32,33]. Por lo tanto, el mecanismo potencial subyacente a la inhibición de la liberación de glutamato mediada por equinacósido implica una reducción en la excitabilidad sinaptosómica. Sin embargo, esta posibilidad es insostenible sobre la base de dos observaciones: (1) la despolarización del potencial de membrana provocada por 4-aminopiridina, medida con el colorante sensible al potencial de membrana DiSC3(5) no se vio afectada por la adición de equinacósido; y (2) el equinacósido no afectó la 4-liberación de glutamato independiente de Ca2 más provocada por aminopiridina, un componente de la liberación que depende únicamente del potencial de membrana [31]. Si el efecto no es causado por la supresión de la excitabilidad sinaptosómica, puede manifestarse a través de una reducción en la actividad de los canales de Ca2+ Cav2.2 (tipo N) y Cav2.1 (tipo P/Q) junto con exocitosis de glutamato en el terminales nerviosas [34-36]. Mediante el uso de fura-2, demostramos que el equinacósido reduce significativamente el aumento de la concentración de Ca2+ provocado por 4-aminopiridina. Además, nuestros datos muestran que el efecto inhibitorio del equinacósido sobre la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina disminuyó del 42,4 % 2,3 % al 12,1 % 3,9 % después de la exposición a un bloqueador de Cav2.2 (tipo N) y Cav2 .1 canales de Ca2 plus (tipo P/Q). Además, observamos que el equinacósido continuó inhibiendo significativamente la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en presencia de inhibidores de la liberación de Ca2 plus intracelular. Estos resultados indican que la supresión simultánea de Cav2.2 (tipo N) y Cav2.1 (tipo P/Q) de la actividad del canal Ca2 plus es el mecanismo potencial subyacente a la inhibición de la liberación de glutamato mediada por equinacósido. Sin embargo, la activación combinada de la actividad del canal Ca2 plus Cav2.2 (tipo N) y Cav2.1 (tipo P/Q) no pudo bloquear completamente la acción del equinacósido. Por lo tanto, otros tipos no identificados de canales de Ca2+ u otras vías presinápticas pueden estar involucrados en la inhibición. Por ejemplo, los receptores GABAA están presentes en el nivel presináptico y se ha demostrado que su activación inhibe la entrada de Ca2+ y la liberación de glutamato [37]. En el presente estudio, los antagonistas del receptor GABAA SR95531 y la bicuculina no bloquearon la inhibición de la liberación de glutamato mediada por equinacósido, lo que sugiere que los receptores GABAA no están involucrados en la reducción de la actividad del canal Ca2 plus dependiente de voltaje y en la inhibición posterior de la liberación de glutamato. La entrada de Ca2 plus a través de los canales de Ca2 plus dependientes de voltaje activa varias proteínas quinasas asociadas con la liberación de glutamato en las terminales nerviosas, incluida la proteína quinasa activada por mitógeno, la proteína quinasa C y la proteína quinasa A. Aquí, demostramos que los inhibidores de la proteína quinasa C antagonizan de manera eficiente el equinacósido -inhibición mediada por la liberación de glutamato; sin embargo, el inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógeno PD98059 o el inhibidor de la proteína quinasa A H89 fueron ineficaces. Además, la fosforilación de la proteína quinasa C inducida por 4-aminopiridina disminuyó en los sinaptosomas después del pretratamiento con equinacósido a una concentración efectiva para inhibir la liberación de glutamato. Por lo tanto, la vía de señalización de la inhibición de la liberación de glutamato mediada por equinacósido puede involucrar a la proteína quinasa C. La proteína quinasa C es un importante sistema de señalización intracelular que está presente en el nivel presináptico y tiene un papel crucial en la exocitosis de neurotransmisores. Por ejemplo, varias proteínas sinápticas implicadas en el tráfico de vesículas sinápticas o el reclutamiento y la exocitosis, como el sustrato de la cinasa C rica en alanina miristoilada, son fosforiladas por la proteína cinasa C [38,39]. Este proceso de fosforilación puede incrementarse mediante la entrada de Ca2+ estimulada por la despolarización, lo que facilita la liberación de glutamato [40]. Por lo tanto, podemos especular razonablemente que el efecto inhibitorio del equinacósido sobre la entrada de Ca2 plus observado aquí puede reducir la actividad de la proteína quinasa C y, en consecuencia, la liberación de glutamato.

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