PARTE 2 Antioxidación y citoprotección del acteósido y sus derivados: comparación y química mecánica
Mar 08, 2022
Parte 2 ¿Cómo protege las células el antioxidante Cistanche Acteoside?
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3. Discusión
Se sabe que la acción antioxidante de los compuestos fenólicos naturales está involucrada en la transferencia de electrones (ET) [18,19]. Por lo tanto, algunos ensayos de reducción de metales basados en ET se han utilizado ampliamente para evaluar los niveles de antioxidantes de los compuestos fenólicos, como los ensayos FRAP y CUPRAC. Las directrices del ensayo FRAP deben cumplirse con un pH inferior a 3,6. Tal ambiente ácido ha suprimido con éxito la ionización de H+ de los compuestos fenólicos; por lo tanto, el ensayo FRAP se considera un mero proceso de ET [20,21]. La efectividad deacteósidoy sus derivados en el ensayo FRAP implica que, cuando el acteósido y sus derivados actúan como antioxidantes, pueden utilizar la vía ET para ejercer su acción antioxidante.
Además, también realizamos un ensayo CUPRAC en un tampón de pH 7,4. Como se ve en Supl. 1,acteósidoy sus derivados aumentaron dosis-dependiente su Cu2 más-Porcentajes de potencia reductora, indicando que podrían permanecer ET potenciales a pH fisiológico. Sin embargo, sus potenciales ET disminuyeron en el siguiente orden:acteósido> forsythoside B > poliumoside (Tabla 1). Esta dinámica sugiere claramente que el resto apiosil en forsythoside B y el resto ramnosyl en poliumoside redujeron el potencial de ET.
Para probar la posibilidad de que ET ocurra durante sus procesos de eliminación de radicales, se introdujo en el estudio un radical libre centrado en el oxígeno PTIO・. La evidencia de voltamperometría cíclica reveló que la eliminación de PTIO・ por debajo de pH 5.0 es una reacción redox de un solo electrón. La observación queacteósidoy sus derivados podrían eliminar eficientemente el radical PTIO・ a pH 4.5, sugiere la posibilidad de ET durante sus procesos de eliminación de radicales. Obviamente, este hallazgo respalda aún más los resultados antes mencionados de los ensayos FRAP y CUPRAC, y los resultados anteriores de que un electrón donante (e) es una característica de los antioxidantes fenólicos [23].
Sin embargo, a un pH fisiológico de 7,4, el ensayo de captación de PTIO・ no es simplemente una vía ET, sino que también incluye una vía de transferencia de protones (H+). Durante el proceso, se ha sugerido a PTIO・ que acepte Hmásde fenoles para producir el pico del producto ([PTIO-H]más). porque hmás-la transferencia siempre va acompañada de ET en mecanismos escalonados o sincrónicos [24], el producto realista (o final) es una molécula de [PTIO-H] [22]. El barrido de PTIO・ a pH 7,4 (suplemento 1) implica queacteósidoy sus derivados también poseen un potencial de transferencia de H+. Los valores de IC50 (Tabla 1) indicaron que el relativo Hmás-Los potenciales de transferencia estaban en orden descendente deacteósido>forsythoside B > poliumoside. Claramente, los restos apiosil y ramnosilo también debilitaron el Hmás-Transferencia potencial durante el proceso antioxidante.
