Galectin-3 posee efectos antinecroptóticos y antiapoptóticos en la necrosis tubular aguda inducida por cisplatino

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Suhail Al-Salama y otros

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Resumen

Antecedentes/Objetivos:Agudoriñón(AKI) es una carga de salud pública con mayor morbilidad, mortalidad y costo de atención médica. Se asocia con un mayor riesgo para el desarrollo de enfermedades crónicas.riñónenfermedad y muerte. La necrosis tubular aguda (ATN) es la causa más común de LRA. La apoptosis y la necrosis tisular juegan un papel importante en la ATN. Se sabe que la galectina 3 (GAL-3), una lectina de unión a beta galactósido, tiene un papel en la inflamación, la apoptosis y el estrés oxidativo, pero su papel en la necrosis tubular aguda inducida por cisplatino no está claramente aclarado.

Métodos:Se usaron ratones machos C57B6-J y C57BL-6 –GAL-3 knock-out para inducir ATN usando un modelo de ratón con cisplatino de necrosis tubular aguda. Expresión de GAL-3, proteínas apoptóticas, necróticas y necroptóticas enriñonesse midieron utilizando técnicas estándar de ensayo histológico, inmunohistoquímico y de inmunoabsorción ligado a enzimas. Los datos se presentaron como media ± SE Diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Resultados:Hubo un aumento significativo en GAL-3 enriñonesde ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con sus ratones de control. Además, hubo porcentajes significativamente más altos de ATN, niveles más altos de urea y creatinina en plasma, y ​​niveles más altos de catepsina B y catepsina D, en elriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino. Asimismo, hubo niveles significativamente más altos de proteínas de necroptosis RIPK1, RIPK3 y MLKL enriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino. Además, hubo niveles significativamente más altos deriñónproteínas proapoptóticas; caspasa escindida-3, PARP escindida, TRAIL y FAS en ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino.

Conclusión:GAL-3 puede afectar la supervivencia y muerte celular a través de su interacción con proteínas necroptósicas, apoptóticas y pro-supervivencia en los túbulos renales durante la necrosis tubular aguda inducida por cisplatino.

Palabras clave: Riñón• Necrosis tubular aguda • Cisplatino • Galectina-3 • Necroptosis • Apoptosis

Introducción

Agudoriñónlesión (AKI) se caracteriza por una reducción abrupta enriñónfunción basada en una elevación en el nivel de creatinina sérica, una reducción en la producción de orina, la necesidad de terapia de reemplazo renal o una combinación de estos factores [1].

losRiñónLa guía de práctica clínica para mejorar el resultado global de la enfermedad (KDIGO, por sus siglas en inglés) para la LRA define la LRA como un aumento de la creatinina sérica mayor o igual a 0,3 mg/dl (mayor o igual a 26,5 µmol/l) dentro de 48 horas; o un aumento en la creatinina sérica mayor o igual a 1,5 veces el valor inicial, que se sabe o se presume que ocurrió dentro de los 7 días anteriores; o volumen de orina<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

La necrosis tubular aguda (NTA) es una causa frecuente de LRA [3]. Los delitos isquémicos y nefrotóxicos son las principales causas de NTA [3]. A pesar de los extensos estudios sobre ATN, que incluyen daño celular, muerte celular y regeneración, los mecanismos subyacentes no están claramente definidos.

La apoptosis es una forma de muerte celular programada mediada por caspasas. Informes significativos han demostrado que la apoptosis juega un papel importante en la ATN [3, 4]. Por otro lado, la necrosis es una forma de muerte celular caracterizada por la permeabilización temprana de la membrana plasmática, la inflamación de los orgánulos y la desintegración del contenido celular [5]. La necrosis ocurre con frecuencia cuando las células se enfrentan a un estrés externo excesivo. La necrosis se ha considerado tradicionalmente como pasiva y no programada; por lo tanto, se han realizado muy pocos esfuerzos para investigar el mecanismo de la necrosis, a pesar de su prevalencia en enfermedades humanas [5]. Un tipo bien reconocido de necrosis es la necroptosis [5]. La necroptosis es una muerte celular programada no apoptótica inducida por una serie de estímulos extracelulares, como el factor de necrosis tumoral (TNF) [5]. Originalmente se definió como muerte celular caracterizada por una morfología de muerte celular necrótica con activación concomitante de la serina/treonina-proteína quinasa 1 que interactúa con el receptor (RIPK1). RIPK1 activa la serina/treonina-proteína quinasa 3 que interactúa con el receptor (RIPK3) para formar un complejo que se llama necrosoma [6]. Más tarde, el RIPK3 activado gana la capacidad de fosforilar y activar el dominio de quinasa de linaje mixto (MLKL) [6]. Las moléculas de MLKL fosforiladas son capaces de formar oligómeros para facilitar su translocación a la membrana celular mediante la unión a lípidos de fosfatidilinositol y cardiolipina. Los oligómeros de MLKL translocados actúan como canales en la membrana celular para inducir la entrada de iones de sodio y la salida de iones de potasio [7] o, alternativamente, una entrada de iones de calcio [8]. En ambos sentidos, esto conducirá a la muerte celular necrótica a través de la permeabilización y ruptura de la membrana plasmática, lo que provocará el derrame del contenido intracelular en el órgano.

