Parte 1: Establecimiento del modelo experimental simultáneo de osteoporosis combinado con la enfermedad de Alzheimer en ratas y los efectos duales del equinacósido y el acteósido de Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
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Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
RESUMEN
Relevancia etnofarmacológica: Cistanche tubulosaes una preciosa medicina tradicional china que ha sido ampliamente utilizada en el tratamiento de la osteoporosis yenfermedad de alzheimer. equinacósidoy el acteósido son los principales componentes activos de Cistanche tubulosa que tienen actividades farmacológicas con valor para la investigación. Se ha informado que el equinacósido yacteósidopodría mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria, promover la proliferación y diferenciación de osteoblastos. Objetivo del estudio: echinacósido y acteósido deCistanche tubulosahan mostrado actividades significativas contra la osteoporosis y contra la enfermedad de Alzheimer, mientras que estos efectos no se han estudiado simultáneamente en un modelo de rata. El objetivo de este estudio fue establecer y verificar el modelo de osteoporosis combinado conenfermedad de alzheimeren ratas e investigar los efectos dobles deechinacósidoy acteósido en este modelo concurrente.
Materiales y métodos:Se establecieron al mismo tiempo tres grupos modelo de ovariectomía (OVX), cirugía simulada con D-galactosa y AlCl3 (D), ovariectomía con D-galactosa y AlCl3 (OVX más D). Las ratas de los grupos de tratamiento farmacológico fueron ovariectomizadas. Mientras se realizaba la inyección intraperitoneal de D-galactosa y la administración intragástrica de AlCl3 en las ratas de los grupos de tratamiento farmacológico, a las ratas se les administró por vía oralechinacósido(90 mg/kg/día),acteósido(90 mg/kg/d), y los fármacos de control positivo de valerato de estradiol (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d), respectivamente. Después del tratamiento farmacológico de 8 semanas, se realizó por primera vez la prueba de Morris Water Maze (MWM) durante 6 días. A continuación, las ratas se sacrificaron para recoger sangre, útero, fémur, tibia y tejido cerebral. El suero se utilizó para pruebas bioquímicas. Los úteros se usaron para histomorfometría. Los fémures derechos se utilizaron para Micro-Connecticute histomorfometría, respectivamente. Las tibias derechas se utilizaron para la prueba biomecánica. El hipocampo recogido en la nevera se utilizó para pruebas bioquímicas. El cerebro 41 recogido por perfusión se usó para histomorfometría.
Resultados:En comparación con el grupo Sham, el grupo OVX más D podría reducir significativamente la capacidad de aprendizaje y memoria al causar daño oxidativo, dañar las neuronas en el hipocampo y afectar la hidrólisis y síntesis de acetilcolina. Mientras tanto, las actividades de BALP y TRAP en el grupo OVX más D aumentaron significativamente (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinacósidoyacteósido, las características patológicas típicas de la osteoporosis yenfermedad de alzheimerfueron mejorados.
Conclusiones:El modelo de osteoporosis combinado conenfermedad de alzheimeren ratas fue factible y se estableció con éxito.equinacósidoy acteoside también mostraron algunos efectos significativos en este modelo concurrente, y podrían ser candidatos potenciales 56 deCistanche tubulosacon efectos dobles en estudio.
Palabras clave:osteoporosis; enfermedad de Alzheimer; efectos duales; equinacósido; acteósido; Cistanche tubulosa
CIstanche Las hierbas del imperio perdido mejoran la enfermedad de Alzheimer.