Como se mencionó anteriormente, durante el proceso antioxidante de los fenoles, la ET suele ir acompañada de protones (Hmás) se transfieren para formar varios mecanismos antioxidantes [24], como la transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) [23,25-27], la transferencia secuencial de electrones y protones (SEPT) [26,27], la pérdida secuencial de protones de un solo electrón transferencia (SPLET) [26] y transferencia de electrones acoplados a protones (PCET) [24-26, 28]. Por ejemplo, ABTS más • -barrido, una reacción dominada por la transferencia de un solo electrón (SET) [29], también se ha demostrado recientemente que se ve afectada por los niveles de H+ [30]. Por lo tanto, ABTS plus • -scavenging es un ensayo antioxidante basado en múltiples vías [21,31]. El hecho de queacteósidoy sus derivados podrían eliminar los radicales ABTS plus ・, lo que indica que su acción antioxidante también puede estar mediada por vías múltiples. Esta hipótesis se confirma aún más por la evidencia del ensayo de eliminación de DPPH・, una reacción que comprende múltiples vías HAT, ET, SEPT y PCET [26,32]. Sin embargo, el análisis cuantitativo basado en IC50Los valores (Tabla 1) revelaron que en ABTS basado en múltiples vías más --barrido y DPPH*-barrido aspectos,acteósidofue superior a su correspondiente forsythoside B y ramnoside poliumoside. Por lo tanto, se puede deducir que los restos de apiol y ramnosilo eventualmente dificultan los potenciales de múltiples vías (especialmente ET y Hmás-transferencia) durante el proceso de eliminación de radicales libres.
Como señalaron los autores y otros [14,26], durante el proceso antioxidante, también puede ocurrir una reacción RAF. Sin embargo, para verificar la posibilidad de RAF, se estudiaron tres glucósidos fenilpropanoides junto con ácido cafeico usando análisis UPLC-ESI-Q—TOF-MS/MS. Se encontró que el ácido cafeico producía un producto dímero, mientras que tres glicósidos fenilpropanoides no producían un pico de producto RAF. Este hallazgo sugiere claramente que tres glucósidos fenilpropanoides no pueden pasar por la vía RAF para ejercer su acción antioxidante. Dado que tres glucósidos de fenilpropanoide pueden considerarse los ésteres del ácido cafeico (Figura 1), tal diferencia entre el ácido cafeico y los ésteres de ácido cafeico también indica que una fracción enorme puede dificultar la generación de RAF.
En conjunto, desde el punto de vista de la eliminación de radicales libres,acteósidoy sus derivados pueden sufrir múltiples vías para ejercer su acción antioxidante. Estas vías antioxidantes al menos están involucradas en la transferencia de ET y H+ (pero no RAF). Nuestros hallazgos están parcialmente respaldados por el estudio teórico queacteósidopodría ejercer una acción antioxidante a través de la vía SPLET. En el proceso, el acteósido podría desprotonarse primero (Hmás-transferencia) para producir anión. Se cree que la desprotonación ocurre en los restos de catecol con acidez débil. Posteriormente, el anión donó electrones para dar lugar a la forma radical fenoxi [33]. Sin embargo, los radicales fenoxi con conjugación pn son estables hasta cierto punto. Por supuesto, a este respecto, se necesita más trabajo experimental en el futuro.
Cabe mencionar que el estrés oxidativo celular también puede originarse a partir de metales de transición (especialmente Fe2 más). la Fe2 másion, sin embargo, puede transformar el H2O2molécula en radicales •OH más dañinos a través de la reacción de Fenton (Fe2más más H2O2 T Fe3más más ・OH más OH-). Por lo tanto, la atenuación de Fe2Los niveles plus pueden inhibir eficazmente los radicales ・OH para liberar el estrés oxidativo celular. De hecho, la quelación de hierro mediante antioxidantes fenólicos naturales ahora se ha convertido en una terapia eficaz para algunas enfermedades de estrés oxidativo [34,35].
