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Discusión

Los fundamentos moleculares de la formación de engramas han sido un área de gran interés. Aquí aprovechamos el modelo de ratón TRAP para dilucidar la dinámica de la accesibilidad a la cromatina, la arquitectura genómica 3D y la expresión génica a lo largo de la vida útil de una célula de engrama. Primero, mostramos directamente quememoriaLa codificación tiene un efecto vasto y duradero en la accesibilidad de la cromatina. Una vez que se establece este estado de cromatina, eventos posteriores comomemoriala consolidación y el recuerdo parecen tener un efecto menor en el panorama de la cromatina. Es posible que el punto de tiempo elegido para el recuerdo no capture completamente los eventos de cromatina de las células reactivadas y los cambios posteriores de cromatina puedan estar asociados conmemoriareconsolidación o extinción8. Es importante destacar que, en línea con las publicaciones anteriores12, 13,23, nuestros datos sugieren quememoriala formación es en gran medida un fenómeno impulsado por potenciadores.

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En segundo lugar, nuestro estudio proporciona el primer panorama completo de la arquitectura del genoma 3D durante diferentes fases dememoriaformación, ya que mostramos la relocalización de grandes segmentos de cromatina y las interacciones promotor-potenciadoras específicas dinámicas dentro de estos compartimentos que permiten el ajuste fino de diferentes programas transcripcionales. Además, mostramos que los promotores de genes regulados a la baja interactúan con mayor frecuencia con potenciadores que albergan represores transcripcionales y viceversa.

Por último, nuestro trabajo proporciona la primera evidencia de un evento de cebado funcional, que se caracteriza por un aumento inicial en la accesibilidad del potenciador durante la codificación, sin cambios transcripcionales esperados. Nuestro análisis reveló que con la reactivación, las neuronas de engrama utilizan un subconjunto de interacciones denovopromoter-potenciador, donde los potenciadores cebados se ponen en contacto con sus respectivos promotores para regular al alza los genes involucrados en el transporte de ARNm y la traducción local de proteínas en compartimentos sinápticos. Estos cambios correspondieron a los cambios morfológicos y funcionales esperados. Colectivamente, parece que las células de engrama están marcadas a nivel epigenético y la interacción entre la accesibilidad a la cromatina, la arquitectura del genoma 3D y las interacciones promotor-potenciador describen un sistema bien coordinado que conduce a un aumento transcripcional retrasado durante la reactivación del engrama.

Al igual que con cualquier trabajo, hubo varias limitaciones en el estudio. El uso de los ratones TRAP dependientes de tamoxifeno permite la resolución temporal, pero abre una ventana de etiquetado de aproximadamente 12 horas que podría resultar en un marcado inespecífico de neuronas que no forman parte de la experiencia de CFC. Además, como se sugirió anteriormente37, las neuronas marcadas con arco podrían ser heterogéneas e incluir diferentes conjuntos que regulan ambos.memoriadiscriminación y generalización. Además, cualquier punto de tiempo antes de 1,5-2 horas (temprano), no será suficiente para capturar eventos transcripcionales y traslacionales causados por la recombinación del ADN, es decir, la expresión de cre recombinasa y la expresión final del gen eYFP5. Por lo tanto, creemos que se perdieron muchos grupos transitorios tempranos de DEG, ya que se demostró anteriormente que muchos IEG regresan a los niveles basales después de 2h (excepto Arc46). Por último, aunque nuestro estudio se centró en el hipocampo, la plasticidad estructural y sináptica se ha relacionado con el almacenamiento a largo plazo de información en otras regiones del cerebro, como la corteza prefrontal, la amígdala2. Los estudios futuros deben determinar si estas alteraciones epigenéticas pueden representar un proceso crítico global involucrado en la formación y retención de recuerdos a largo plazo o si es exclusivo de los circuitos del hipocampo.