1. Introducción
La osteoporosis es una enfermedad ósea degenerativa caracterizada por una pérdida progresiva de masa ósea y destrucción de la microarquitectura, lo que puede aumentar el riesgo de fractura por fragilidad (Rachner et al., 2011).enfermedad de alzheimer(AD) es una enfermedad neurodegenerativa común en los ancianos que se caracteriza por deterioro mental continuo, deterioro cognitivo y pérdida de la capacidad de vida independiente en clínica (Reitz 76 et al., 2011). La formación de placa senil inducida por el depósito de -amiloide, los ovillos neurofibrilares causados por la hiperfosforilación de tau y la degeneración neuronal en el cerebro son las características patológicas típicas de la EA (Serrano-Pozo et al., 2011). Superficialmente, OP y AD son enfermedades completamente independientes con diferentes patologías y características clínicas. Sin embargo, a menudo se observa que OP y AD coexisten en la práctica clínica (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). La prevalencia de ambas enfermedades aumentó con la edad, especialmente en mujeres posmenopáusicas (Li et al., 2017; Stern, 2012). Cada vez más evidencia indica que las personas diagnosticadas con EA tienen un mayor riesgo de OP (Zhou et al., 2014).
Es necesario estudiar y esclarecer las relaciones entre osteoporosis yenfermedad de alzheimerin vitro e in vivo. Antes de realizar los estudios in vivo, es importante seleccionar los modelos animales aplicables de osteoporosis o enfermedad de Alzheimer. El modelo de osteoporosis podría establecerse mediante varios tipos de métodos, como la administración intragástrica de ácido retinoico, la cirugía de ovariectomía y la inyección intramuscular de glucocorticoides (Wei et al., 2007; Komori, 2015). En particular, el modelo de osteoporosis posmenopáusica inducida por ovariectomía en ratas fue clásico yha sido ampliamente utilizado en la mayoría de los estudios (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).La enfermedad de Alzheimer esporádica es el principal tipo de enfermedad de Alzheimer. El animalmodelos de esporádicosenfermedad de alzheimerpuede ser inducido por varios métodos tales comoinyección de D-galactosa o -amiloide, administración intragástrica de AlCl3,y así(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). además, elmodelo de conjunción de la enfermedad de Alzheimer inducida por intraperitoneal a largo plazoTambién se ha estudiado mucho la inyección de D-galactosa combinada con ovariectomía (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Con el fin de revelar la relevancia de la osteoporosis yenfermedad de Alzheimer, es necesario establecer el modelo de osteoporosis combinadacon la enfermedad de Alzheimer para estudiar los mecanismos comunes de los medicamentos enosteoporosis yenfermedad de alzheimerPlaza bursátil norteamericana.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight es una planta parásita, que se distribuye principalmente en los desiertos del noroeste de China. Los tallos suculentos secos deCistanche tubulosa(CT) se utilizan como un medicamento tónico famoso llamado Cistanches Herba con su nombre chino de Roucongrong en la Farmacopea China (2015). Ha sido honrado como “ginseng de los desiertos” y es ampliamente utilizado para el tratamiento de dolores de cintura y rodilla, esterilidad femenina y estreñimiento en la medicina tradicional china (Jiang and Tu, 2009). Los principales constituyentes activos de CT son los glucósidos feniletanoides (PhGs), el equinacósido (ECH) yacteósido(ACT) son los compuestos representativos en PhG (Morikawa et al., 2014). En particular, ECH y ACT se seleccionan típicamente como marcadores para el control de calidad en CT debido a su alto contenido y diversas actividades farmacológicas, como los efectos de neuroprotección, protección ósea,
antioxidantes, antienvejecimiento y mejora de la capacidad de aprendizaje y memoria (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Sin embargo, los efectos de ECH y ACT sobre la osteoporosiscombinado conenfermedad de alzheimeraún no se habían estudiado juntos en un modelo de rata.Por lo tanto, el propósito de este estudio fue establecer un modelo de rata de osteoporosis combinadacon la enfermedad de Alzheimer y explorar los efectos deechinacósidoy acteoside en estemodelo concurrente, a fin de proporcionar evidencia experimental para un mayor estudio de lamecanismo molecular de echinacoside o acteoside en la siguiente investigación.
cistanche pharma especialporANUNCIO
2. Materiales y métodos
2.1. animales
Se adquirieron ratas Wistar hembra de ochenta 8-semanas de edad (Número de certificado: SCXK 2018-0006), con un peso de 180~200 g, de Sino-British SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, China) y criado en el Centro Experimental de Animales Farmacéuticos en la Universidad Farmacéutica de China.
