Parte 1: Farmacología de red integrada y modelo de pez cebra para investigar componentes de efectos duales de Cistanche tubulosa para tratar tanto la osteoporosis como la enfermedad de Alzheimer
Mar 30, 2022
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Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * y Fei Li 1, 2, *
RESUMEN
Relevancia etnofarmacológica:La osteoporosis (OP) y la enfermedad de Alzheimer (EA) son enfermedades geriátricas concurrentes comunes, y muchos estudios indican la conexión de su patogénesis. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) es una medicina tradicional china ampliamente utilizada y se ha aplicado extensamente para tratar OP y AD, respectivamente. Sin embargo, los ingredientes activos para ambas enfermedades concurrentes simultáneamente y los mecanismos subyacentes son limitados.
Objetivo del estudio:Este trabajo tuvo como objetivo establecer un método de detección de red efectivo y confiable para encontrar compuestos de doble efecto en CT que puedan proteger AD y OP al mismo tiempo. Y proporcionará nuevas perspectivas del vínculo entre OP y AD en los mecanismos moleculares.
Material y métodos:Los efectos duales de la TC se analizaron sistemáticamente mediante la integración de múltiples bases de datos y un análisis exhaustivo a nivel de farmacología en red. Se construyó una red clasificada de interacción fármaco-objetivo para revelar las diferencias en los efectos entre los diferentes tipos de compuestos. Para probar la efectividad de esta red, se seleccionaron algunos compuestos para verificar en el modelo OP preinducido y el modelo AD inducido por AlCl3- del pez cebra de acuerdo con los parámetros topológicos.
Palabras clave:Farmacología en red; Osteoporosis;enfermedad de alzheimer; Cistanche tubulosa; pez cebra
Cistanche tiene una función anti-Alzheimer.
1. Introducción
La tendencia al envejecimiento de la población se traduce en el aumento de la prevalencia de osteoporosis (OP) y enfermedad de Alzheimer (EA) a lo largo de los años (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). En la actualidad, tanto la OP como la EA se han reconocido como amenazas importantes para la salud pública, ya que pueden progresar sin síntomas y generar enormes cargas sociales (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Como enfermedades relacionadas con la edad, a menudo se observa que en la práctica clínica coexisten con una alta tasa de discapacidad y mortalidad (Dengler-Crish y Elefteriou, 2019). La OP es una enfermedad esquelética sistémica caracterizada por una masa ósea baja y una microarquitectura deteriorada del tejido óseo, con mayor fragilidad ósea y mayor riesgo de fracturas (Rizzoli, 2018). La EA es la degeneración cerebral más común caracterizada por la pérdida progresiva de la memoria y otras funciones cognitivas (Bondi et al., 2017). Hasta el momento, aún no existen opciones suficientemente potentes para prevenir o curar las dos enfermedades de su compleja etiología y patogenia. Y lo que es peor, el paciente es más frecuente que tenga efectos secundarios (Brown, 2017; Huang y Mucke, 2012).
Sobre la base teórica de la diferenciación de síndromes (Sucher, 2013), las medicinas tradicionales chinas (MTC) con múltiples componentes dirigidos a más de un mecanismo fisiopatológico tienen una superioridad única en el tratamiento de algunas enfermedades complejas familiares. Como hierba tónica renal, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) es ampliamente utilizada contra la pérdida de memoria y la debilidad atrófica de los huesos por los médicos tradicionales chinos (Fu et al., 2018). Además de su eficacia tradicional, una considerable investigación mostró que tenía varias actividades farmacológicas, como mejorar los déficits cognitivos y conductuales (Wu et al., 2014), antiinflamatorio (Fu et al., 2018), promover la formación de hueso y suprimir el hueso. resorción (Li et al., 2013; Li et al., 2012), así como actividad antioxidante (Zhang et al., 2016). Pero la complejidad de sus ingredientes activos y el proceso metabólico plantearon dificultades tanto para explorar objetivos en tejidos humanos como para exponer el mecanismo de acción.