Métodos

Ratones y comportamiento

Como se describió anteriormente6, los ratones ArcCreERT2(+) fueron criados con la línea homocigota R26R-STOP-floxed- yellow fluorescent protein (eYFP). ~ 140 descendientes masculinos posteriores fueron genotipados utilizando el protocolo de genotipado del Laboratorio Jackson. Los ratones fueron alojados de cuatro a cinco por jaula en una habitación de colonia de 12 horas (06:00-18:00) de luz-oscuridad a 22 ° C con 40-60% de humedad. Se proporcionaron alimentos y agua ad libitum. Las pruebas de comportamiento se realizaron durante la fase de luz. 1h antes de la prueba de comportamiento, los ratones recibieron una dosis de 4-hidroxitamoxifeno (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), lo que abre una ventana de etiquetado de ~ 12 horas5. Con el fin de minimizar la etiqueta eYFP inespecífica, un día antes de la tarea de comportamiento (por ejemplo, CFC), los ratones fueron alojados en un cuarto oscuro / oscuro las 24 horas. Además, para reducir los niveles de ansiedad, se agregó un tubo a la jaula para refugiarse y anidar. Al día siguiente, los ratones fueron inyectados con TAM 1h antes del CFC. Después de la tarea de comportamiento, los ratones fueron sacrificados después de 1.5-2 h, y se recolectaron cerebros. o colocado de nuevo en el cuarto oscuro durante las siguientes 48 horas. Después de que los ratones fueron sacados de la oscuridad, fueron devueltos al ciclo normal de 12 horas (06:00-18:00) luz-oscuridad, en la misma habitación. 3 días después (total de 5 días después del CFC), la mitad de la cohorte de ratones fueron sacrificados y el cerebro fue recolectado, mientras que la otra mitad regresó a la sala de pruebas, donde fueron expuestos a la señal que induce el miedo (tono y contexto). Todo el trabajo con ratones fue aprobado por el Comité para el Cuidado de animales de la División de Medicina Comparada del Instituto de Tecnología de Massachusetts. Cistanche puede mejorarmemoria.

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Condicionamiento contextual del miedo

El aparato de condicionamiento contextual del miedo (CFC) y el programa de adquisición fueron de TSE-Systems. Los ratones se introdujeron en la cámara de CFC, después de 3 minutos de habituación inicial se presentó un tono de 3 kilo Hz con una intensidad de 80 DB durante 30 segundos y se co-terminó con un choque de pie de 0,7 mA durante 1 seg. Se utilizó isopropanol al 70% entre experimentos para limpiar las jaulas. 5 días después, los ratones se introdujeron en el contexto condicionado original junto con el tono y los niveles de congelación se midieron durante 3 minutos (parámetros predeterminados del software TSE utilizados para monitorear los comportamientos de congelación), para evaluar el contextomemoria. El contexto B fue un contexto A modificado. Las barras de acero inoxidable se cubrieron con un inserto de plástico blanco, las paredes exteriores de las cámaras se cubrieron con formas de cinta adhesiva para cambiar la apariencia de la cámara. La cámara estaba perfumada con vainilla, la iluminación de la habitación era mucho más brillante y los ratones eran transportados al aparato en un carro diferente del contexto A.

Drogas

La recombinación en ratones transgénicos ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP se indujo utilizando 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). El 4-OHT se disolvió en 2,5 ml de EtOH /100% y se meció en un agitador durante 30 min. A continuación, se agregaron 5 ml de aceite de maíz y se mecieron en una coctelera durante 1 hora. Finalmente, se colocaron tubos durante 30 minutos a 60 ° C para permitir la evaporación completa de EtOH. La inyección única de 50 mg/kg se inyectó por vía intraperitoneal (p.i.).

Inmunohistoquímica (IHC)