En el presente estudio, el acteósido y sus derivados fueron sugeridos como Fe efectivo2 más-queladores por los cambios en la espectroscopia y los colores de la solución (Figura 2). Sin embargo, el acteósido es inferior a los dos glucósidos en la quelación de Fe2 másy el forsythoside B con resto apiosil es inferior al poliumosido con resto ramnosyl. Con base en la comparación de sus conformaciones preferenciales (Figura 1, derecha), se propone que el resto apiosilo (o ramnosilo) puede ayudar al ligando principal (grupo fenilpropanoide) en la quelación de Fe2 más. Tal efecto sinérgico, sin duda, fortalece la Fe2 más-capacidad quelante y aumenta los picos UV-vis. Sin embargo, el ramnosilo es más eficaz que el apiosilo en su Fe2 más-Capacidad quelante. La diferencia se puede atribuir al hecho de que el ramnosilo se presenta en forma exocíclica (es decir, aL-ramnopiranosilo), mientras que el apiosilo se encuentra en forma pentacíclica (es decir, pD-apiofuransilo). Se sabe que una forma exocíclica es más grande y más estable. Por lo tanto, el ramnosilo exocíclico es más efectivo en comparación con el apiosilo pentacíclico en su Fe2 más-Capacidad quelante.
Para probar si el acteósido y sus derivados pueden eliminar ROS, realizamos un ensayo de autooxidación de pirogalol. Como se ve en Supl. 1, todos podrían eliminar de manera eficiente el — radical, un ROS típico que ocurre en las células. Sin embargo, la bioactividad relativa disminuyó en el orden poliumósido > forsytósido B >acteósido. Este orden también es paralelo al de los efectos citoprotectores (tabla 2). Este hallazgo indica que el efecto general del resto ramnosilo o del resto apiosilo es potenciar los efectos citoprotectores o de eliminación de ROS.
4. Materiales y métodos
4.1. Químicos y Animales
Acteoside (número CAS: 61276-17-3, 97 por ciento), forsythoside B (número CAS: 81525-13-5, 97 por ciento) se obtuvieron de BioBioPha (Kunming, China, suplemento 3). Nuestro equipo aisló el poliumósido (número CAS: 94079-81-9, 97 por ciento) de la hierba china tradicionalCallicarpa periHT Chang (Suplemento 3). El DPPH・,(±)-6-hidroxilo-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Trolox), 2,9-dimetil{{ 9}},10-fenantrolina (neocuproína), 2,4,6-tripyridyltriazine (TPTZ) y pirogalol se adquirieron de Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Shanghai, China). (NHq'ABTS [2,2'-azino-bis (3-etilbenceno-tiazolina-6-sal de diamonio del ácido sulfónico)] se obtuvo de Amresco Chemical Co. (Solon, OH, EE. UU.). PTIO・El radical se adquirió de TCI Development Co., Ltd. (Shanghai, China) El ácido cafeico se adquirió del Instituto Nacional para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos (Beijing, China) Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS) y la tripsina se adquirieron de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). El kit de ensayo de anexina V/yoduro de propidio (PI) se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). Todos los demás reactivos eran de grado analítico.
Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (SD) de 4 semanas de edad del Centro Animal de la Universidad de Medicina China de Guangzhou. El protocolo de este experimento se realizó bajo la supervisión del Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad China de Guangzhou (Número de aprobación 20170306A).
4.2. Ensayos de reducción de metales (FRAP& CUPRAC)
Los ensayos de reducción de metales incluyen el Fe3 más-ensayo de poder reductor y Cu2 más- ensayo de poder reductor. la Fe3 másEl ensayo de reducción fue establecido por Benzie y Strain y se denomina formalmente FRAP [20]. El protocolo experimental de este ensayo se describió en un informe anterior [9]. Brevemente, el reactivo FRAP se preparó recientemente mezclando TPTZ 10 mM, FeCl 20 mM3,y tampón de acetato {{0}}.25 M en una proporción de 1:1:10 a pH 3.6. La muestra de prueba (x=4-20 L, 0,05 mg/ml) se añadió a (20 — x) de etanol al 95 por ciento seguido de 80 RL de reactivo FRAP. Después de una incubación 30-min a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 595 nm utilizando un lector de microplacas (Multiskan FC, Thermo Scientific, Shanghái, China). El poder reductor relativo de la muestra se calculó mediante la siguiente fórmula:
donde unmáximofue la absorbancia máxima de la mezcla de reacción con la muestra, y Amines la absorbancia mínima en la prueba. A es la absorbancia de la muestra.
