Parte 1 | El extracto de Herba Cistanche mejora la generación de ATP mitocondrial en corazones de rata y células H9c2

Contacto: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung y Kam Ming Ko

Departamento de Bioquímica, Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong, Clear Water Bay, HONG Kong SAR, China

Palabras clave: ATP,Cistanche deserticola, células H9c2, corazón, mitocondrias

Abstracto

Investigar la base farmacológica de laYang- vigorizante" acción de Herbal Cistanche [la planta entera seca deCistanche deserticolaY.C. Ma (Orobanchaceae)], en medicina china, los efectos del extracto de metanol de Herba Cistanche sobre la capacidad de generación de ATP mitocondrial se examinaron utilizando un modelo de corazón de rata ex vivo y un ensayo de células H9c2 in situ. El tratamiento con extracto de Herba Cistanche aumentó la capacidad de generación de ATP mitocondrial miocárdico de manera dependiente de la dosis en ratas, según lo evaluado por medición in vitro. La estimulación de la capacidad de generación de ATP se asoció con una mejora paralela en el transporte de electrones mitocondriales apoyado por piruvato pero no por succinato. El tratamiento con Herba Cistanche también aumentó las actividades del complejo mitocondrial miocárdico I y del complejo III, siendo mayor el grado de estimulación en la actividad del complejo I. El tratamiento con Herba Cistanche produjo un aumento dependiente de la dosis y el tiempo en la capacidad de generación de ATP mitocondrial en las células H9c2. Los resultados indican que el tratamiento con Herba Cistanche puedeaumentar la generación de ATP mitocondrialen corazones de rata ex vivo y células H9c2 in situ, posiblemente a través demejorar la fosforilación oxidativa.

Cistanche puede mejorar la función cardíaca, disminuir la presión arterial y disminuir los lípidos en la sangre

Introducción

La "vigorización Yang", que encarna la mejora generalizada de la función corporal en la medicina china, implica el uso de energía para impulsar varios procesos bioquímicos.

En este sentido, el ATP, que es la moneda universal de la energía en el abastecimiento de la función celular, se genera principalmente a través de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias. Hemos postulado que las hierbas "vigorizantes del Yang"poseen la capacidad de aumentar la capacidad de generación de ATP mitocondrial(Ko et al., 2004). Esto está respaldado por nuestro reciente hallazgo de que las hierbas tonificantes chinas "yang vigorizantes" pero no "nutritivas de Yin" podrían mejorar la capacidad de generación de ATP miocárdico en corazones de ratón ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, la planta parásita entera seca (excluyendo la flor) de Cistanche deserticola Y.C. Ma (Orobanchaceae), se clasifica como un'Hierba tonificante vigorizante del yang en la medicina tradicional china (Chen, 1998), y aparece como el ingrediente más popular en una serie de patentes chinas para las investigaciones utilizadas para la vigorización del yang. En China y Japón, Herba Cistanche es ampliamente utilizado para el tratamiento de una serie de síntomas de deficiencia de Yang. Estudios farmacológicos indicaron que Herba Cistanche podríaeliminar los radicales libres(Xiong et al., 1996),producen sedantes(Lu, 1998),antienvejecimiento(Lee et al., 1990),efectos antinociceptivos y antiinflamatorios(Lin et al., 2002), ymejorar la función inmune(Wu et al., 2005). El principal ingrediente activo de Herba Cistanche esglucósidos feniletanoides(Ouyang et al., 2003), que se ha encontrado queantibacteriano, antiestrés y antioxidantepropiedades (Xiong et al., 1998), así como efectos antiapoptóticos sobre neuronas cultivadas (Tian & Pu, 2005). En el presente estudio, con el fin de investigar las bases farmacológicas de la acción tonificante del Yang de Herba Cistanche, se examinaron los efectos del tratamiento con Herba Cistanche sobre la capacidad de generación de ATP en mitocondrias aisladas de corazones de rata ex vivo y cardiomiocitos H9c2 cultivados in situ. Para explorar el mecanismo bioquímico subyacente a la acción de mejora de la generación de ATP, también se examinaron los efectos del tratamiento con Herba Cistanche en el transporte de electrones mitocondriales y las actividades complejas I-IV en corazones de ratas.

