Parte 2: El echinacósido inhibe la liberación de glutamato al suprimir la entrada de Ca2 más dependiente del voltaje y la proteína quinasa C en terminales nerviosas cerebrales de rata

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 y Su Jane Wang 3,*

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3.2 Implicaciones terapéuticas

La excitotoxicidad, un proceso patológico causado por la liberación excesiva de glutamato y la activación del receptor de glutamato, es la principal causa de muerte neuronal en trastornos cerebrales agudos y crónicos como accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática, Parkinson y Alzheimer [13,41], y las estrategias terapéuticas que involucran la inhibición de la liberación de glutamato pueden ser estrategias neuroprotectoras prometedoras para tratar tales enfermedades. Se ha confirmado que el echinacósido penetra la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y exhibe efectos neuroprotectores en varios modelos in vivo de neurotoxicidad [8,10–12,42]. Aunque el mecanismo de estos efectos neuroprotectores no se comprende por completo, se han informado varios mecanismos posibles que incluyen la inhibición de la respuesta inflamatoria, la estabilización de la función mitocondrial, la antioxidación, la eliminación de radicales libres y la imitación de la función neurotrófica [5,9,12,42]. En el estudio actual, la capacidad deechinacósidoreducir la liberación de glutamato de las terminales nerviosas también puede explicar en parte su mecanismo neuroprotector. Sin embargo, si este efecto contribuye al aparente potencial terapéutico deechinacósidoen los trastornos cerebrales asociados con la excitotoxicidad del glutamato merece más investigación.

Efectos neuroprotectores decistancél echinacósido

4.Materiales y métodos

4.1. quimicos

El éster fura-2-acetoximetílico (Fura-2-AM) y el yoduro de 3',3',3'-dipropiltiadicarbocianina [DiSC3(5)] se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). o-conotoxina MVIIC, rottlerina, 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimida ( GF109203X), 5,6,7,13-tetrahidro- 13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,{ {27}}c]carbazol-12-propanonitrilo (Go6976) y N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-isoquinolinasulfonamida (H89) se adquirieron de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido) ).equinacósido, dantroleno, DL-treo-beta-bencil-oxiaspartato (DL-TBOA), 7-cloro-5-(2-clorofenia)-1,5-dihidro{ {10}},1-benzotiazepina-2(3H)-ona (CGP37157), 2-(2-amino-3- metoxifenilo)-4H -1-benzopirano-4-ona) (PD98059), etilenglicol bis(-aminoetil éter)-N,N,N/,N/-ácido tetraacético (EGTA) y todos los demás reactivos se adquirieron de Sigma- Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE. UU.).

4.2. animales

Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de dos meses de edad. Los animales se alojaron en condiciones ambientales estandarizadas (22 ± 1 oC; 50 % de humedad relativa; ciclo de luz/oscuridad de 12 h) y se les permitió acceso ilimitado a alimentos y agua. Los animales se sacrificaron por decapitación y la corteza cerebral se eliminó rápidamente a 4 oC. Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Utilización de Animales de Fu Jen (A10259), de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales y utilizar un número mínimo de animales necesarios para producir resultados fiables.

4.3. Preparaciones sinaptosómicas

Se purificaron sinaptosomas de la corteza cerebral de ratas en gradientes discontinuos de Percoll como se describió anteriormente [43,44]. Brevemente, el tejido se homogeneizó en un medio que contenía sacarosa 0,32 M (pH 7,4), el homogeneizado se centrifugó durante 10 min a 3000× g (5{{25} 00 rpm en un rotor JA 25.5; Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, EE. UU.) y 4 oC, y el sobrenadante se centrifugó nuevamente durante 12 min a 14 500 × g (11, 000 rpm en un rotor JA 25.5). El sedimento se resuspendió suavemente en sacarosa 0,32 M (pH 7,4), y una alícuota de esta suspensión sinaptosómica (2 ml) se colocó en un gradiente discontinuo de Percoll de 3 ml que contenía sacarosa 0,32 M, EDTA 1 mM, DL-ditiotreitol 0,25 mM y 3 por ciento, 10 por ciento y 23 por ciento de Percoll (pH 7.4). Luego de centrifugar a 32,500×g (16,500 rpm en un rotor JA 20.5) por 7 min a 4 oC, se recuperaron los sinaptosomas entre las bandas de Percoll al 10 por ciento y al 23 por ciento, y se diluyeron en un volumen final de 30 mL de Medio tampón HEPES (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, NaHCO3 5 mM, MgCl2﹒ 6H2O 1 mM, Na2HPO4 1,2 mM, glucosa 10 mM y HEPES 10 mM (pH 7,4)). Después de una centrifugación adicional a 27,000x g (15 000 rpm en un JA 25,5) durante 10 min, el precipitado de sinaptosomas se resuspendió en 3 ml de medio tampón HEPES y se determinó el contenido de proteínas mediante un ensayo de Bradford. Finalmente, 0,5 mg de la suspensión de sinaptosomas se diluyeron en 10 ml de medio tampón HEPES y se centrifugaron a 3000 × g (5000 rpm en un rotor JA 20.1) durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y los gránulos que contenían los sinaptosomas se almacenaron en hielo y se usaron en un plazo de 4 a 6 h.

