¿Cómo inhibe la sustancia herbal Acteoside las células tumorales?

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Los productos naturales se caracterizan por una diversidad estructural extrema y, por lo tanto, ofrecen una fuente única para la identificación de nuevos agentes antitumorales. Aquí, informamos que la sustancia herbalacteosideal ser aislado por métodos fitoquímicos avanzados de hojas de Lippia citriodora mostró una mayor citotoxicidad contra las células tumorales metastásicas; actuó en sinergia con diversos agentes citotóxicos y sensibilizó células cancerosas quimiorresistentes.Acteosidede herba cistanchceno fue tóxico en contextos celulares fisiológicos, mientras que aumentó la carga oxidativa, afectó la actividad de los módulos proteostáticos y suprimió las metaloproteinasas de la matriz en líneas celulares tumorales. Administración intraperitoneal u oral (vía agua potable) decistancheacteoside en un modelo de ratón melanoma, las respuestas antioxidantes reguladas al alza en los tumores; sin embargo, solo el parto intraperitoneal suprimió el crecimiento tumoral e indujo respuestas inmunes antititumorales reactivas. Los análisis de identificación/cuantificación por espectrometría de masas revelaron que la administración intraperitoneal deacteosideresultó en una concentración significativamente mayor, en comparación con la administración oral, en el plasma y los tumores de los ratones tratados, lo que sugiere que es un efecto antitumoral in vivo depende de la vía de administración y la concentración alcanzada en el tumor. Finalmente, los estudios de modelado molecular y los ensayos de actividad enzimática mostraron que el acteoside inhibe la proteína quinasa C. Concluyentemente, el acteoside es prometedor como un andamio químico para el desarrollo de nuevos agentes antitumorales.

Palabras clave:Acteoside, Cáncer, Compuesto natural, Estrés oxidativo, Proteostasis, Inmunomodulación

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1. Introducción

La carcinogénesis se caracteriza por la desregulación de varias vías de señalización celular y se asocia con un aumento del estrés celular oxidativo, replicativo, metabólico, genotóxico y proteotóxico celular [1]. Para adaptarse y superar estos fenotipos de estrés, las células malignas regulan al alza (aparte de los oncogenes) varias vías no oncogénicas con el objetivo de suprimir o (al menos) aliviar el estrés en curso. Entre las diversas vías no oncogénicas que se encuentran frecuentemente reguladas al alza durante la tumorigénesis se encuentran los módulos de la red de proteostasis (PN) junto con las respuestas antioxidantes celulares [2,3].

Los componentes clave de la PN son las dos principales maquinarias de degradación, a saber, la vía autofagia-lisosoma (ALP) y la vía ubiquitina-proteasoma (UPP), junto con la red de las chaperonas moleculares celulares. La ALP está involucrada principalmente en la degradación de agregados de proteínas y orgánulos dañados [4], mientras que la UPP degrada las proteínas normales de vida corta y las proteínas mal plegadas o desplegadas no reparables [5–8]. El proteasoma 26Seukaryotic está constituido a partir de las partículas reguladoras 19S (RP) y la partícula 20 Score (CP); este último se compone de cuatro anillos heptaméricos apilados (dos de tipo α que rodean dos de tipo β) que forman una estructura similar a un barril. Las actividades de la proteasa similar a la quimotripsina (CT-L), similar a la tripsina (T-L) y a la proteasa similar a la caspasa (C-L) se encuentran en las subunidades proteasómicas β5, β2 y β1, respectivamente [6]. La eficacia clínica demostrada de los inhibidores del proteasoma Bortezomib (Velcade®; también llamado PS-341) y Carfifilzomib contra diversas neoplasias malignas hematológicas [9] ha proporcionado la "prueba de concepto" de dirigirse a la UPP como una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer. La compleja red de vías de defensa antioxidantes celulares que con frecuencia se regulan al alza durante la carcinogénesis [3,10] incluye enzimas antioxidantes, así como varios factores de transcripción que movilizan las respuestas genómicas citoprotectoras; estos incluyen la caja de tenedor O (Foxo) y el factor nuclear eritroide 2 relacionado con el factor (Nrf-2). Nrf-2 es fundamental en la protección de las células contra el daño oxidativo y / o xenobiótico, ya que estimula la expresión de genes antioxidantes y de fase II [11-13].

Nosotros y otros hemos propuesto recientemente que dirigirse a estas dependencias tumorales (es decir, módulos proteostáticos y / o vías de respuesta antioxidante) o aumentar los niveles celulares de ROS en el contexto de un genotipo transformado ofrece una ventana terapéutica potencial para la eliminación selectiva de células tumorales [3,14]; en apoyo, se ha reportado la muerte selectiva de células cancerosas por una molécula pequeña que reguló al alza los niveles celulares de ROS [2]. Se espera que los enfoques combinatorios, incluida también la activación de respuestas inmunes reactivas antitumorales [15], probablemente maximicen la ventana terapéutica ofrecida al inhibir las respuestas de PN y antioxidantes y / o al elevar los niveles celulares de ROS.

Los productos naturales (extractos o compuestos puros) (NP) de diversas fuentes (plantas, organismos marinos, microorganismos, etc.) son examinados por su capacidad para actuar como agentes antitumorales debido a su extrema diversidad estructural y complejidad química, así como porque actúan pleiotrópicamente modulando varias vías de señalización celular [16]. Según se informa, los NP activan las respuestas antiinflamatorias, antitumorales y / o antimetastásicas [16,17] y también evaden la resistencia a múltiples fármacos [18,19]. Entre estos, los compuestos fenólicos (incluidos los glucósidos feniletanoides) han atraído un interés significativo debido a su papel reportado en la prevención y / o tratamiento de diversas enfermedades humanas.