Los ingredientes efectivos de Cistanche pueden eliminar varios radicales libres de oxígeno activo

Materiales y métodos

Productos químicos, cultivos celulares y materiales herbales

ATP, ADP y bromuro de 3-[4,5-dimetiltiozol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio (MTT) fueron comprados a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). La solución de luciferasa (ATPlite) se obtuvo de PerkinElmer (Boston, MA, USA). El medio modificado Eagle's (DMEM) y el suero fetal bovino (FBS) de Dulbecco se compraron a GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, EE. UU.). La línea celular H9c2 fue comprada a ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche fue suministrado por un comerciante local de hierbas (Lee Hoong Kee). La hierba fue autenticada por el proveedor, y un espécimen de cupón (HKUSTY00301) fue depositado en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST).

Extracción de hierbas

Herba Cistanche (100g) se cortó en trozos pequeños y luego se extrajo calentando bajo reflujo en metanol de 300 ml a 65 °C durante 2 h. El procedimiento se repitió dos veces. El extracto agrupado se secó evaporando el disolvente a presión reducida, y el extracto de metanol de Herba Cistanche se obtuvo a un rendimiento del 39% (p/p). El análisis químico indicó que el tracto de metanol de Herba Cistanche contenía saponinas totales, flavonoides totales, lignanos totales y polisacáridos en concentraciones de 1.62% (p/p), 0.08%, 0.15% y 75.6%, respectivamente.

Cuidado de animales

Las ratas Sprague-Dawley macho adultas (8-10 semanas; 250-300 g) se mantuvieron bajo un ciclo oscuro / de luz de 12 horas en una habitación controlada por aire / humedad a aproximadamente 22 ° C y se les permitió comida y agua ad libitum en las Instalaciones de Cuidado de Animales en HKUST. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Práctica de Investigación en HKUST.

Tratamiento farmacológico

Los animales se dividieron aleatoriamente en grupos, con cinco a seis animales en cada uno. En los grupos de tratamiento, a las ratas se les administró por vía intragástrica el extracto de metanol de Herba Cistanche (disuelto/suspendido en agua) a dosis diarias crecientes (0,031–0,5 g/kg) durante 3 días. Los animales de control solo recibieron agua. Veinticuatro horas después de la última dosificación, el corazón se obtuvo de animales anestesiados con fenobarbital y se sometió a análisis bioquímicos.

Preparación de fracciones mitocondriales y medición de la capacidad de generación de ATP (ATP-GC) ex vivo

Las muestras de tejido ventricular izquierdo del corazón se extirparon y se enjuagaron con tampón isotónico helado (sacarosa de 0,32 M, 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris/HCl, pH de 7,4). Las fracciones mitocondriales cardíacas se prepararon mediante centrifugación diferencial en tampón isotónico a 4◦C. Se preparó un homogeneizado cardíaco al 10% (p/v) homogeneizando el tejido ventricular picado con un homogeneizador de teflón-vidrio a 4000 rpm para 20-30 accidentes cerebrovasculares completos. El homogeneizado se centrifugaba a 600 × g durante 10 min para eliminar núcleos y restos celulares. El sobrenadante se centrifugaba a 8000 × g durante 30 min para sedimentar las mitocondrias (Evan, 1992). Los gránulos se resuspendieron en 1 ml del tampón isotónico y reconstituyeron las fracciones mitocondriales. El ATP-GC mitocondrial de animales no tratados se midió por el método de Leung et al. (2005)

Los polisacáridos de cistanche pueden retrasar la degeneración fisiológica de los órganos y la degeneración de la morfología celular