En este proyecto hemos utilizado cisplatino (Cis) para inducir necrosis tubular aguda. Cis tiene una amplia gama de efectos antitumorales y se ha utilizado para tratar varios tumores malignos [9]. Sin embargo, la nefrotoxicidad es el principal efecto secundario y se caracteriza por necrosis de las células tubulares renales, daño tisular, disfunción renal y hemorragia aguda.riñónfracaso [10]. A pesar de las diversas medidas que se han tomado para superar la lesión renal, casi el 4-23 por ciento de los pacientes se ven afectados por AKI [11]. Los mecanismos conocidos de lesión renal inducida por cisplatino incluyen apoptosis, estrés oxidativo y respuesta inflamatoria debido a la lesión directa de las células epiteliales tubulares renales y los vasos renales [12].

La galectina-3 (GAL-3), proteína de 35 kDa, es una quimera única que tiene un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) C-terminal conectado a un dominio N-terminal largo (ND) [13 ].GAL-3 se encuentra en la superficie celular, el citoplasma y el núcleo de las células, así como en la matriz extracelular [13].

La GAL-3 intracelular se ha implicado en la proliferación celular y en los mecanismos antiapoptóticos [14, 15]. Afecta a las proteínas K-Ras y Akt y, por lo tanto, también regula la diferenciación, la supervivencia y la muerte [14, 15]. Mientras que la GAL extracelular-3 media la adhesión célula-célula, la interacción y señalización célula-matriz, la inflamación y la apoptosis [16].

Se ha demostrado que GAL-3 se transloca desde el citosol o desde el núcleo a la mitocondria después de la exposición a estímulos apoptóticos y bloquea los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial, evitando así la apoptosis [17]. Los estudios también han demostrado que GAL-3 puede inhibir la apoptosis inducida por TNF a través de la activación de AKT [18]. Otros estudios han demostrado que GAL-3 y Beclin1 están implicados en dos vías coordinadas de muerte celular programada, apoptosis y autofagia [18]. En este proyecto, planteamos la hipótesis de que GAL-3 tiene un papel protector sobre el epitelio tubular renal en la lesión tubular aguda. Hemos utilizado un modelo murino de lesión tubular aguda para investigar el papel protector de GAL-3 en la lesión tubular aguda inducida por cisplatino mediante la medición de las funciones renales (urea plasmática y creatinina),riñónproteínas de necroptosis (RIP-1, RIP-3 y MLKL), proteínas de necrosis (catepsina D y catepsina B), proteínas de apoptosis (caspasa escindida-3, PARP escindida, TRAIL y FAS) , y marcadores de supervivencia celular (p-NF-κB, beta-catenina y Wnt), utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas estándar, un analizador bioquímico y procedimientos histológicos e inmunohistoquímicos.

Materiales y métodos

Hemos utilizado un modelo experimental de ratón de agudariñónlesión que ha sido ampliamente descrita en la literatura y utilizada para estudiarriñónlesiones en laboratorios de todo el mundo [19].

Modelo de ratón de necrosis tubular aguda

Se utilizaron ratones C57BL/6 y C57BL/6 –GAL-3 knock-out (KO) que pesaban 25-30 g. Los ratones se mantuvieron con una dieta estándar. Se alojaron cinco ratones por jaula en un programa de 12- horas de luz y oscuridad durante al menos 1 semana antes de la administración de cisplatino.

El cisplatino (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, AUSTRIA) se usó recién el día de la administración a una concentración de 0,5 mg/ml. Los ratones recibieron 30 mg/kg de peso corporal de cisplatino [11] o vehículo (solución salina normal) por vía intraperitoneal (IP), después de lo cual los ratones volvieron a tener libre acceso a alimentos y agua. El método de eutanasia comenzó con una inyección intraperitoneal de fármacos anestésicos, que incluían una combinación de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg), luego se extrajeron los riñones y se recolectaron muestras de sangre 96 horas después de la administración de cisplatino. La sangre se recogió en recipientes al vacío con EDTA.Riñonesluego se resecaron, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada, la mitad de cada riñón se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se almacenó en un congelador de -80 grados. La otra mitad se fijó inmediatamente en solución salina formal tamponada al 10 por ciento durante 24 horas. La sangre recolectada se centrifugó a 3000 RPM durante 15 minutos. El plasma se recogió, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 grados hasta su posterior análisis.