Sobre todo, es necesaria una discusión fiable de las dianas terapéuticas de OP/AD. Sobre la base, especialmente, de la idea de "mismo tratamiento para diferentes enfermedades" en la medicina tradicional china, y de las metodologías de la farmacología en red de "terapéutica multicomponente, red biológica", los intentos de buscar dianas comunes significativas entre ambas enfermedades pueden tener un efecto particularmente práctico. significado en proporcionar orientación para la prevención y control de OP y AD. El pez cebra tiene fuertes similitudes en su fisiología esquelética con los mamíferos y genes altamente homólogos a los humanos. Es un modelo animal disponible y atractivo in vivo para la investigación de OP y AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Por lo tanto, esta investigación de farmacología en red tenía como objetivo la detección de componentes activos de efectos duales de CT, explorando los objetivos potenciales comunes de OP y AD, así como descubriendo la posibilidad de usar CT para tratar dos enfermedades al mismo tiempo. En este estudio, la información de los objetivos de los ingredientes activos de CT, los genomas y la información proteómica de OP y AD se recopilaron respectivamente de diferentes bases de datos para establecer una red interactiva, y se construyó un análisis de enriquecimiento para descubrir mecanismos sinérgicos de CT para tratar OP y AD. . Además, inducimos modelos de pez cebra OP y AD respectivamente, y capturamos los compuestos clave en la red para verificar su eficacia y objetivos para dos enfermedades.
Cistanche estimula el crecimiento de la esclerotina.
2. Materiales y métodos
2.1 Reactivos
Los estándares químicos de genisteína (GE), quercetina (QU), ácido abiético (AA), -sitosterol (BSS) (pureza mayor o igual al 98 por ciento) se compraron a Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). Las placas de cultivo se obtuvieron de Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, China). Prednisolona (Pre), etidronato disódico (Ed), donepezilo HCL (DPZ), AlCl3·6H2O se adquirió de Aladdin Reagent Inc. Fosfatasa alcalina (ALP) de pez cebra, fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP), acetilcolinesterasa (AChE) y colina El kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de acetiltransferasa (ChAT) fue suministrado por Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Trizol se obtuvo de Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, China). Transtar Top Green qPCR SuperMix se adquirió de TransGen Biotech. Co., Ltd. (Pekín, China).
extracto de cistanche
2.2 Animales
El pez cebra adulto (cepa AB, 4 meses de edad) se mantuvo a 28 grados en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h en un acuario provisto del intercambio de agua dulce. Se mantuvieron dos veces al día con una dieta de camarones de salmuera recién nacidos (Chen et al., 2018). Se seleccionaron embriones normalmente fertilizados y se cultivaron hasta 3 días después de la fertilización (dpf) en una incubadora de crecimiento ligero. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de la institución y el gobierno para experimentos con animales.
2.3 Proceso farmacológico en red
2.3.1 Cálculo del espacio químico y detección de compuestos candidatos
Todos los datos de ingredientes químicos de CT se recopilaron de la plataforma de análisis y base de datos de farmacología de sistemas de medicina tradicional china. TCMSP es una plataforma de farmacología de sistemas de hierbas medicinales chinas que capta las relaciones entre fármacos, dianas y enfermedades (Ru et al., 2014). Mientras tanto, se adquirieron cuatro parámetros esenciales relacionados con la farmacología en TCMSP para el análisis de componentes principales (PCA), incluido el peso molecular (MW), el coeficiente de partición entre octanol y agua (AlogP), el recuento de donantes de hidrógeno (Hdon) y el recuento de aceptores de hidrógeno ( Hacc). La distribución química de CT se construyó con los parámetros anteriores utilizando el software SIMCA (Versión 14.1, Umetrics). Y los medicamentos de molécula pequeña aprobados para AD/OP por DrugBank se procesaron en el mismo curso. Los ingredientes de CT se filtraron por similitud con las drogas (DL). DL es un concepto cualitativo que se utiliza en el diseño de fármacos para estimar cuán "similar a un fármaco" es un posible compuesto. Esta propiedad vital se utiliza como criterio de selección para los compuestos "similares a fármacos" en las hierbas chinas tradicionales y ayuda a optimizar la farmacocinética y las propiedades farmacéuticas (Tao et al., 2013). Con base en sugerencias en la literatura y TCMSP, seleccionamos DL mayor o igual a 0.18 como condiciones de filtro. Los ingredientes que cumplían con la condición fueron exportados para su posterior análisis. Sus estructuras 2-dimensionales (2D) y 3D fueron pintadas con el software ChemDraw Professional 16.0. Y las estructuras 3D fueron optimizadas por la función de minimización de energía en Chem3D 16.0.