2.2. Sustancias químicas y reactivos
El hidrato de cloral, la penicilina G sódica, la D-galactosa, el hexahidrato de cloruro de aluminio, el valerato de estradiol y el clorhidrato de donepezilo se adquirieron de Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China).equinacósido(HPLC 94 por ciento) se obtuvo de Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China).Acteósido(HPLC 98 por ciento) se adquirió de Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China). Los kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de fosfatasa alcalina específica para huesos (BALP), fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), superóxido dismutasa (SOD), malonaldehído (MDA), acetilcolinesterasa (AChE) y colina acetiltransferasa (ChAT) se adquirido de Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). El fijador tisular universal se obtuvo deChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China).
echinacósido
2.3. Modelos animales y tratamientos.
Todos los experimentos con animales fueron autorizados y supervisados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Farmacéutica de China. Las ratas se mantuvieron con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas en una habitación con temperatura controlada (22±2 grados) y se alimentaron con forraje peletizado estándar y agua del grifo.
Después de la adaptación de una semana, se logró el modelo de osteoporosis mediante la realización de una cirugía de ovariectomía (French et al., 2008). Una vez finalizada la operación, se roció penicilina G sódica sobre la sutura de la herida una vez para prevenir infecciones. A continuación, las ratas se alimentaron normalmente durante tres semanas. Según la referencia (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), el modelo deenfermedad de alzheimerpodría inducirse mediante inyección intraperitoneal a largo plazo de D-galactosa combinada con ovariectomía o administración intragástrica a largo plazo de AlCl3. Para estudiar la viabilidad del modelo de osteoporosis combinada con enfermedad de Alzheimer, tres grupos modelo de ovariectomía (grupo OVX), cirugía simulada con inyección intraperitoneal de 150 mg/kg/d de D-galactosa y administración intragástrica de 30 mg/kg/d de AlCl3 (grupo D), la ovariectomía con inyección intraperitoneal de 150 mg/kg/d de D-galactosa y la administración intragástrica de 30 mg/kg/d de AlCl3 (grupo OVX más D) se establecieron en este estudio.
Por lo tanto, las ratas se dividieron aleatoriamente en ocho grupos (n{{0}} para cada grupo) después de 3 semanas y se trataron por vía oral con medicamentos durante 8 semanas: grupo simulado; grupo OVX; grupo D; grupo OVX más D; grupo de tratamiento con valerato de estradiol (grupo EV, OVX más D más 0,6 mg/kg/día de valerato de estradiol); grupo de tratamiento con clorhidrato de donepezilo (grupo DPZ, OVX más D más 0,8 mg/kg/d de clorhidrato de donepezilo);echinacósidogrupo de tratamiento (grupo ECH, OVX más D más 90 mg/kg/día de equinacósido);acteósidogrupo de tratamiento (grupo ACT, OVX más D más 90 mg/kg/d de acteósido). De acuerdo con el principio de conversión de dosis equivalente en humanos y ratas y la dosis de la referencia relacionada (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), se adoptaron las dosis de los grupos de tratamiento farmacológico en este estudio.
El peso corporal de cada rata se midió cada semana. Después de todo el tratamiento con medicamentos que duró 8 semanas, se realizó por primera vez la prueba de Morris Water Maze (MWM) durante 6 días. Posteriormente, se sacrificaron 6 ratas de cada grupo para recolectar los materiales. Las ratas se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 3,0 ml/kg de hidrato de cloral al 10 por ciento, y se recogió sangre de la aorta abdominal. La sangre se colocó a temperatura ambiente para coagular y se centrifugó a 3500 r/min durante 10 min. El suero se recogió en un tubo de centrífuga de 1,5 ml (NEST Biotechnology) y se almacenó a -80 grados hasta que se usó para las pruebas bioquímicas. A continuación, se recogieron los úteros, fémures, tibias y tejidos cerebrales. Los úteros se usaron para histomorfometría. Los fémures derechos se utilizaron para Micro-CT e histomorfometría, respectivamente. Las tibias derechas se utilizaron para la prueba biomecánica. El hipocampo recogido en la nevera se utilizó para pruebas bioquímicas. Después de eso, las otras tres ratas de cada grupo fueron perfundidas desde el corazón con solución salina y fijador de tejido universal para recolectar el cerebro para histomorfometría.