Procesamiento de muestras para extracción de proteínas

La proteína total se extrajo deriñónmuestras homogeneizándolas con tampón de lisis y recogiendo el sobrenadante después de la centrifugación. Para el lisado celular total, las muestras de riñón se descongelaron, pesaron y colocaron en un tampón de lisis frío que contenía 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2, EDTA 3 mM, glicerofosfato 20 mM, NaF 25 mM, Triton X al 1 %-100, glicerol al 10 % p/v e inhibidor de proteasa (inhibidor de proteasa completo de Roche tabletas de cóctel). Los riñones se homogeneizaron en hielo mediante un homogeneizador (IKA T25 Ultra Turrax). Luego, las muestras se centrifugaron a 14000 RPM durante 15 minutos a 4 grados, se recogió el sobrenadante, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 grados hasta su posterior análisis. La extracción de proteínas nucleares y citoplasmáticas se realizó siguiendo el protocolo descrito en otro lugar [19]. Brevemente, las muestras de riñón se descongelaron en hielo, se pesaron y homogeneizaron en hielo con tampón que contenía Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0,1 mmol/l , fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 0,5 mmol/l, sacarosa 0,32 mmol/l, ditiotreitol (DTT) 1 mmol/l, Nonidet P-40 (NP-40) 0,5 % y cóctel de inhibidores de proteasa 1 %. Los homogeneizados se centrifugaron a 800 RPM durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó y se mantuvo como fracciones citoplasmáticas. El sedimento se lavó dos veces con tampón de homogeneización sin NP-40 y se resuspendió con un tampón bajo en sal que contenía HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0,2 mmol /l. Glicerol 25 por ciento, PMSF 0,5 mmol/l y DTT 0,5 mmol/l. Después de la incubación en hielo durante 5 minutos, un volumen igual de tampón de alta salinidad que contiene HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. Se añadió glicerol al 25 por ciento, PMSF 0,5 mmol/l, DTT 0,5 mmol/l, NP-40 1 por ciento y cóctel de inhibidores de proteasa al 1 por ciento, la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos, se centrifugó a 14000 RPM durante 15 minutos a 4 grados y los sobrenadantes se guardaron como fracción nuclear. La concentración de proteínas totales se determinó mediante el método de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Procesamiento de muestras para histología

Se extirparon los riñones, se lavaron con PBS helado y se pesaron. Cadariñónse seccionó en dos mitades, y cada mitad era un casete y se fijó directamente en formalina tamponada al 10 por ciento. Las secciones se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, se aclararon con xileno y se incluyeron en parafina. Se prepararon secciones de tres µm a partir de bloques de parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina y tinciones con ácido peryódico de Schiff (PAS) usando procedimientos estándar [20]. Las secciones teñidas fueron evaluadas por el histopatólogo que participó en este proyecto.

inmunohistoquímica

Secciones de cinco µm se desparafinizaron con xileno y se rehidrataron con alcohol graduado. Luego, las secciones se colocaron en una solución de recuperación con un pH alto (pH 9) en un baño de agua a 95 oC durante 20 minutos. Luego, las secciones se lavaron con agua destilada durante 5 minutos, seguido de tampón TBST durante 5 minutos. Luego, las secciones se trataron con bloqueo de peroxidasa durante 10 minutos seguido de bloqueo de proteína durante 10 minutos. A continuación, las secciones se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-caspasa escindida-3 (Rabbit Polyclonal, 1:300, tecnología de señalización celular, Danvers, MA, EE. UU.), anticuerpo anti-PARP escindido (Rabbit Polyclonal, 1: 100, tecnología de señalización celular, Danvers, MA, EE. UU.), anticuerpo anti-beta-catenina (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), anticuerpo anti-fosfo-NF-κB (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), anti-Wnt-3 (policlonal de conejo, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), anti-RIPK1 (policlonal de conejo, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), anti-RIPK3 (policlonal de conejo, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y anti-MLKL 1 (monoclonal de conejo, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) . Después de la conjugación con los anticuerpos primarios, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario (Sistema de detección EnVisionTM, DAKO, Agilent, EE. UU.) durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de cromógeno DAB (Sistema de detección EnVisionTM, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). USA) y la contratinción se realizó con hematoxilina. Se utilizaron controles positivos apropiados. Para el control negativo, el anticuerpo primario no se añadió a las secciones. Se usaron controles positivos y negativos en cada lote de portaobjetos teñidos (no mostrados en las figuras).