Acteoside, también llamado kusagin o verbascoside [20], es un glucósido feniletanoide aislado de muchas dicotiledóneas. Según se informa, el acteoside ejerce algunas actividades biológicas interesantes, incluidas las propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y reguladoras de la apoptosis celular [21,22]. Sin embargo, no se ha abordado su potencial actividad antitumoral. Informamos aquí, que el acteoside mostró una mayor citotoxicidad contra las células cancerosas de mamíferos sin efectos tóxicos aparentes en contextos celulares fisiológicos. Además, acteoside suprimió el crecimiento tumoral de melanoma en un modelo de ratón in vivo, activando (entre otros) las respuestas inmunes antititumorales reactivas.

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2. Materiales y métodos

2.1. Material vegetal y extracción

Las hojas secas de Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) se compraron en el mercado local de Atenas, Grecia. Las hojas fueron pulverizadas y extraídas por agitación mecánica durante 12 h con metanol (2 × 20 L). El extracto metanólico se evaporó hasta la sequedad y se lavó con una mezcla de CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L). El residuo insoluble se separó y se secó, produciendo un polvo verde-amarillo (450 g).

2.2. Purificación del análisis de acteoside y UPLC-HRMS

Una porción (10 g) del residuo mencionado se sometió a cromatografía a contracorriente utilizando un aparato de cromatografía de partición centrífuga rápida (FCPC) (Kromaton, Francia); se utilizó una mezcla de EtOAc/EtOH/H2O en relación 5/0,5/4,5 como sistema de disolvente bifásico. Las fracciones recolectadas fueron sometidas a Cromatografía de Capa Delgada; luego se observaron los cromatogramas bajo una lámpara UV (254 y 365 nm) y se visualizaron rociando con sulfato de vainillina de metanol seguido de calentamiento durante dos minutos. Un total de 2,1 g de acteoside (pureza ≥ 90%) fue aislado por el proceso antes mencionado. La identificación de acteoside se realizó mediante espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas (MS), mientras que su pureza se estableció mediante análisis UPLC-MS y RMN; para obtener más información, consulte la Supl. Materiales y métodos.

2.3. Líneas celulares

Fibroblastos embrionarios de pulmón humano (células IMR90) junto con la B16. F1, B16. Las líneas celulares de ratón F10, YAC-1 y WEHI-164 se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC). Las líneas celulares de osteosarcoma humano U2 OS y Sa OS fueron amablemente donadas por el Prof. V. Gorgoulis (Escuela de Medicina, Universidad Nacional y Kapodistriana de Atenas, Grecia), mientras que las células de osteosarcoma KH OS y las líneas celulares de osteosarcoma quimiorresistente [23] fueron una donación del Dr. E. Gonos (Fundación Nacional de Investigación Helénica, Grecia). Las líneas celulares de cáncer de ratón C5N y A5 pertenecen a un modelo de carcinogénesis cutánea de ratón de varias etapas [24,25] y fueron donadas por el Prof. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, Universidad de California, EE. UU.). Las condiciones de cultivo de las líneas celulares utilizadas se informan en la Supl. Materiales y Métodos.

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2.4. Modelo de ratón melanoma

Los ratones machos C57BL/6 (25-30 g de peso, 6-8 semanas de edad) fueron obtenidos del Instituto Helénico Pasteur y alojados bajo temperatura controlada (22 °C) y fotoperiodo (12 h luz: 12 h oscuro) con libre acceso a agua y alimentos. Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea con 105 B16. Células de melanoma F1 (en PBS de 100 μL) y se asignaron aleatoriamente a 3 grupos (n = 5/grupo). Cuando los tumores se hicieron palpables (día 11) los ratones recibieron acteoside a través de dos vías; ya sea por vía intraperitoneal (IP) (1 mg/ratón diluido en 200 μL de PBS; en total 6 dosis administradas cada dos días) o por vía oral con agua potable (OR) (2,5 mg/ratón; en total 13 dosis durante 13 días consecutivos). A los ratones control se les administró PBS. El crecimiento tumoral se registró cada 2 días midiendo los ejes mayor y menor de los tumores formados con una pinza digital. Las mediciones se transformaron en volumen tumoral utilizando la fórmula: volumen tumoral (cm3) = eje mayor × eje menor2 × 0,5. El día 28, los animales fueron sacrificados por luxación cervical, y los bazos fueron extirpados asépticamente. El experimento se repitió tres veces con hallazgos similares.

Los esplenocitos se aislaron de bazos homogeneizados individualmente e inmediatamente se analizaron su citotoxicidad frente a B16. Objetivos celulares F1, YAC-1 y WEHI-164. La citotoxicidad se evaluó en base a la detección de exposición a CD107 en la superficie celular, como resultado de la degranulación de células efectoras. Los esplenocitos (105 células/pozo) se cocultivaron con objetivos en microplacas de fondo U de 96 pocillos en una relación efector-objetivo (E: T) de 100:1, a 37 °C en 5% de CO2. Se agregaron anticuerpos monoclonales conjugados con FITC anti-CD107a y anti-CD107 b (25 μL/mL) y monensina (6 μL/mL; todos de BD Biosciences) en cada pozo. Las células se recolectaron 6 h más tarde y se analizaron utilizando un citómetro FACSCanto II flflow. Paralelamente, los tumores fueron extirpados y procesados para ensayos posteriores como se describe en el Suplemento Materiales y Métodos.

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