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4.4. Liberación de glutamato

La liberación de glutamato se analizó mediante fluorimetría en línea como se describió anteriormente [45,46]. Los sedimentos sinaptosómicos se resuspendieron en medio tampón HEPES (00,5 mg/ml) y se preincubaron a 37 °C durante 10 min en presencia de albúmina sérica bovina 16 uM para unir los ácidos grasos libres liberados de los sinaptosomas durante la preincubación. Se transfirió una alícuota de 2-mL de los sinaptosomas a una cubeta agitada que contenía NADP más 2 mM, 50 unidades de glutamato deshidrogenasa y CaCl2 1,2 mM, y se midió la fluorescencia de NADPH en un Perkin-Elmer LS{{14 }} espectrofluorímetro (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, EE. UU.) a longitudes de onda de excitación y emisión de 340 y 460 nm, respectivamente. Como los sinaptosomas no son susceptibles a la estimulación eléctrica, se utilizó el bloqueador de los canales de potasio 4-aminopiridina para estimular la liberación de glutamato. La 4-aminopiridina desestabiliza el potencial de membrana y se cree que causa una despolarización espontánea repetitiva dependiente de los canales de Na+ que se aproxima mucho a la despolarización in vivo de la terminal sináptica que conduce a la activación de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje y la liberación de neurotransmisores [47 ]. Los datos se obtuvieron a intervalos de 2 s. Se añadió un estándar de glutamato exógeno (5 nmol) al final de cada experimento. El valor del cambio de fluorescencia producido por la adición estándar se usó para calcular el glutamato liberado como nanomoles de glutamato por miligramo de proteína sinaptosómica (nmol/mg). Los valores de liberación citados en el texto son niveles alcanzados en estado estacionario después de 5 min de despolarización (nmol/mg/5 min). Los datos acumulativos se analizaron utilizando hojas de cálculo Lotus 1-2-3 (IBM, White Plains, NY, EE. UU.) y MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.).

4.5. Potencial de membrana plasmática

El potencial de membrana plasmática se determinó con un colorante sensible al potencial de membrana, DiSC3(5) [48]. Los sinaptosomas se resuspendieron en medio tampón HEPES y se transfirieron alícuotas de 2 ml a una cubeta agitada que contenía DiSC3(5) 5 uM a 37 oC en un espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA , EE.UU). Después de permitir que la mezcla se equilibrara durante 3 min, se determinó la fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 646 y 674 nm, respectivamente. Los datos se recogieron a intervalos de 2 s. Los datos acumulativos se analizaron utilizando MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.) y se expresaron en unidades de fluorescencia.

4.6. Concentración citosólica de Ca2 plus ([Ca2 plus ]C)

El [Ca2 plus ]C se midió con el indicador fura-2 de Ca2 plus. Se preincubaron sinaptosomas (0.5 mg/mL) en medio tampón HEPES que contenía 5 uM de fura-2 y 0.1 mM CaCl2, durante 30 min a 37 oC en un tubo de ensayo agitado . Después de la carga de fura-2, los sinaptosomas se centrifugaron en una microcentrífuga durante 30 s a 3000 × g (5000 rpm). Los sedimentos sinaptosómicos se resuspendieron en medio tampón HEPES y la suspensión sinaptosómica se agitó en una cubeta termostatizada en un espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, EE. UU.). Se añadió CaCl2 (1 mM) después de 3 min y se hicieron más adiciones después de 10 min más. Los datos de fluorescencia se acumularon a longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm (longitud de onda de emisión de 505 nm) a intervalos de 2 s. [Ca2 más ]C (nM) se calculó utilizando los procedimientos de calibración [49] y las ecuaciones descritas anteriormente [50]. Los datos acumulativos se analizaron utilizando MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.).

4.7. Transferencia occidental

Los sinaptosomas se homogeneizaron en un tampón de lisis (tampón HEPES 10 mM, pH 7,4), Triton X-100 al 1 por ciento y una mezcla de inhibidores de proteasa. Los lisados ​​se aclararon mediante centrifugación y la concentración de proteínas se determinó utilizando un kit de análisis de proteínas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Se separaron cantidades iguales de proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris que contenía leche descremada al 5 % y se incubaron con el anticuerpo primario apropiado (fosfoproteína quinasa C (pan), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, EE. UU.) durante la noche a 4 oC. Después de tres lavados en solución salina tamponada con Tris, la membrana se trató con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:3000) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se lavaron al menos tres veces con solución salina tamponada con Tris y se visualizaron utilizando el sistema de quimioluminiscencia mejorado (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Se cargó una alícuota de muestras y se sondó con un anticuerpo anti-PKC para la detección de PKC como control de carga. El nivel de expresión o fosforilación se evaluó por densidad de banda, que se cuantificó por densitometría. La cuantificación densitométrica de las bandas se analizó utilizando el software Syngene (Synoptics, Cambridge, Reino Unido).

4.8. Análisis estadístico

Los datos se obtuvieron de una sola preparación sinaptosómica y no eran independientes entre sí. Para probar la significación del efecto de un fármaco frente a un control, se utilizó una prueba t de Student de dos colas. Cuando se requería una comparación adicional (por ejemplo, si un segundo tratamiento influía en la acción del equinacósido), se utilizó un ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey. El análisis se completó a través del software SPSS (17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Los datos se expresan como media ± SEM; la significación se evaluó en p < 0.05="" para="" todas="" las="" medidas="">

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5. Conclusiones

Este es el primer estudio que demuestra que el equinacósido inhibe la liberación de glutamato de los sinaptosomas cerebrocorticales de rata al reducir la entrada de Ca2 más a través de los canales Cav2.2 y Cav2.1, y esta inhibición de la liberación probablemente depende de la supresión de la vía de la proteína quinasa C, al menos en parte. El presente hallazgo es valioso porque proporciona una visión novedosa de los mecanismos de acción del equinacósido en el cerebro.

Agradecimientos: Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Contribuciones de los autores: Tzu Yu Lin y Su Jane Wang concibieron y diseñaron los experimentos; Cheng Wei Lu realizó los experimentos; Cheng Wei Lu y Shu Kuei Huang analizaron los datos; Su Jane Wang escribió el artículo.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflictos de interés.

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