Marcaje inmunofluorescente

Secciones de cinco µm se desparafinizaron con xileno y se rehidrataron con alcohol graduado. Las secciones se colocaron en solución de recuperación con un pH alto (pH 9) en un baño de agua a 95 grados durante 20 minutos. Luego, las secciones se lavaron con agua destilada durante 5 minutos, seguido de tampón TBST durante 5 minutos. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpo anti-GAL-3 (policlonal de conejo, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EE. UU.), anti-RIPK1 (policlonal de conejo, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), anti-RIPK3 1 (policlonal de conejo, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y anti-MLKL 1 (monoclonal de conejo, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones se incubaron con anticuerpo de burro anti-conejo Alexa Fluor 488 (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, EE. UU., 1:100). Finalmente, las secciones se montaron en medios de montaje solubles en agua DAPI (Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.) y se observaron con un microscopio fluorescente Olympus. Se usaron secciones de control positivo apropiadas. Para el control negativo, el anticuerpo primario no se agregó a las secciones y todo el procedimiento se llevó a cabo de la misma manera que se mencionó anteriormente. Se usaron controles positivos y negativos en cada lote de portaobjetos teñidos (no mostrados en las figuras).

Análisis morfométrico

El análisis morfométrico de la necrosis tubular aguda fue realizado por dos investigadores que participaron en este estudio. El análisis morfométrico de la expresión de caspasa escindida-3, PARP escindida, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, beta-catenina en células tubulares renales se realizó mediante el software ImageJ (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Caspasa escindida-3, PARP escindida, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, Beta-catenina, el marcaje se determinó contando el número de células positivas en células de alta potencia seleccionadas al azar. (HPF) en el riñón. El número medio de células positivas se convertirá de por HPF a por mm2 (Cada mm2= 4HPF). Para, caspasa escindida-3, PARP escindida, RIPK1, RIPK3 y Wnt-3, se consideraron las celdas de etiquetado

positivo cuando había un patrón de tinción citoplasmática. Para el marcaje de MLKL, las células se consideraron positivas cuando hubo un patrón de tinción membranosa y citoplásmica. Para el marcado de fosfo-NFK-B y beta-catenina, las células se consideraron positivas cuando hubo un patrón de tinción nuclear.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

RiñónLas concentraciones de GAL-3, catepsina D, catepsina B, caspasa escindida-3, TRAIL y FAS se determinaron utilizando el kit de desarrollo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU. ) para sándwich ELISA, utilizando el procedimiento estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de PARP divididas en riñón se determinaron usando el kit Elisa de tecnología de señalización celular (Danvers, MA, EE. UU.) para sándwich Elisa, usando el procedimiento estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de RIPK1, RIPK3 y MLKL en riñón se determinaron utilizando los kits Elisa de MyBioSource (San Diego, CA, EE. UU.) para sándwich Elisa, utilizando el procedimiento estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las lecturas de absorbancia se realizaron a 450 nm, utilizando un espectrofotómetro de placa de pocillos 96- (lector de microplacas Elisa BioTek ELx800, Winooski, VT, EE. UU.). Las concentraciones de GAL-3, catepsina D, catepsina B, caspasa escindida-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, PARP escindida y FAS en muestras de riñón se determinaron mediante interpolación a partir de una curva estándar. Los niveles se normalizaron a concentraciones de proteína total.

análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graph Pad Prism Software versión 5. Se lograron comparaciones múltiples entre los diversos grupos mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de pruebas de rango múltiple post hoc de Newman Keuls. Las comparaciones entre dos grupos se lograron mediante la prueba t de Student. Los datos se presentan en media ± error estándar (SE). Los valores de p < 0.05="" se="" consideran="">

Resultados

Necrosis tubular aguda inducida por cisplatino

El grupo salvaje GAL-3 tratado con cisplatino muestra ATN que afecta (67,29 por ciento ± 2,392) del parénquima renal (Fig. 1) con pérdida de los bordes en cepillo, hinchazón de las células tubulares, caída de células intratubulares, secreciones intratubulares y mitosis ( Fig. 2B y 3B).

El grupo GAL-3 KO tratado con cisplatino muestra ATN que afecta (78.54 por ciento ± 0.8120) del parénquima renal (Fig. 1) con pérdida de los bordes en cepillo, hinchazón de las células tubulares, caída de células intratubulares, secreciones intratubulares y mitosis (Fig. 2D y 3D).