2.4. Prueba del laberinto de agua de Morris (MWM)
Las ratas se sometieron a pruebas de memoria y aprendizaje de referencia espacial en la prueba MWM después de 8 semanas de intervención. La prueba de MWM se realizó siguiendo los métodos informados anteriormente (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Brevemente, durante 5 días consecutivos con cuatro intentos por día, se entrenó a las ratas para que usaran una variedad de señales visuales ubicadas en la pared de la piscina para encontrar una plataforma sumergida escondida (diámetro 11 cm, altura 29 cm) en una piscina circular (diámetro 130 cm, altura 29 cm). altura 50 cm) lleno de agua teñida con tinta de carbón no tóxica. La piscina se dividió imaginariamente en cuatro cuadrantes, y cuatro posiciones de inicio se ubicaron en las intersecciones de los cuadrantes. La plataforma estaba ubicada en el centro de uno de los cuadrantes y la posición fue constante durante los ensayos. En cada prueba, las ratas se colocaron al azar en lugares seleccionados, mirando hacia la pared de la piscina. Cada ensayo finalizó cuando la rata llegó a la plataforma o después de 60 s, y el tiempo transcurrido se registró como latencia de escape. Las ratas que no pudieron alcanzar la plataforma fueron guiadas hacia ella. Después de cada ensayo de plataforma oculta, la rata permaneció en la plataforma durante 10 s. El tiempo de latencia promedio de cuatro intentos por día se calculó como los resultados del entrenamiento. El día 6, todas las ratas se sometieron a una prueba de sonda en la que nadaron durante 60 s en la piscina sin plataforma. Los tiempos de cruce en la ubicación de la plataforma y el tiempo de viaje en el cuadrante objetivo se registraron como resultados finales. Las ratas fueron monitoreadas por una cámara montada en el techo directamente encima de la piscina, y todos los ensayos fueron grabados y analizados usando el programa MORRIS MAZE que proporcionó Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Beijing, China)
2.5. Prueba bioquímica por ELISA
De acuerdo con las instrucciones del fabricante de los kits ELISA, BioTek Synergy analizó la actividad de la fosfatasa alcalina específica de los huesos (BALP), la actividad de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP), la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) y el contenido de malondialdehído (MDA) en el suero. 2 lectores de microplacas multimodo (BioTek, EE. UU.). Los tejidos del hipocampo de cada grupo se lavaron con PBS (0,01 M, pH 7,4) para eliminar la sangre o las impurezas que quedaban en la superficie del tejido. Los tejidos del hipocampo de un lado se pesaron y luego se cortaron en trozos lo más pequeños posible. Los tejidos del hipocampo se homogeneizaron según la proporción de 1:9 (peso del tejido: volumen de PBS). El homogeneizado se centrifugó a 4 grados, 3000 r/min durante 15 min. El sobrenadante se recogió y diluyó para medir la concentración de proteína por el método BCA. La actividad de acetilcolinesterasa (AChE), la actividad de colina acetiltransferasa (ChAT), la actividad de superóxido dismutasa (SOD) y el contenido de malondialdehído (MDA) en el tejido del hipocampo se analizaron luego mediante métodos ELISA.
2.6. Histomorfometría del hipocampo
Los tejidos cerebrales (n=3/grupo) se fijaron en fijador tisular universal. Luego, las muestras de tejido cerebral se lavaron, deshidrataron con etanol en gradiente, se incluyeron en cera de parafina y se cortaron en secciones coronales de 5 μm. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Después de eso, las secciones coronales de los tejidos cerebrales se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon, Japón). Se observaron especialmente los cambios morfológicos de CA1, CA2, CA3 y DG en el hipocampo.