Los ratones fueron perfundidos transcárdicamente con 25 ml helados de solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido de 40 ml de paraformaldehído al 4% en PBS. Los cerebros se extrajeron y se fijaron posteriormente en PFA al 4% durante la noche a 4 ° C y se transfirieron a PBS hasta la seccionamiento. Los cerebros se montaron en una etapa de vibratomo (Leica VT1000S) utilizando superpegamento y se seccionaron con un grosor de rebanada de 40 μm. Las rebanadas se lavaron con PBS y se bloquearon utilizando albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % preparada en PBS que contenía 0,1% de Tritón-X100 (PBST) durante 2 h a temperatura ambiente. Se aspiró el tampón de bloqueo y las rebanadas se incubaron con el anticuerpo primario apropiado (Tabla suplementaria 11) durante la noche a 4 ° C en un agitador. Las rebanadas se lavaron tres veces 15 minutos cada una con el tampón de bloqueo, y luego se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados Alexa Fluor 488, 594 o 647 durante 2 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados de 15 minutos cada uno con tampón de bloqueo y un lavado final con PBS durante 10 minutos, se montaron rodajas con fluromount-G (Electron microscopic Sciences). Cistanche puede mejorarmemoria.

Hibridación in situ (RNAscope®)

Las muestras se prepararon en base a las instrucciones del fabricante para el ensayo fluorescente múltiple v2 de RNAscope® (Advanced cell diagnostics, EE. UU.), con pocas modificaciones y combinado con el protocolo de inmunohistoquímica (IHC). En primer lugar, las muestras se tiñeron para anticuerpos primarios (Arc y GFP) y secundarios (Alexa Fluor 488 y 594, respectivamente) (como se describe en el protocolo IHC anterior). Las rebanadas de cerebro se incrustaron en un portaobjetos de vidrio y

deshidratado durante 30 min en RT. A continuación, se dibujó una barrera alrededor de cada sección con la pluma hidrofóbica Immedge™ y las muestras se trataron con peróxido de hidrógeno RNAscope® durante 10 min a RT (no se aplicó recuperación de objetivos y tratamiento de proteasa). Según las instrucciones del fabricante, las secciones se sometieron a hibridación de sonda (RNAscope® Probe- Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), amplificación y desarrollo de señal HRP-C1 utilizando el canal TSA® Plus Cyanine 5. Cistanche puede mejorar la memoria.

Análisis de imágenes

Las imágenes se adquirieron utilizando microscopios confocales LSM 710 o LSM 880 (Zeiss) con objetivos de 10×, 20×, 40× o 63× en entornos idénticos para todas las condiciones. Las imágenes se cuantificaron utilizando ImageJ 1.42q o Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Zurich, Suiza). Para cada condición experimental, se utilizaron cinco secciones coronales de al menos cinco animales para la cuantificación. Cistanche puede mejorar la memoria.

Cuantificación de celdas marcadas: el módulo de superficies se utilizó para detectar celdas Arc+ y eYFP+. Las celdas positivas dobles (colocalización de Arc+/eYFP+) se contaron utilizando el módulo Xtension de superficie a superficie. Después de aplicar el filtro de "área" (>6μM) para eliminar el etiquetado inespecífico, la cuantificación de las células doblemente positivas se llevó a cabo en el CA1, CA3 y DG. Cistanche puede mejorar la memoria.

Cuantificación de proteínas Eif y Gria1 / ARNm: el módulo de superficies se utilizó para detectar y renderizar 3D los axones de las neuronas en función de la señal GFP. Los puntos positivos de EiF2a, Eif4E, Eif3E y Gria1 se contaron utilizando el módulo de manchas. Finalmente, se ejecutó el módulo Spots Close - To -Surface Xtension para encontrar el subconjunto de puntos que están más cerca de los objetos de superficie que el umbral definido de 1uM, y la exclusión de puntos que caen fuera de este rango.

Morfología de las espinas: las espinas se clasificaron en tres tipos en función de la longitud de la columna vertebral (L), el diámetro de la cabeza (Dh) y el diámetro del cuello (Dn). Espinas rechonchas – Dn = L, Espinas delgadas – L > Dn y Dh ≥ Dn, Espinas de hongos – Dh ≥ 2Dn, Espinas de hongos agrandadas – Dh ≥ 2Dn.Cistanche puede mejorar la memoria.