Hay un porcentaje significativamente mayor de ATN enriñonesen ratones GAL-3 KO tratados con cisplatino que en ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 se expresa en la necrosis tubular aguda

Hay un aumento significativo en la concentración de la fracción citoplasmática de GAL-3 enriñonesen el grupo salvaje tratado con cisplatino GAL-3 (6084 ± 587,3 pg/mg) en comparación con el grupo de control salvaje GAL-3 (1620 ± 62,3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">riñonesen el GAL tratado con cisplatino-3 salvaje

(841,8 ± 41,11 pg/mg) en comparación con el grupo de control salvaje GAL-3 (429,2 ± 39,56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Tinción inmunofluorescente de representanteriñónLas secciones han mostrado una expresión significativamente mayor de GAL-3 en los túbulos renales afectados por necrosis tubular aguda (Fig. 4B-D) en comparación con los ratones de control salvajes GAL-3 (Fig. 4A).

GAL-3 es un mediador antinecroptótico

Serina/treonina-proteína quinasa 1 que interactúa con el receptor (RIPK1). Hubo un aumento significativo en la concentración de RIPK-1 (55,33 ± 3,766 pg/mg) enriñonesde ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control salvajes GAL-3 (14,22 ± 1,687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Las comparaciones múltiples entre los cuatro grupos experimentales utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Newman-Keuls fueron estadísticamente significativas (P<>

La tinción inmunohistoquímica para RIPK-1 mostró un número significativamente mayor de células que expresan RIPK-1 enriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.001), (fig.="">

Serina/treonina-proteína quinasa 3 que interactúa con el receptor (RIPK3). Hubo un aumento significativo en la concentración de RIPK-3 (616,4 ± 27,07 pg/mg) en los riñones de ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control silvestres GAL-3 (17,46 ± 7,002 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">riñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino (616,4 ± 27,07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

La tinción inmunohistoquímica para RIPK-3 mostró un número significativamente mayor de células que expresan RIPK-3 en riñones de ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino ( PAGS<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Similar al dominio de quinasa de linaje mixto (MLKL). Hubo un aumento significativo en la concentración de MLKL (71,46 ± 1,757 pg/mg) enriñonesde ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control salvajes GAL-3 (23,30 ± 0,5897 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Catepsina B. Hubo un aumento significativo en la concentración de Catepsina-B enriñonesde ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino (55,79 ± 4,141 pg/mg) en comparación con ratones de control silvestre GAL-3 (37,99 ± 1,206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">riñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino (85,87 ± 9,220 pg/mg en comparación con ratones de control silvestres GAL-3 (32,81 ± 1,570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Las comparaciones múltiples entre los cuatro grupos experimentales utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Newman-Keuls fueron estadísticamente significativas (P<>

Catepsina-D. Hubo un aumento significativo en la concentración de catepsina-D enriñonesde ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino (5145 ± 286,1 pg/mg) en comparación con ratones de control silvestre GAL-3 (4066 ± 107,7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">riñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino (6695 ± 587,7 pg/mg) en comparación con ratones de control salvaje GAL-3 (3914 ± 87,51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Las comparaciones múltiples entre los cuatro grupos experimentales utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Newman-Keuls fueron estadísticamente significativas (P<>

GAL-3 es un mediador antiapoptótico

Caspasa escindida-3. Hubo un aumento significativo en la concentración de caspasa escindida-3 (4665 ± 330,9 pg/mg) en elriñonesde ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control salvajes GAL-3 (3193 ± 75,30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinción inmunohistoquímica para la caspasa escindida-3 mostró un número significativamente mayor de células apoptóticas en los riñones de los ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en los ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

PARP escindido. Hubo un aumento significativo en la concentración de PARP escindida (1446 ± 56,97 pg/mg) en elriñonesde ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control salvajes GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinción inmunohistoquímica para PARP escindida mostró un número significativamente mayor de células positivas en riñones de ratones GAL-3 KO tratados con cisplatino que en ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Hubo un aumento significativo en la concentración de TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) enriñonesde ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control silvestres GAL-3 (86.14 ± 2.879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinción inmunohistoquímica para la caspasa escindida-3 mostró un número significativamente mayor de células apoptóticas enriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

PARP escindido. Hubo un aumento significativo en la concentración de PARP escindida (1446 ± 56,97 pg/mg) en los riñones de ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control silvestres GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/ mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">riñonesde ratones GAL-3 KO tratados con cisplatino en comparación con ratones de control GAL-3 KO (236,1 ± 11,86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