2.3.2 Recopilación de objetivos asociados a OP y AD
Todas las asociaciones de genes para OP y AD se recopilaron de forma independiente de DisGeNET y GeneCards. La base de datos DisGeNET es una de las mayores plataformas de descubrimiento disponibles públicamente de genes y variantes asociadas con enfermedades humanas (Pinero et al., 2017). GeneCards es una base de datos integrada de genes humanos que incluye información genómica, transcriptómica, proteómica, genética, clínica y funcional (Safran et al., 2010).
2.3.3 Recopilación de objetivos compuestos y predicción de acoplamiento inverso
La base de datos GeneCards y la base de datos Swiss TargetPrediction se combinaron para predecir objetivos relevantes de ingredientes activos en CT. GeneCards indica los objetivos activos conocidos de los compuestos, mientras que la base de datos Swiss TargetPrediction puede estimar los objetivos macromoleculares más probables de las moléculas pequeñas (Daina et al., 2019). Antes de la predicción, las estructuras de las moléculas candidatas se convirtieron del formato mol2 al formato SMILES utilizando Open Babel (Versión 2.4.1).
2.3.4 Análisis de interacción proteína-proteína
Se aplicó la base de datos STRING para descubrir las interacciones entre un grupo de objetivos compartidos de CT-OP-AD. Después de buscar bajo el patrón de "Homo sapiens", la red de interacción proteína-proteína (PPI) fue visualizada por el software Cytoscape (Versión 3.7.2). STRING es una base de datos de PPI conocidos y predichos, derivados de predicciones de contexto genómico, experimentos de laboratorio de alto rendimiento, coexpresión (conservada), minería de texto automatizada y conocimiento previo en bases de datos (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche es bueno para la enfermedad de Alzheimer.
2.3.5 Análisis de enriquecimiento de rutas GO y KEGG
El análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) se realizó en el software Funrich. FunRich (Versión 3.1.3) es un software funcional utilizado principalmente para el análisis de enriquecimiento de genes y proteínas (Pathan et al., 2015). Se empleó la base de datos humana ConsensusPathDB para realizar el análisis de enriquecimiento de la vía. La lista de genes obtenida se envió a la base de datos con el ajuste de "valor de corte de p" en 0,01. Después de obtener los resultados, solo estas vías relacionadas con OP y/o AD fueron seleccionadas y divididas en grupos de acuerdo con las categorías de función KEGG. CPDB es una red de interacción continua que contiene interacciones binarias y complejas proteína-proteína, genéticas, metabólicas, de señalización, reguladoras de genes y de fármaco-objetivo, así como vías bioquímicas en el Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Procedimientos experimentales para el modelo de pez cebra OP
2.4.1 Agrupación de modelos
Las larvas de pez cebra se dividieron en varios grupos: grupo de control, grupo modelo, grupo modelo más Ed, grupos modelo más compuestos, cada uno de los cuales contenía 30 larvas. El grupo de control se mantuvo en el medio con DMSO al 0,2 por ciento. El grupo modelo fue tratado con Pre (25 µM) de 3 dpf a 8 dpf. El grupo modelo más Ed fue cotratado con Pre y Ed (30 µg/mL).
2.4.2 Tinción con rojo de alizarina
Después de 5 días de cultivo con diferentes compuestos, las larvas fueron anestesiadas, fijadas y blanqueadas a su vez. El rojo de alizarina se usó para teñir los huesos de la cabeza del pez cebra. Se aplicó KOH al 1 por ciento y glicerol (proporciones de 3:1, 1:1 y 1:3) respectivamente para eliminar el exceso. Finalmente, se empleó un microscopio estereoscópico (Olympus SZX16) para capturar las imágenes de tinción de pez cebra en posición prona. Image-Pro Plus 6 calculó el área de tinción y la densidad óptica integrada (IOD).0.