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Preparación de tejidos

Se extrajo tejido del hipocampo y se congeló el flash. Después de la extracción, las muestras se homogeneizaron inmediatamente en PBS helado de 0,5 ml con inhibidores de la proteasa (Pi) (11836170001, Roche). Para mitigar el impacto de clasificación tanto como sea posible, solo en experimentos NC-RNAseq y capture-HiC, la suspensión se fijó con 1% (para NC-RNAseq / HiC) o 2% (pc-HiC) de paraformaldehído durante 10 min, se apagó con Glycine 2.5M durante 5 min y se lavó dos veces con 5 ml de PBS. Este proceso preserva el panorama transcripcional y de cromatina y minimiza el sesgo de clasificación. Para ATACseq, RNAseq y capture-HiC, la suspensión se centrifuga a 1200 g, 4°C, durante 5 minutos y el pellet se resuspendió en tampón hipotónico NF-1 de 5 mL (0,5% Tritón X-100/0,1M De Sacarosa/5mM MgCl2/1mM EDTA/10mM Tris-HCl, pH 8,0, Pi). A continuación, la suspensión se homogeneizó con dobleza (mortero A) con 30 golpes y el mortero se lavó con un tampón NF-1 adicional de 5 ml para un total combinado de 10 ml. La suspensión se recogió en un tubo cónico de 15 ml, se filtró con un filtro de malla de 70 μm (08-771-2, Falcon) y se incubó en hielo durante 30 min. Los núcleos granulados (todas las centrífugas fueron de 4°C, 1.600 × g durante 15 min) se resuspendieron en PBS+1%BSA+Pi de 10 ml y se incubaron en hielo durante 1 h. Los núcleos se hicieron girar hacia abajo y el pellet se resuspendió en PBST + 1% BSA + Pi de 1 ml y se incubó con anticuerpos primarios NeuN, Arc y GFP durante la noche en 4 ° C. Los anticuerpos no unidos se eliminaron dos veces con 5 ml de PBS y finalmente se resuspendieron en 1 ml de PBS + 1% BSA + Pi y anticuerpos secundarios durante 2-4 h a 4 ° C. Después de dos lavados, los núcleos se resuspendieron en 0,5 ml (PBS + 1% BSA + Pi) y se filtraron con un filtro de malla de 40 μm para la clasificación FACS. El diclorhidrato de 4′,6-diamidina-2′-fenilindol (DAPI) se agregó directamente a los tubos FACS (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche puede mejorarmemoria.

Citometría de flujo

Para la citometría de flujo, los núcleos se cerraron primero utilizando parámetros de área de pulso de dispersión hacia adelante y lateral (FSC-A y SSC-A) excluyendo los desechos, seguidos de la exclusión de agregados utilizando el ancho de pulso (FSC-W y SSC-W). Luego, se utilizó la tinción de control de isotipos para establecer puertas NEUN +, ARC + y GFP +. Para asegurar una población neuronal homogénea, la población NeuN+ fue cerrada antes de cerrar las poblaciones basadas en la fluorescencia ARC+ y GFP+. Clasificamos cuatro poblaciones diferentes de tres puntos de tiempo diferentes; Aproximadamente 1,5-2 horas después de la exposición a FS i) NeuN+/GFP+ ii) NeuN+/GFP-. Después de cinco días, en ausencia de recuperación, recolectamos iii) NeuN+/GFP+. En una cohorte diferente, los ratones fueron reexpuestos al estímulo condicionado. 1.5–2 horas después de la reexposición recolectamos iv) NeuN+/ARC+/GFP+. Todos los núcleos se clasificaron en tubos de Eppendorf de 1,5 ml que contenían; 500 μl PBS+1%BSA+Pi para ATCAseq, 200 μl de tampón de digestión (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Cat. AM1975, Invitrogen) para RNAseq, tampón de lisis helada fresca de 500 μl (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA-630, Pi y agua de grado PCR) para Hi-C/capture-HiC. El análisis de los datos se realizó con Flowjo (v10).

ChIP-qPCR

Inmediatamente después de la siguiente clasificación, se peletizaron 10.000 células a 4 °C, 1.600 × g durante 15 min y se resuspendieron en tampón de lisis SDS. ChIP se llevó a cabo en base a las instrucciones del fabricante para chIP-IT High Sensitivity® (HS) Kit (Catalog No. 53040, Active Motif, USA) utilizando anticuerpos anti-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) y anti-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100). Los ensayos de ChIP se realizaron en una unidad de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX96 connect utilizando la mezcla de reactivos SsoFast™ EvaGreen® qPCR (Bio-Rad, 172–5202). Las muestras se ensayaron por triplicado y los resultados se normalizaron a la entrada. Las secuencias de pares de cebadores para los ensayos ChIP-qPCR se enumeran en la Tabla suplementaria 12.