La tinción inmunohistoquímica para PARP escindida mostró un número significativamente mayor de células positivas enriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Hubo un aumento significativo en la concentración de TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) en los riñones de los ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con los ratones de control silvestres GAL-3 (86).14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">riñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino (120,9 ± 4,748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Leyenda FAS.Hubo un aumento significativo en la concentración de FAS (332,5 ± 6,395 pg/mg) en elriñonesde ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control salvajes GAL-3 (77,72 ± 2,805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">riñonesde ratones GAL-3 KO tratados con cisplatino en comparación con ratones de control GAL-3 KO (134,1 ± 3,597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Las comparaciones múltiples entre los cuatro grupos experimentales utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Newman-Keuls fueron estadísticamente significativas (P<>

GAL-3 y señales de supervivencia

NF-κB.La tinción inmunohistoquímica para fósforo-NF-κB mostró un número significativamente mayor de células teñidas con fósforo-NF-κB enriñonesde ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino que ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beta catenina.La tinción inmunohistoquímica para Beta-catenina mostró un número significativamente mayor de células teñidas con Beta-catenina enriñonesde ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino que ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt-3a.La tinción inmunohistoquímica para Wnt-3a mostró un número significativamente mayor de células teñidas con Wnt-3a en riñones de ratones salvajes GAL tratados con cisplatino-3 que GAL tratados con cisplatino-3 ratones KO (P<0.001), (fig.="" 12="">

urea plasmáticaHubo un aumento significativo en la concentración de urea en plasma (23,88 ± 6,715 mmol/l) en ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control silvestres GAL-3 (6,688 ± 0). 6066 mmol/L), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Las comparaciones múltiples entre los cuatro grupos experimentales utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Newman-Keuls fueron estadísticamente significativas (P<>

creatinina plasmática

Hubo un aumento significativo en la concentración de creatinina en plasma (48,42 ± 3,992 umol/L) en ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino en comparación con ratones de control silvestres GAL-3 (13,27 ± 0). 3106 umol/L), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Discusión

AgudoriñónLas lesiones son un problema de salud común en todo el mundo. Cada año, hay alrededor de 13,3 millones de casos deriñónlesión (IRA). Una carga que se está volviendo particularmente alta en los países emergentes [21]. A nivel mundial, hay 1,7 millones de muertes por año causadas por AKI. De eso, alrededor de 1,4 millones ocurren en países de bajos y medianos ingresos [21]. AKI a menudo se puede prevenir y tratar con solo unas pocas consecuencias para la salud a largo plazo, si es que tiene alguna. La identificación de los principales mecanismos y actores que participan en el desarrollo de la LRA se reflejará en la mejora de la atención de los pacientes y la minimización de la mortalidad y la morbilidad.

Hemos demostrado un aumento significativo en la concentración de GAL-3 enriñonessometido a LRA. También hemos demostrado una expresión significativamente mayor de GAL-3 en los túbulos renales afectados por necrosis tubular aguda en ratones silvestres GAL-3 tratados con cisplatino que en los túbulos renales del grupo de control tratado con solución salina. Tanto las concentraciones citoplásmicas como nucleares de GAL-3 aumentan significativamente en los túbulos renales después de la ATN en comparación con los ratones tratados con solución salina. El nivel elevado de GAL-3 en los túbulos renales lesionados sugiere que GAL-3 juega un papel importante en la ATN.

También hemos utilizado ratones GAL-3 KO para investigar el papel mecánico de GAL-3 en ATN. Esto nos ayuda a observar de cerca las modulaciones de las proteínas proapoptóticas, pronecroptóticas y prosupervivencia en presencia y ausencia de GAL-3 y determina si GAL-3 tiene algún efecto o no sobre estos cambios. .

Hemos demostrado un porcentaje significativamente mayor de túbulos afectados por ATN en ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino. Nuestros resultados también han mostrado un aumento significativo de la catepsina B y la catepsina D en los riñones afectados por NTA. Además, hay niveles significativamente más altos de catepsina B y catepsina D enriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino. Las catepsinas juegan un papel importante en las vías de señalización que conducen a la muerte celular apoptótica y necrótica, degradando diferentes sustratos y/o contribuyendo a la desestabilización mitocondrial [22]. Las proteasas lisosomales, la catepsina B y la catepsina D se expresan abundantemente en los riñones [23].

La catepsina B, una cisteína proteinasa que tiene una actividad óptima en un ambiente ácido, participa en muchos procesos fisiológicos y patológicos. Digiere proteínas estructurales y enzimas en la célula, degrada los elementos principales de la membrana basal y activa proenzimas, hormonas y factores de crecimiento [24]. Se han observado niveles de expresión aumentados y activación de catepsina B en la línea celular epitelial tubular proximal humana HK-2 que experimenta apoptosis [25].

