Parte 2: efecto antifibrótico de la 6-bromoindirrubina-3 ′ -oxima (6-BIO) a través de la regulación de la proteína activadora-1 (AP-1) Y factores de transcripción de proteína de especificidad-1 (SP-1) en células renales

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3.3. 6-BIO atenúa los marcadores de fibrosis y las vías de señalización asociadas a la fibrosis en las células del túbulo proximal (HK-2) y del fibroblasto intersticial (NRK49F)

A continuación, confirmamos el efecto de 6-BIO en las células tubulares proximales y las células de fibroblastos intersticiales. Observamos una reducción dependiente de la concentración y el tiempo de la expresión del ARNm de GSK3 por 6-BIO en células HK-2 y NRK49F (Fig. S2A y B), y la expresión de proteínas relacionadas con ECM y EMT involucradas enriñóncélulafibrosistambién se redujo (Fig. S2E). Además, la expresión mejorada de GSK3, tras la exposición a TGF de estas células, también disminuyó con el tratamiento 6-BIO (Fig. S2C y D). La Fig. 3 muestra la expresión de proteínas deriñónfibrosismarcadores en células HK-2 y NRK49F tratadas con TGF. Como se muestra en la Fig. 3A, la expresión de las proteínas PAI-1 y CTGF aumentó significativamente en respuesta al tratamiento con 5 y 10 ng/ml de TGF en células HK-2 y NRK49F, respectivamente. Sin embargo, su expresión se redujo notablemente después del tratamiento con 6-BIO (Fig. 3B).SMADy las vías de señalización de MAPK aumentaron con el tratamiento con TGF, lo que se revirtió con el tratamiento con 6-BIO (Fig. 4). A continuación, investigamos la expresión de los factores de transcripción AP-1 y SP-1 implicados en la señalización mediada por TGF en células HK-2 y NRK49F. La Fig. 4D muestra que el aumento de PC-JUN y PC-FOS mediado por TGF se redujo en respuesta al tratamiento con 6-BIO y el inhibidor de JNK SP600125 y tras la transfección de C-JUN dominante negativa. La Fig. 4E muestra el cambio en la intensidad de la proteína en relación con el control. Además, el aumento mediado por TGF en el nivel de SP-1 se atenuó significativamente en respuesta al tratamiento con 6-BIO y SP-1 siRNA (Fig. 4F). La Fig. 4G muestra el cambio en la intensidad de la proteína en relación con el control. Estos resultados sugirieron que TGF/SMADy la señalización de MAPK, así como los factores de transcripción, AP-1 y SP-1, están regulados por 6-BIO.

3.4. 6-BIO atenúa la expresión nuclear de las proteínas PC-JUN, PC-FOS y SP-1 en células de fibroblastos intersticiales y tubulares proximales

Las figuras 5A y B muestran la localización de PAI-1 y CTGF con PC-JUN, PC-FOS y SP-1. La tinción roja de PC-JUN, PC-FOS y SP-1 indicó su sobreexpresión en el núcleo después del tratamiento con TGF; De manera similar, la tinción verde de PAI-1 y CTGF indicó su sobreexpresión en el citosol. Sin embargo, los niveles de expresión de PC-JUN, PC-FOS y SP-1 se redujeron con el tratamiento 6-BIO. Estos resultados sugirieron que 6-BIO afecta directamente a AP-1 y SP-1, los factores de transcripción que regulan la expresión de PAI-1 y CTGF.

3.5. 6-BIO atenúa la actividad promotora de PAI-1, CTGF, AP-1 y SP-1 en células de fibroblastos intersticiales y tubulares proximales

A continuación, investigamos si 6-BIO inhibe las actividades promotoras de los genes PAI-1, CTGF, AP-1 y SP-1. La actividad promotora de PAI-1 y CTGF aumentó en respuesta a TGF pero se redujo por el tratamiento con 6-BIO (Fig. 6A y B). Además, la disminución fue notable cuando las células se trataron con 6-BIO solo que en presencia de TGF. AP-1 y SP-1 se unen a los promotores de PAI-1 y CTGF. Las figuras 6C y 6D muestran la actividad promotora de AP-1 y SP-1. La actividad de la luciferasa AP-1 y SP-1 aumentó con el tratamiento con TGF y disminuyó con 6-BIO de manera dependiente de la dosis. La Fig. 6E muestra la expresión del factor de transcripción en extractos de proteínas nucleares. Por lo tanto, confirmamos que la expresión nuclear de PC-JUN, PC-FOS y SP-1 aumentó en respuesta al tratamiento con TGF y fue suprimida por el tratamiento con 6-BIO. La Fig. 6F muestra el cambio en la intensidad de la proteína en relación con el control. Además, nuestros resultados sugieren que 6-BIO actúa en el sitio de unión del factor de transcripción del promotor para debilitar la unión de AP-1 y SP-1. Realizamos un ensayo de unión del promotor in vitro en presencia de 6-BIO para confirmar lo mismo. La unión de proteínas nucleares y PC-JUN, PC-FOS y SP-1 se debilitó mediante la adición de 6-BIO de manera dependiente de la concentración (Fig. 3 complementaria). Estos resultados indican que 6-BIO inhibe las actividades del promotor PAI-1 y CTGF, así como las funciones AP-1 y SP-1; por lo tanto, puede tener potencial terapéutico enriñónfibrosis.