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ATAC-seq

preparación de bibliotecas—Las bibliotecas atac seq se prepararon como se describió anteriormente en49 con modificaciones menores. Se extrajeron 10.000 células de cada grupo de 8 a 10 ratones diferentes y se consideraron como N = 1. Se utilizaron 3-4 réplicas biológicas (N = 3-4) para la preparación de la biblioteca. Inmediatamente después de la siguiente clasificación, las células se hicieron girar hacia abajo (4 ° C, 1,600 × g durante 15 min) y se resuspendieron en un tampón de lisis fría fresco de 50 ul (0.15% NP-40 en lugar de Igpal) y se mecieron en hielo durante 10 min. A continuación, la reacción de segmentación (Kit de preparación de muestras de ADN de Nextera 24 reacciones, FC-121-1030, Illumina) se llevó a cabo en volumen de 25 ul (12,5 μl TD, 1,25 μl TDE1, 11,25 μl de agua libre de nucleasa), durante 30 min a 37c con balanceo suave. Los fragmentos de ADN aumentados se amplificaron y codificaron mediante una reacción de PCR (1 ciclo; 5 minutos - 72c, 30 segundos - 98c, 10 ciclos; 15 segundos - 98c, 30 segundos - 60c, 3 minutos - 72c). Siguiendo el protocolo del fabricante, el ADN amplificado se limpió y purificó utilizando 1,8 perlas AMPure (cuentas AmpureXP, Beckman Coulter, A63880). Después del control de calidad del bioanalizador para el tamaño y la distribución de la biblioteca, las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma Illumina Nextseq 550 en el Centro BioMicro del MIT. Cistanche puede mejorar la memoria。

Análisis ATAC-seq: los datos fastq brutos de las lecturas de secuenciación de extremo pareado de 40 pb se alinearon con el genoma de referencia mm9 del ratón utilizando Bowtie 2.0 en modo de extremo pareado50. La colección Samtools51 se utilizó para ordenar, eliminar duplicados de PCR (rojo hacia arriba), indexar archivos BAM (índice) y calcular estadísticas de biblioteca (flagstat, consulte la Tabla suplementaria 13). Los archivos BAM se redujeron de lecturas correctamente alineadas, emparejadas y únicas a 50M. Los picos de cromatina abiertos se analizaron utilizando el software MACS252 Las regiones diferencialmente accesibles (DAR) fueron identificadas por Diffbind v1.16.353 con parámetros y configuraciones predeterminados para usar DESeq2 (corte; FDR< 0.01;="" fold="" changes="">1.5). La matriz completa de recuentos normalizados (RPKM54) fue recuperada por el paquete DiffBind. Para una generación de pistas de peces gordos, los archivos de señal de acumulación (acumulación de fragmentos por millón de lecturas) en formato de biografía se construyeron utilizando la función de pico de llamada MACS2 con las banderas -B -SPMR. Luego, se generó un enriquecimiento de pliegue normalizado (FE) sobre pistas lambda de entrada utilizando la función bdgcmp deMACS2 con el ajuste - m FE. Luego, los archivos bedGraph se convirtieron al formato bigwig. Cistanche puede mejorar la memoria

Se utilizaron herramientas IGV55 para la visualización de archivos de peces gordos. ChromHMM56 se utilizó para establecer un modelo de estado de cromatina a partir de dos estudios independientes que utilizaron tejido de hipocampo a granel antes y después del choque del pie21,22 y para determinar las ofertas de enriquecimiento de pliegues sobre el modelo de estado. El análisis de enriquecimiento de motivos57,58 y la anotación de picos fueron realizados por las herramientas HOMER59. Todos los códigos están disponibles en un archivo de software complementario