La catepsina D se expresa significativamente en las células tubulares proximales. La catepsina D es una proteasa aspártica lisosomal clave que es responsable de la degradación de proteínas y orgánulos por autofagia-lisosomal, así como durante la necrosis celular y la ruptura de la membrana lisosomal [26]. La catepsina D aumenta significativamente en los túbulos lesionados después de la lesión por isquemia/reperfusión renal, lo que respalda nuestro hallazgo de un aumento significativo de la catepsina D enriñonescon necrosis tubular aguda [27].

Los niveles más altos de Catepsina B y D con un mayor porcentaje de ATN enriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino sugieren GAL-3 como mediador antinecrótico.

También hemos mostrado niveles significativamente más altos de proteínas de necroptosis; RIPK1, RIPK3 y MLKL enriñonesde ratones tratados con cisplatino. Además, hemos identificado concentraciones significativamente más altas de RIPK1, RIPK3 y MLKL en riñones de ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino.

Los estudios han demostrado que el cisplatino se asocia con un aumento del estrés oxidativo [28]. Generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), acumulación de productos de peroxidación lipídica enriñones, y se cree que los sistemas antioxidantes suprimidos son los principales mecanismos de la LRA inducida por cisplatino [29]. Dentro de la célula, el cisplatino se convierte en una forma altamente reactiva que reacciona rápidamente con moléculas antioxidantes que contienen tiol, como el glutatión [30]. El cisplatino también puede causar disfunción mitocondrial y aumento de la producción de ROS a través de una cadena respiratoria alterada [31]. ROS facilita la autofosforilación de RIPK1 y promueve el reclutamiento de RIPK-3 y la formación de necrosomas [32]. Además, ROS es un inductor crítico de la permeabilidad de la membrana lisosomal (LMP) [33].

Cay et al. [34] han demostrado que la LMP mediada por ROS está involucrada en la inducción de necroptosis en células de disco intervertebral de conejo. Del mismo modo, la producción de ROS mitocondrial inducida por RIPK1- es seguida por LMP y disfunción mitocondrial como resultado de un ciclo de retroalimentación positiva entre Ca2 plus y JNK, lo que lleva a la necroptosis de las células A549 y H1299 [35, 36].

Además, se ha demostrado que la RIPK3 regulada al alza en la necroptosis induce estrés en el retículo endoplásmico, lo que aumenta la concentración celular de Ca2+ y la expresión de xantina oxidasa, lo que conduce a una mayor generación de ROS [37].

Las catepsinas B y D son los principales contenidos funcionales liberados de los lisosomas con un aumento de LMP durante el proceso de muerte celular [34]. La activación de las catepsinas B y D puede aumentar la vía necroptótica [38]. Por lo tanto, la necroptosis puede inducirse de manera independiente del receptor [39]. Además, los informes han demostrado que existen estímulos adicionales, además de ROS, catepsina B y D, para la inducción de necroptosis y estos incluyen la regulación positiva de TRAIL y las proteínas leyenda FAS [40]. Por lo tanto, el aumento de ROS, ya sea debido al cisplatino o a la inducción de RIPK1 o RIPK3, puede provocar un aumento de LMP y la liberación de catepsina B y D, lo que a su vez aumenta la necroptosis. Del mismo modo, el aumento de ROS puede activar RIPK1, reclutamiento de RIPK3, mejora de la formación de necrosomas, fosforilación de MLKL, translocación de MLKL fosforilado a la membrana celular que conduce a la muerte celular necrótica a través de la permeabilización y ruptura de la membrana plasmática.

En este estudio, creemos que el aumento de ROS, catepsina B, catepsina D, TRAIL y FAS están involucrados en la inducción de necroptosis en ATN.

Para determinar el papel de GAL-3 en la necroptosis, hemos medido las concentraciones de RIPK1, RIPk3 y MLKL en presencia y ausencia de GAL-3 usando GAL-3 salvaje y GAL{{5 }} KO ratones.

Las concentraciones significativamente más altas de RIPK1, RIPK3 y MLKL en ratones GAL-3 KO tratados con cisplatino que en ratones GAL-3 tratados con cisplatino indican que la eliminación de GAL-3 está asociada con una aumento significativo en las proteínas de necroptosis, lo que sugiere un papel anti-necroptótico de GAL-3.

Además, hemos mostrado niveles significativamente más altos de proteínas proapoptóticas; caspasa escindida-3, PARP escindida, TRAIL, FAS y cuerpos apoptóticos enriñonessiguiente ATN.