cobre2 másEl poder reductor también puede caracterizar el nivel de antioxidantes y, por lo tanto, se denomina CUPRAC. Este ensayo se llevó a cabo de acuerdo con un método publicado previamente [36]. Brevemente, 12 RL de solución acuosa de CuSOq (10 mmol/L), 12 RL de solución etanólica de neocuproína (7,5 mmol/L) y (75 — x) RL de CH3COONH4Se añadió solución tampón ({{0}},1 mol/L, pH 7,5) a pocillos con diferentes volúmenes de muestra (0,05 mg/mL, 4-20 |^L). Se midió la absorbancia a 450 nm después de 30 min utilizando el lector de microplacas antes mencionado. La potencia relativa de CUPRAC se calculó utilizando la fórmula para FRAP. Amáximofue la absorbancia máxima de la mezcla de reacción con la muestra, y Amines la absorbancia mínima en la prueba. A es la absorbancia de la muestra.
4.3. ITP0・-Ensayo de barrido
Los ensayos de eliminación de PTIO* (a pH 4,5 o pH 7,4) se realizaron según nuestro método [16]. En resumen, la solución de muestra de prueba (x=0-20 ^L, 1 mg/mL para pH 4,5 y {{10}},5 mg/mL para pH 7,4) se agregó a (20 — x) rL de etanol al 95 por ciento, seguido de 80 RL de una solución acuosa de PTIO*. La solución acuosa de PTIO* se preparó utilizando una solución de mantequilla de fosfato (0,1 mM, pH 4,5 o pH 7,4). La mezcla se mantuvo a 37 grados durante 2 horas y luego se midió la absorbancia a 560 nm utilizando el lector de microplacas antes mencionado. El porcentaje de inhibición de PTIO* se calculó de la siguiente manera:
donde A es la absorbancia del control sin la muestra y A es la absorbancia de la mezcla de reacción con la muestra.
4.4. ABTSmás*-Barrido y DPPH*-Ensayos de barrido
El ABTS*más-La actividad depuradora se evaluó de acuerdo con el método [37]. El ABTS plus * se produjo mezclando 0,2 mL de sal diamónica de ABTS (7,4 mmol/L) con 0,2 mL de persulfato de potasio (2,6 mmol/L). La mezcla se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 12 h para permitir que se completara la generación de radicales antes de diluirse con agua destilada (en una proporción de aproximadamente 1:20) de modo que su absorbancia a 734 nm fuera { {16}}.35 土 0.01 usando el lector de microplacas antes mencionado. Para determinar la actividad depuradora, la muestra de prueba (x=4-20 RL, 0,05 mg/mL) se añadió a (20 — x) RL de agua destilada seguida de 80 RL de ABTS más * reactivo, y la absorbancia a 734 nm se midió 3 min después de la mezcla inicial, usando agua destilada como blanco.
La actividad de eliminación de radicales de DPPH* se determinó como se describió previamente [18]. Brevemente, se mezclaron 75 RL de solución de DPPH* (0,1 rM) con las concentraciones indicadas de la muestra (0,025 mg/mL, 5-25 RL) disueltas en metanol. La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min y se midió la absorbancia a 519 nm utilizando el lector de microplacas antes mencionado.
Los porcentajes de ABTS más actividad depuradora y DPPH*-actividad depuradora se calcularon en base a la fórmula presentada en la Sección 4.3.