4. Discusión

Usando el modelo de rata de UUO y TGF-tratadoriñónderivados de los túbulos proximales y líneas celulares de fibroblastos intersticiales, demostramos que el 6-tratamiento BIO puede atenuarriñóndaño. El modelo UUO es un modelo animal representativo de la nefropatía obstructiva que se caracteriza por la progresiva tubulointersticialfibrosis[43]. Análisis histopatológico deriñónLos tejidos obtenidos del modelo UUO mostraron que la acumulación de ECM y la atrofia tubular en el espacio intersticial fueron restauradas por el tratamiento 6-BIO. Además, usando TGF-tratadoriñóncélulas de fibroblastos intersticiales y derivadas del túbulo proximal, demostramos que el 6-tratamiento BIO puede atenuarriñóndaño. En el modelo UUO y las células HK-2 y NRK49F tratadas con TGF, 6-BIO inhibió la expresión deriñónfibrosismarcadores, así como MAPK ySMADvías de señalización. Además, el tratamiento con 6-BIO redujo la expresión de las proteínas PC-JUN, PC-FOS y SP-1 inducidas por UUO y TGF, así como la expresión nuclear y la actividad promotora de AP{{6 }} y SP-1 en células HK-2 tratadas con TGF- - y NRK49F. La inhibición de los factores de transcripción AP-1 y SP-1 por el tratamiento 6-BIO se ha asociado con la inhibición de la acumulación de ECM que conduce a la exacerbación deriñónfibrosis. Esto se logra suprimiendo MAPK ySMADvías de señalización que conducen a una reducción en la expresión de PAI-1 y CTGF. Nuestros resultados sugieren que 6-BIO puede ser un agente terapéutico potencial contrariñónenfermedades, así como para prevenirriñóndaño causado por UUO y TGF.

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El derivado semisintético de indirrubina permeable a las células 6-BIO pertenece a una familia de bis-indol y se encuentra naturalmente en plantas y moluscos gasterópodos comestibles [12]. La indirrubina contiene un enlace de hidrógeno intramolecular entre el enlace doble 2-C O y el grupo N1-H y otro enlace de hidrógeno intermolecular entre las moléculas. 6-BIO tiene una estructura químicamente modificada en la que la posición 6- se sustituye por Br para superar la desventaja de las malas propiedades farmacocinéticas debido a la baja solubilidad en agua de la indirrubina [44]. Muchas indirrubinas, debido a la unión competitiva con el ATP, actúan como inhibidores duales de la cinasa dependiente de ciclina (CDK) y la glucógeno sintasa cinasa{{10}} (GSK-3), exhibiendo más de {{ 12}}veces de selectividad sobre CDK5 [12]. Además, 6-BIO muestra una inhibición marcadamente selectiva de GSK-3 con un valor IC50 de 0,005 μM [12]. Según los informes de varios grupos, 6-BIO inhibe por completo la proliferación de células MCF-7 y bloquea la migración en aproximadamente un 75 % a una concentración de 10 μM, e inhibe la fosforilación de PDK1. Esto mostró que 6-BIO se insertó en el bolsillo de unión de PDK1 para formar tres enlaces de hidrógeno con residuos en la región bisagra, y el bolsillo de unión acomodó fácilmente los átomos de Br adicionales en 6-BIO [45]. Con estas características, 6-BIO se está estudiando como un nuevo fármaco para regular procesos celulares como la inflamación relacionada con el envejecimiento, el estrés oxidativo, la supervivencia celular, la proliferación y la apoptosis en cáncer, diabetes y enfermedades degenerativas [46,47 ]. Sin embargo, los estudios sobre regulación génica y mecanismos moleculares relacionados conriñóncélulafibrosisSon escasos. Por lo tanto, buscamos investigar si 6-BIO atenuabariñónfibrosisinhibiendo la regulación de los genes PAI-1 y CTGF enriñóncélulas, reduciendo así la acumulación de MEC.