2.7. Histomorfometría y morfometría uterina
Los úteros seleccionados (n{{0}}/grupo) se fijaron en fijador universal de tejidos. Luego, las muestras de tejido del útero se lavaron, se deshidrataron con etanol en gradiente, se incluyeron en cera de parafina y se cortaron en secciones transversales de 5 μm. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Se observaron y fotografiaron las secciones transversales de los úteros. Se seleccionaron al azar cinco campos de visión, luego se midió el diámetro de la sección transversal uterina y el grosor del epitelio de la mucosa uterina utilizando el software Image-Pro Plus 6.0. También se contó el número de glándulas uterinas en la lámina propia.
2.8. Micro-CT
Los fémures derechos seleccionados (n=3/grupo) se escanearon en una posición con la distancia del objeto a la fuente de 121 mm y la distancia de la cámara a la fuente de 171 mm utilizando un SkyScan 1176 micro X- tomografía computarizada de rayos (Micro-Connecticut) escáner (Bruker, Alemania). La placa de crecimiento distal se seleccionó como superficie de referencia. Con una distancia de 1 mm por debajo de la superficie de referencia, se seleccionó una región de 1,8 mm de espesor como volumen de interés (VOI, 100 capas). Las imágenes en escala de grises resultantes tenían un tamaño de píxel de 17,76 μm de la reconstrucción ósea (65 kV, 385 μA). Se empleó un método de contorneado semiautomático para seleccionar las trabéculas del hueso cortical. Se utilizaron métodos de medición 3D directos para evaluar el porcentaje de volumen óseo (BV/TV), la densidad de la superficie ósea (BS/TV), la separación trabecular (Tb. Sp), el número trabecular (Tb. N), el grosor trabecular (Tb. Th) , índice de modelo de estructura (SMI), factor de patrón trabecular (Tb. Pd) y densidad mineral ósea media (DMO media) para el mismo VOI utilizando elConnecticutPrograma Analyzer (Bruker, Alemania). La visualización 3D del VOI utilizando un algoritmo de renderizado adaptativo se realizó con el software CTvol (Bruker, Alemania).
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2.9. Histomorfometría ósea
Los fémures derechos seleccionados (n=3/grupo) se fijaron en un fijador universal de tejidos y luego se descalcificaron en una solución de EDTA-2Na al 10 por ciento durante 3 semanas. Las muestras descalcificadas se lavaron, deshidrataron con gradiente de etanol, se embebieron en parafina y se cortaron en secciones longitudinales de 5 μm. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Se fotografiaron las secciones longitudinales de los fémures. Se observaron las estructuras de tejido óseo de cada grupo, especialmente las estructuras de hueso trabecular.
2.10. Prueba biomecánica
Las tibias derechas (n=4/grupo) seleccionadas al azar se evaluaron para la prueba de flexión de tres puntos usando una máquina de prueba universal (SHIMADZU, Japón). Los diámetros de estas muestras se midieron con un pie de rey en el rango de 2,16-2,38 mm (d). A continuación, la muestra se colocó sobre dos travesaños de soporte con una distancia de 25 mm (L) entre los dos rieles y la curvatura fisiológica de la muestra fue hacia arriba. La barra de carga de la carga se ubicó en el centro del espécimen y se dejó caer a una velocidad constante de 1,5 mm/min hasta que se rompió el espécimen. Los datos de fuerza (F) y desplazamiento se registraron automáticamente en una computadora conectada a la máquina de prueba y la curva de carga-deformación se trazó simultáneamente. Los valores de carga máxima (N) y absorción de energía (mJ) fueron registrados por el software de prueba de materiales TRAPEZIUM X al mismo tiempo. Los valores de tensión máxima (MPa) se calcularon según la siguiente fórmula: Esfuerzo (σ)=momento flector (M) / factor de sección (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. análisis estadístico
Los resultados de los grupos modelo se compararon con el grupo Sham, y los de los grupos tratados con fármacos se compararon con el grupo OVX más D. Los datos se analizaron usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni usando el software Graph Pad Prism 5.0. Los datos se expresaron como media ± DE, y los valores de P inferiores a 00,05 se consideraron estadísticamente significativos.
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