4.5. UPLC—ESI—Q-TOF—Análisis MS/MS de HPP* Productos de reacción
Este método se basó en nuestro estudio anterior [25]. La solución metanólica de acteósido se mezcló con una solución de radicales DPPH* en metanol en una relación molar de 1:2 y la mezcla resultante se incubó durante 24 h a temperatura ambiente. Luego, la mezcla de productos se filtró a través de un filtro 0.22-Rm y se analizó usando un sistema UPLC equipado con una columna C18 (2,0 mm id x 100 mm, 1,6 Rm, Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.). La fase móvil se utilizó para la elución del sistema y consistió en una mezcla de metanol (fase A) y agua (fase B). La columna se eluyó a un caudal de 0,3 ml/min con el siguiente programa de elución en gradiente: 0-10 min, 60-100 por ciento de A; 10-15 min, 100 por ciento A. El volumen de inyección de la muestra se fijó en 1 RL para la separación de los diferentes componentes. El análisis ESI-Q-TOF-MS/MS se realizó con un Triple TOF 5600másEspectrómetro de masas (AB SCIEX, Framingham, MA, EE. UU.) equipado con una fuente ESI, que se ejecutó en el modo de ionización negativa. El rango de escaneo se estableció en 100-2000 Da. El sistema se hizo funcionar con los siguientes parámetros: voltaje de pulverización de iones, -4500 V; calentador de fuente de iones, 550 grados C; gas de cortina (CUR, N2), 30 psi; gas nebulizador (GS1, aire), 50 psi; Gas tis (GS2, aire), 50 psi. El potencial de desagrupamiento (DP) se fijó en —100 V, mientras que la energía de colisión (CE) se fijó en —40 V con una dispersión de energía de colisión (CES) de 20 V. Los productos RAF
se cuantificaron extrayendo la fórmula molecular correspondiente del cromatograma de iones totales (Suplemento 2).
El experimento antes mencionado se repitió usando forsythoside B, podium side y ácido cafeico. El correspondientem/zlos picos se extrajeron de la fórmula molecular correspondiente del cromatograma de iones totales (Suplemento 2).
4.6. Análisis de espectros UV-Vis-ofFe2 más-Productos Quelantes
la Fe2 más-productos de reacción quelante de acteoside-Fe2 másse evaluaron mediante espectroscopia UV-Vis [13]. Para el experimento, se agregaron 300 de una solución metanólica de acteósido (0.24 mM) a 700 rL de una solución acuosa de FeCl? 4H2O (168 mM). A continuación, la solución se mezcló vigorosamente. Posteriormente, la mezcla resultante se escaneó usando un espectrofotómetro UV-Vis después de una hora (Unico 2600A, Shanghai, China) de 200-850 nm.
El experimento antes mencionado se repitió utilizando forsythoside B, o lado del podio, en lugar de acteoside.
4.7. Ensayo de autooxidación de pirogalol para el anión superóxido (•O2~) La recolección de residuos
La medición de la actividad depuradora del anión superóxido (・.{{0}}) se basó en nuestro método [17]. Brevemente, la muestra se disolvió en etanol a 1 mg/mL. La solución de muestra (x rL) se mezcló con tampón Tris-HCl (980 — x rL, 0,05 M, pH 7,4) que contenía EDTA (1 mM). Cuando se añadieron 20 l de pirogalol (60 mM en HCl 1 mM), la mezcla se agitó a temperatura ambiente inmediatamente. Se midió la absorbancia a 325 nm de la mezcla (Unico 2100, Shanghai, China) frente al tampón Tris-HCl como blanco cada 30 s durante 5 min. La capacidad de eliminación se calculó de la siguiente manera:
4.8. Efecto citoprotector frente a bmMSC estresadas oxidativamente (ensayo MTT)
Las bmMSC se cultivaron de acuerdo con nuestros informes anteriores [38] con ligeras modificaciones. En resumen, se obtuvo médula ósea del fémur y la tibia de una rata. Las muestras de médula se diluyeron con DMEM (baja glucosa) que contenía 10 por ciento de FBS. Las bmMSC se prepararon mediante centrifugación en gradiente a 900 g durante 30 min a 1,073 g/ml de Percoll. Las células preparadas se separaron por tratamiento con tripsina al 0,25 por ciento y se pasaron a matraces de cultivo a 1 x 104/cm2. Se evaluó la homogeneidad de las células cultivadas en las bmMSC en el paso 3 mediante la detección de CD44 mediante el ensayo MTT [39].