2.4.3 Determinación de actividad de ALP y TRAP
Las larvas de pez cebra a los 3 dpf se subcultivaron en 6-placas de pocillos y se incubaron con Pre en presencia o ausencia de compuestos durante 5 días. Luego se recogieron para medir la actividad de ALP. La actividad de ALP se determinó utilizando el kit ELISA de ALP de pez cebra basado en el protocolo del fabricante. El método para evaluar la actividad de TRAP fue el mismo que el de ALP.
2.5 Procedimientos experimentales para el modelo de pez cebra AD
2.5.1 Agrupación de modelos
Las larvas de pez cebra se dividieron en varios grupos: grupo de control, grupo modelo, grupo modelo más DPZ, grupo modelo más compuestos, cada uno de los cuales contenía 30 larvas. El grupo de control se mantuvo en el medio con DMSO al 0,2 por ciento. El grupo modelo fue tratado con AlCl3 (150 µM, pH 5.8) de 3 dpf a 6 dpf. El grupo modelo más DPZ se cotrató con AlCl3 y DPZ (8 µM).
2.5.2 Análisis de comportamiento
Después de 3 días de entregas de medicamentos, el analizador de comportamiento ViewPoint registró el movimiento de las larvas (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Todos los experimentos se completaron en 60 min a 28 °C, con 3 ciclos de fase de luz/oscuridad (10 min cada uno para luz y oscuridad). De acuerdo con los métodos del informe anterior, la velocidad promedio (AS), el cambio de velocidad (∆S), la tasa de recuperación de discinesia (DRR, ecuación a) y la eficiencia de respuesta (RE, ecuación b) se seleccionan como la eficiencia del fármaco anti-EA. índice de evaluación en este modelo (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/seg)=D / T, DRR (porcentaje)=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
donde D es la distancia de movimiento del pez cebra durante 60 min, T es el tiempo experimental.
RE ( por ciento )=100 × (∆SDrug - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
donde ∆S es el cambio de velocidad del pez cebra en ciclos de luz/oscuridad.
2.5.3 Medición de actividad de AChE y ChAT
Las larvas de pez cebra a los 3 dpf se subcultivaron en 6-placas de pocillos y se incubaron con AlCl3 en presencia o ausencia de compuestos durante 3 días. Luego se recolectaron para la actividad de AChE. La actividad de AChE se detectó utilizando el kit ELISA de AChE de pez cebra basado en el protocolo del fabricante. El método para evaluar la actividad de ChAT fue el mismo que el de AChE.
2.6 Análisis PCR cuantitativo en tiempo real
Las larvas de pez cebra se dividieron en grupos OP y AD. Los grupos OP consistieron en el grupo de control, el grupo Pre y los grupos de compuestos Pre más, cultivados de 3 dpf a 8 dpf. Los grupos AD incluyeron el grupo de control, el grupo AlCl3 y los grupos de compuestos AlCl3 más, cultivados de 3 dpf a 5 dpf. Cada grupo contenía 30 larvas. El ARN total se extrajo respectivamente de estas muestras de larvas de pez cebra con Trizol. Las muestras de ARN se transcribieron inversamente a ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de ADNc. El nivel de expresión de ARNm se detectó mediante PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real (Roche LightCycler96). Los resultados se normalizaron a la expresión de -actina y se cuantificaron mediante el método comparativo (2−∆∆Ct). Los cebadores directos e inversos utilizados fueron sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China) y se enumeran en la Tabla complementaria S1.
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2.7 Análisis estadístico
GraphPad Prism versión 8.00 se utilizó para análisis estadísticos descriptivos. Los datos se expresaron como media ± DE y se analizaron mediante el método ANOVA para evaluar la variabilidad entre cada prueba, considerando una P menor o igual a 0.05 como significativa.