Varios estudios han utilizado el modelo UUO para informar una correlación entre la acumulación de ECM y crónicariñónenfermedad causada por intersticial tubularfibrosis[43]. Además, se informa que PAI-1 y CTGF sobreexpresados ​​están asociados con una alta acumulación de ECM durante la progresión de la enfermedad crónica.riñónenfermedad. Por lo tanto, identificar una molécula terapéutica que inhiba la señalización y la transcripción de genes asociados con la acumulación mejorada de ECM es importante para inhibir de manera efectivariñónfibrosis. Por lo tanto, en este estudio evaluamos 6-BIO, uno de los inhibidores de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3 ), enriñónfibrosis.

Estudiamos el efecto de las proteínas PAI-1 y CTGF enriñóncélulafibrosisy confirmó que su expresión estaba regulada por factores de transcripción comunes, AP-1 y SP-1. El factor de transcripción, AP-1, es un heterodímero compuesto por proteínas pertenecientes a JUN (C-JUN, JUNB y JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1 y Fra{ {6}}), la familia ATF (factor de transcripción de activación) y JDP (proteína de dimerización JUN) [48]. Regula varios procesos celulares como la proliferación celular, la muerte,

diferenciación y vascularización. Un estudio anterior informó que la actividad AP-1 aumenta en el hígado y los pulmones mediante la activación del colágeno tipo VI y los fibroblastos [49,50]. Los dos componentes principales de AP-1, C-JUN y C-FOS responden a una variedad de estímulos, como citocinas, factores de crecimiento y estrés [51]. Observamos una mayor fosforilación de C-JUN y C-FOS en un modelo de rata UUO y células HK-2 tratadas con TGF y NRK49F (Figs. 2D y 4D). C-JUN y C-FOS forman heterodímeros y se unen al sitio de unión AP-1 en el ADN, actuando así como factores de transcripción para regular la expresión de otros genes. Además, la fosforilación de ERK1/2 y JNK activa C-FOS y C-JUN, respectivamente. En nuestro estudio, la fosforilación de ERK1/2 y JNK, así como de C-JUN y C-FOS en el núcleo aumentó notablemente en respuesta al tratamiento con TGF. Sin embargo, el tratamiento 6-BIO revirtió significativamente estos efectos. Nuestro estudio mostró que 6-BIO inhibió eficientemente la fosforilación de ERK1/2 y JNK y disminuyó la actividad del factor de transcripción AP-1, inhibiendo así la fosforilación de C-JUN y C-FOS, que son sus derivados efectores La inhibición de SP-1 en astrocitos hepáticos ejerce unaantifibróticoefecto [52]. Otro estudio mostró que SP-1 jugó un papel importante enfibrosis[52,53]. Por lo tanto, evaluamos si 6-BIO podría inhibir el factor de transcripción SP-1. Observamos que la expresión de la proteína SP-1 aumentó en respuesta al tratamiento con TGF, así como en el modelo UUO, mientras que disminuyó después del tratamiento con 6-BIO. Además, la expresión nuclear de SP-1 inducida por TGF fue suprimida por el tratamiento con 6-BIO. Como resultado, las actividades promotoras de PAI-1 y CTGF, que tienen sitios de unión AP-1 y SP-1, también se redujeron con el tratamiento con 6-BIO (Fig. 6 ). Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la disminución en la actividad promotora de PAI-1 y CTGF por el tratamiento con 6-BIO redujo la expresión de proteína PAI-1 y CTGF, y disminuyó la acumulación de ECM, reduciendo asíriñóncélulafibrosis.

5. Conclusión

6-El tratamiento con BIO disminuyó la expresión de PAI-1 y CTGF en el modelo UUO y tratado con TGFriñóncélulas. Además, 6-BIO inhibió la activación inducida por TGF deSMADy la señalización de MAPK, mientras que también inhibe las actividades de AP-1 y SP-1, dos de los varios factores de transcripción que se unen a los promotores de los genes PAI-1 y CTGF. La inhibición de AP-1 y SP-1 parece ser uno de los mecanismos clave por los cuales 6-BIO inhiberiñónfibrosis. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que 6-BIO puede ser un agente terapéutico potencial contrariñónenfermedades.

Declaración de contribución de autoría CRediT

Jung Sun Park: Conceptualización, Metodología, Curación de datos, Redacción: preparación del borrador original, Redacción: revisión y edición, Visualización, Adquisición de fondos. En Ae Jung: Curación de datos, escritura, revisión y edición. Hong Sang Choi: Curación de datos, Redacción − revisión y edición. Dong-Hyun Kim: Metodología, Curaduría de datos. Hoon In Choi: Metodología, Curación de datos. Eun Hui Bae: Redacción − revisión y edición, Supervisión. Seong Kwon Ma: Redacción − revisión y edición,

6. Referencias

La fuente es de Jung Sun Park et al en Biomedicina y Farmacoterapia 145 (2022) 112402