El ensayo MTT se utilizó para evaluar el efecto citoprotector del acteósido y sus derivados frente a las bmMSC [40]. El modelo de lesión se estableció en base al estudio previo [41]. El protocolo experimental se ilustra brevemente en la Figura 3.
4.9. Análisis estadístico
Cada experimento en las Secciones 4.2-4.4 y 4.7 se realizó por triplicado, y el experimento de ensayo MTT se realizó por pentaplicado. Los datos se registraron como la media土DE (desviación estándar). Las curvas de dosis-respuesta se trazaron utilizando el software profesional Origin 6.0 (OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.). El valor IC50 se definió como la concentración final del 50 por ciento de inhibición radical (poder reductor relativo) [42]. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional para detectar diferencias significativas utilizando SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.) para Windows.p< 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
5. Conclusiones
Tres glucósidos fenilpropanoides naturales, a saber, acteoside, forsythoside B y podium side, pueden participar en múltiples vías para ejercer la acción antioxidante, incluida la transferencia de ET, H+; y fe2 más-quelante, pero no RAF. El ET y Hmás-las vías de transferencia pueden verse obstaculizadas por el resto ramnosilo o el resto apiosilo; sin embargo, la Fe2 más-La vía de quelación puede verse potenciada por los residuos de azúcar (especialmente el resto ramnosilo). El efecto general del resto ramnosilo o del resto apiosilo es mejorar la capacidad de captación de ROS involucrada en múltiples vías. Por lo tanto, el forsythoside B y el poliumoside son superiores al acteósido en cuanto a efectos citoprotectores.
Materiales complementarios:Los materiales complementarios están disponibles en línea. 1. Curvas de dosis-respuesta; 2. Espectros de HPLC-MS; 3. Certificados de análisis de acteoside, forsythoside B y poliumoside.
Expresiones de gratitud:Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (81573558, 81603269), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2017A050506043) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (2 017A030312009, 2015A030310491).
Contribuciones de autor:Xian Li y Dongfeng Chen concibieron y diseñaron los experimentos; Aichi Wu preparó poliumósido; Yulu Xie, Qian Guo y Penghui Xue realizaron los experimentos con antioxidantes; Ke Li y Wei Zhao realizaron los experimentos MTT; Hong Xie analizó los datos; Jiasong Guo realizó el experimento de la Figura 2D; Xian Li escribió el artículo. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
acteósidoencistanche
abreviaturas
ABTS más • radical 2,2'-azino-bis (3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico)
bmMSCs células madre mesenquimales derivadas de médula ósea
Capacidad antioxidante reductora cúprica de CUPRAC
Radical dAMP 2'-desoxiadenosina-5'-monofosfato
DMEM Medio de Eagle modificado por Dulbecco
dGMP 2/radical -desoxiguanosina-5'-monofosfato
DPPHe Radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazina
transferencia de electrones ET; FBS: Suero bovino fetal
FRAP poder antioxidante reductor de iones férricos;
Transferencia de átomos de hidrógeno HAT
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilo
Transferencia de electrones acoplada a protones PCET
PTIOe Radical 2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxilo 3-óxido
Formación de aductos radicales RAF
Especies reactivas de oxígeno ROS
Transferencia nuclear de células somáticas SCNT
Transferencia secuencial electrón-protón SEPT
Transferencia de un solo electrón con pérdida secuencial de protones SPLET
TPTZ 2,4,6-tripiridil triazina
Trolox (±)-6-hidroxilo-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico
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Disponibilidad de muestras: Los autores pueden proporcionar una muestra del compuesto poliumósido.
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