Durante la ATN, la permeabilización de la membrana lisosomal permite la translocación de la catepsina D y la catepsina B desde el lisosoma hacia el citosol, donde puede ejercer su función proapoptótica. La catepsina D citosólica escinde la proteína Bid en tBid, lo que desencadena la inserción de la proteína Bax en la membrana mitocondrial. Esto conduce a la liberación de citocromo c de la mitocondria al citosol y a la activación de las procaspasas 9 y 3 [41]. En este estudio, tanto la tinción inmunofluorescente como la concentración de proteínas han mostrado una expresión significativamente mayor de GAL-3 intracelular, tanto en fracciones citoplasmáticas como nucleares, en ATN enriñonesde ratones salvajes GAL-3 en comparación con ratones de control.

Entonces, los niveles más altos de proteínas pro-apoptóticas; caspasa escindida-3, TRAIL, FAS y cuerpos apoptóticos enriñonesde ratones KO GAL-3 tratados con cisplatino que en ratones salvajes GAL-3 tratados con cisplatino sugiere un papel antiapoptótico de GAL-3. Se ha encontrado que GAL-3 está críticamente involucrado en la apoptosis dependiendo de su localización subcelular. Los estudios han demostrado que la GAL-3 intracelular puede inhibir la apoptosis [42-44]. En apoyo de la función antiapoptótica de GAL-3, hemos identificado un número significativamente mayor de células que expresan fosfo-NF-κB, beta-catenina y proteínas Wnt en riñones de GAL tratados con cisplatino{{15} } ratones salvajes que ratones GAL-3 KO. NF-κB es un factor de transcripción que desempeña un papel importante en la regulación de la inflamación, la proliferación celular y la supervivencia celular. La fosforilación juega un papel fundamental en la activación de NF-κB aguas abajo de todos estos estímulos [45]. NF-κB ahora se reconoce como un importante contribuyente a la supervivencia celular y la protección contra la apoptosis [46]. Se ha demostrado que las proteínas Wnt tienen efectos protectores sobre las células lesionadas a través de su función antiapoptótica a través de la activación de -catenina y c-Myc [47].

Wu et al. también han mostrado un aumento significativo en p-NF-κB enriñonescon ATN [48]. Wang et al. también han demostrado una regulación positiva de la vía de señalización Wnt/-catenina en la lesión renal aguda [49]. Los estudios han demostrado que NF-κB está involucrado en la inducción de GAL-3 [50], así como GAL-3 está involucrado en la activación de NF-κB [51]. Curiosamente, se ha descubierto que GAL-3 es un nuevo socio de unión de -catenina [52].

Estos hallazgos sugieren que el papel antiapoptótico de GAL-3 también puede estar mediado por la activación de las vías NF-κB y Wnt/-catenina. GAL-3 parece vincular estas vías de transducción de señales favorables a la supervivencia investigadas en nuestro estudio. Estas vías también tienen intercomunicación entre ellas en varios niveles. Los jugadores de la vía Wnt/-catenina modulan muchos de sus efectos a través de la interacción con NF-κB y, recíprocamente, NF-κB también influye en la vía de señalización Wnt/-catenina [53]. Por lo tanto, es comprensible que GAL-3 desempeñe un papel de conector central en las vías de transducción de señales prosupervivencia.

Nuestro estudio demuestra que la presencia o ausencia de GAL-3 intracelular está asociada con cambios significativos en las proteínas proapoptóticas, pronecroptóticas y de supervivencia en la NTA inducida por cisplatino y que los altos niveles de GAL-3 en los túbulos renales son mediando un entorno antiapoptótico, antinecroptótico y de supervivencia que puede dar forma al curso futuro de la enfermedad. Esto sugiere un papel protector para GAL-3 en la ATN aguda inducida por cisplatino, que está respaldado por niveles plasmáticos significativamente más bajos de urea y creatinina en ratones salvajes tratados con GAL-3 que con GAL-3 Ratones tratados con cisplatino KO (Fig. 13).

Conclusión

GAL-3 puede afectar la supervivencia y muerte celular a través de su interacción con proteínas necroptósicas, apoptóticas y pro-supervivencia en los túbulos renales durante la necrosis tubular aguda inducida por cisplatino.

Expresiones de gratitud

Contribuciones de autor

Todos los autores revisaron y aprobaron la versión enviada del manuscrito. SA introdujo el concepto, diseñó el estudio, analizó e interpretó los datos, diseñó las cifras y escribió el artículo. GJ realizó experimentos con animales y la técnica ELISA, MS realizó tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescente y procesamiento de tejidos relacionados. HT realizó experimentos con animales y técnica ELISA. JY realizó un análisis bioquímico de la función renal y presentó los datos resultantes.

Declaración de divulgación

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

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