Medición del transporte mitocondrial de electrones

La medición del transporte de electrones en mitocondrias aisladas, que se basa en la reducción de MTT, según[1] formado según lo descrito por Cohen et al. (1997). Las mitocondrias se prepararon a una concentración de proteína de 1 mg/mL con un tampón de incubación (250 mM de sacarosa, 50 mM de HEPES, 10 mM de KH2PO4, 2 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, pH 7,4). Se mezcló una alícuota (40 μL) de las mitocondrias con 100 μL cada una de piruvato de 15 mM o succinato de 0,5 mM y 0,42 mg/ml de MTT. La mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 10 min con un suave agitación. Después de la incubación, la mezcla de reacción se terminó con la adición de un tampón de lisis de 100 μL (10%, p/v, dodecil sulfato de sodio y dimetilformamida al 45%, ajustado a pH 4.7 con ácido acético glacial). Después de permanecer de pie durante 5 min, las lecturas de absorbancia de la mezcla de reacción se tomaron con un lector de placas de microtitulación (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y se informó como la diferencia entre 570 nm y 630 nm. Los datos se expresaron como porcentaje del valor medio del grupo control (es decir, Herba Cistanche-no tratado).

Cultivo celular

Las células H9c2, una línea celular permanente derivada de mioblastos cardíacos (Hescheler et al., 1991), se cultivaron como monocapas en DMEM suplementadas con 10% (v/v) FBS. El medio contenía glucosa (4,5 g/L) y glutamina (4,5 mM), suplementado con NaHCO3 (17 mM), penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 μg/ml). Todas las células se cultivaron bajo una atmósfera de 5% (v/v) de CO2 en el aire a 37◦C. El medio fue reemplazado por medio fresco cada 2 o 3 días. Se cultivó un stock de células en un matraz de cultivo de 75 cm2 y se dividió antes de la confluencia a una relación de subcultivo de 1:10. Para el ensayo ATP-GC, las células H9c2 se sembraron a una densidad de 2,5 × 104 células / pozo en una placa de 24 pocillos. Después de la unión celular, extracto de Herba Cistanche (disuelto en solución salina tamponada con fosfato; PBS) se aplicó en el medio, y las células se incubaron durante períodos crecientes (2-16 h) de tiempo. A las células de control (no tratadas) se les administró el PBS solamente.

Medición de ATP-GC in situ

Después de los períodos indicados de incubación con Herba Extracto de cistanche en concentraciones crecientes (50–300 μg/mL), se realizó el ensayo ATP-GC. El medio fue aspirado y las células fueron tratadas con digitonina (50 μg/mL) en un tampón de incubación (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0.5% BSA, pH 7.4) durante 3 min a 37◦C. Después de aspirar el digitonina, glutamato (5 mM), malato (5 mM) y ADP (60 μM) se agregaron a las células para la generación de ATP mitocondrial, que se monitoreó a intervalos de tiempo crecientes que van de 0 a 15 min. La reacción fue terminada por la adición de 60 μL de ácido perclórico (30%, p/v), y las mezclas de reacción se centrifugaron a 600 × g durante 10 min a 4◦C. Una alícuota (120 μL) del sobrenadante se mezcló con 90 μL de 1,4 M KHCO3 para neutralización. Las mezclas se centrifugaron de nuevo a 600 × g a 4◦C, y los sobrenadantes se midieron por el contenido de ATP como descrito anteriormente. El ATP-GC de las células no tratadas se estimó calculando el área bajo la curva del gráfico (AUC1) trazando el ATP generado (proteína nmol/mg) contra tiempo (0–15 min) y expresado en unidades arbitrarias. Para Herba Se normalizaron las células tratadas con cistanche, los valores de AUC1 de tiempos de incubación crecientes (3, 5, 7, 10 y 15 min) a un valor medio de control respectivo de muestras no tratadas y expresado como porcentaje de control. Luego, el área debajo del curva (AUC2) del gráfico que traza los valores de control porcentual contra el tiempo de incubación (3-15 min) se calculó y expresó en unidades arbitrarias. Datos de Herba Cistanche-tratados los grupos se expresaron como porcentaje del control de la ecuación:

[AUC2(HerbaCistanche − tratado)/AUC2(no tratado)] ×100%

Mediciones del complejo I-IV y citrato sintasa Actividades

Complejo I– de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (ETC) III actividades se midieron por métodos espectrofotométricos utilizando sustratos complejos específicos (NADH para complejos I, succinato para el complejo II, y decilubiquinol para el complejo III) como se describe (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al., 2005; Mark et al., 2001). La actividad iv compleja se midió utilizando un kit de ensayo de citocromo c oxidasa de Sigma. La actividad de la citrato sintasa mitocondrial se midió por el método de Srere (1969).

Ensayo de proteínas

Concentraciones de proteínas de fracciones mitocondriales y celulares Los lisados se determinaron mediante un ensayo de proteína BioRad kit que utiliza albúmina sérica bovina como estándar (0.038–0.600 mg/ml).

Análisis estadístico

Todos los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). Se analizaron mediante un análisis unidireccional de varianza (ANOVA). Las comparaciones múltiples post hoc fueron hecho con LSD. Valores de P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Resultados

Efectos del tratamiento con Herba Cistanche sobre el miocardio ATP-GC mitocondrial en ratas

Como se muestra en la Figura 1, el tratamiento con extracto de Herba Cistanche a dosis de hasta 0,5 g/kg aumentó el ATP-GC mitocondrial miocárdico de manera dependiente de la dosis en ratas, con el grado de estimulación del 89% a una dosis de 0,5 g/kg.

Efectos del tratamiento con Herba Cistanche en transporte mitocondrial de electrones en corazones de rata

El alcance del transporte de electrones en mitocondrias aisladas se midió mediante el seguimiento de la reducción de la MTT. El El sustrato utilizado para el ensayo fue piruvato o succinato.

Figura 1.El efecto del tratamiento con Herba Cistanche sobre la capacidad de generación de ATP mitocondrial en corazones de rata ex vivo

Cada barra representa el media ± SEM, con n = 5. Los animales fueron tratados oralmente con Herba Cistanche a las dosis diarias indicadas durante 3 días. La capacidad de generación de ATP se midió como se describe en "Materiales y métodos". Datos se expresaron en porcentaje de control con respecto a los valores (AUC2) del respectivo grupo de control no tratado. ∗Significantemente diferente del respectivo grupo de control no tratado; significativamente diferente del grupo tratado con Herba Cistanche a 0,5 g/kg.

Figura 2. Efectos del tratamiento con Herba Cistanche en el transporte de electrones mitocondriales en corazones de rata

Cada barra representa la media ± SEM, con n = 5. a) El transporte de electrones mitocondriales apoyado por succinato apoyado por piruvato (b) se midió mediante la reducción de MTT, como se describe en "Materiales y métodos". Los datos se expresaron en el porcentaje de valores de control no tratados [soportado por piruvato: OD570nm− OD630nm = 0,0206 ± 0,0001 (SEM), n = 5; succinato soportado: masculino, 0,255 ± 0,015, n = 5]. ∗Significantemente diferente de los respectivos no tratados grupo de control; un grupo significativamente diferente del grupo de 0,5 g/kg.

Como se muestra en la Figura 2a, el tratamiento con Herba Cistanche dependiente de la dosis aumentó la extensión del electrón mitocondrial transporte soportado por piruvato en corazones de rata, con la estimulación óptima observable a dosis de 0,5 g/kg. Sin embargo, no hay cambios significativos en la extensión de las mitocondrias el transporte de electrones apoyado por succinato se detectó en Corazones de rata tratados con Herba Cistanche (Fig. 2b).

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