Parte 5: Mapeo de la interacción epigenómica y transcriptómica durante la formación y el recuerdo de la memoria en el conjunto de engramas del hipocampo

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Datos extendidos Fig. 2: Los DAR estables se enriquecen predominantemente para las marcas de potenciadores

a) Flujo de trabajo para la disección por citometría de flujo de las diferentes poblaciones neuronales del hipocampo, durantememoriaformación y recuperación. Gráficos representativos de FACS que muestran la expresión de toda la población (panel izquierdo). Se realizó una selección adicional en núcleos individuales y población NeuN+ /DAPI+ (panel medio). Por último, la selección se realizó sobre la subpoblación cerrada; GFP+ (ajustado a ~2.5% de todas las células), ARC+/GFP+ (~0.15% de todas las células) y núcleos se clasificaron a tubos de Eppendorf de 1.5 ml recubiertos con 200ul de PBS al 1%.

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(b) Diagrama de Venn (izquierda) y tabla (derecha), ilustran la superposición entre los DAR identificados en las diferentes comparaciones por pares durantememoriaformación y recuerdo.

c) Se realizó un análisis estadístico basado en el muestreo para determinar si los enriquecimientos de los estados de cromatina sobre las emisiones de cromAMM (observadas) son estadísticamente significativos. El enriquecimiento esperado se calculó mediante la realización de 10.000 conjuntos aleatorios de superposiciones (permutaciones) entre "todos los sitios accesibles" y "todos los sitios de modificación de histonas (es decir, todas las emisiones)" loci y se presentó como un histograma en la figura. El tamaño de la muestra de cada conjunto aleatorizado se determinó por el tamaño de los DAR de cada estado. Se calculó la media y la desviación estándar de la muestra (Tabla suplementaria 3). El número de superposiciones observadas entre los DAR y cada emisión se calculó y presentó como líneas. la puntuación z se calculó como barbechos; Z = (valores observados (X) – media de la muestra (μ))/(desviación estándar de la muestra (σ)). z-score Basal vs. Temprano; S.E 10.5, W.E 6.9. Estable; S.E 16.9, W.E 12.7, todos p< 0.0001,="" z-score="" early="" vs.="" late;="" s.p="" 91.7,="" w.p="" 38.7.="" late="" vs.="" reactivated;="" s.p="" 26.8,="" w.p="" 28.9,="" all=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

d) El gráfico circular muestra el porcentaje de diferentes estados potenciadores para todas las regiones estables. La superposición de cada región estable se realizó con datos ChIP-seq de H3K4me1 y H3K27ac publicados anteriormente, obtenidos 1h después de FS21. Los estados potenciadores se clasificaron como "cebados" – superposición con regiones marcadas con solo H3K4me1, 'activo' – con H3K4me1 / H3K27ac o 'latente' – sin superposición.

(e) Motivos identificados a partir de regiones libres de nucleosomas (NFR) en las pistas ATAC-seq de cada estado (Basal, Activado -temprano, Activado -tardío y Reactivado). Los picos se dividieron en posiciones que se anotaron a los promotores (5kb de TSS) y potenciadores (>5kb de TSS). El tamaño del círculo indica el porcentaje de enriquecimiento (1-50%). Color indica –log(P-value).

Datos extendidos Fig. 3: Cebado coordinado del estado epigenético durantememoriacodificación y

(a) Las propiedades de las interacciones detectadas por Chicago en cada fase (Basal, Activado -temprano, Activado -tardío y Reactivado). La configuración predeterminada y un umbral de puntuación de 5 se utilizaron en llamadas de interacción significativas, realizadas conjuntamente en todas las réplicas.

(b) El gráfico circular representa el porcentaje de todas las interacciones detectadas por Chicago que están demarcadas por H3K27ac / H3K4me1 (marcas potenciadoras del 67.5%), H3K4me3 / H3K9ac (marca de promotores del 46.2%) o H3K27me3 (marcas represivas del 1.1%).

(c) Imagen del navegador del epigenoma WashU, que abarca una región de ~ 500 Kb alrededor de los genes Eif4e2. Los arcos muestran potenciadores comunes significativos (rectángulo rojo) y únicos (flechados) que interactúan con los promotores (rectángulo azul).

d) Ejemplos de interacciones llamadas por Chicago. Gráficos que muestran todos los recuentos de lectura de bait-other-end (potenciador), dentro de los 500-700 kb (aguas arriba y aguas abajo) de los promotores Grink3 y Wwc2. Las interacciones significativas detectadas por Chicago (puntuación ≥5) se muestran en rojo, y las interacciones por debajo del umbral (3 ≤ puntuación< 5)="" are="" shown="" in="" blue.="" grey="" lines="" show="" expected="" counts="" and="" dashed="" lines="" the="" upper="" bound="" of="" the="" 95="" %="" confidence="" intervals.="" (e)="" overlap="" enrichment="" analysis="" between="" interacting="" enhancers="" and="" dars,="" using="" a="" permutation="" procedure="" on="" 10,000="" randomized="" sets="" of="" accessible="" sites.="" the="" histogram="" presents="" random="" sampling="" distribution="" of="" accessible="" sites="" for="" each="" condition="" (basal="" vs.="" activated="" -="" early,="" activated="" -early="" vs.="" activated="" -late,="" activated="" -late="" vs.="" reactivated,="" stable).="" the="" number="" of="" overlapped="" loci="" is="" presented="" in="" colored="" lines="" from="" basal,="" activated="" -early,="" activated="" -late,="" and="" reactivated="" neurons.="" dars="" of="" bas="" vs.="" activated="" -early="" (z-score;="" 7.1,="" 7.7,="" 8.5,="" 10.9).="" dars="" of="" activated="" -early="" vs.="" activated="" -late="" (z-score;="" −0.1,="" −0.8,="" −2.4,="" −3.2).="" dars="" of="" activated="" -late="" vs.="" reactivated="" (0.4,="" 1.8,="" 0.4,="" −0.2).="" dars="" of="" stable="" (z-score;="" 1.7,="" 2.0,="" 6.5,="">

Extended Data Fig. 4: Los cambios de cromatina que ocurren durante la fase temprana habilitan

a) Análisis de solapamiento entre los nombres de genes del análisis diferencial por pares y los datos publicados anteriormente de i) células gránulos DG activadas 1 h después de una nueva exposición32 ii) 24 h después de FS20 y iii) después de la estimulación prolongada (6 h) de neuronas corticales cultivadas en ratón con KCl33. El análisis se llevó a cabo mediante el paquete GeneOverlap R.

(b) Las lecturas exónicas (rojas) e intrónicas (azules) se cuantificaron por separado en todas las condiciones y se compararon con la actividad transcripcional medida por DEseq2. Las lecturas se normalizaron (RPKM) y los cambios de log2FC se presentan para cada estado. la gráfica del violín indica la media,

rango intercuartílico, y el mínimo y máximo, ANOVA unidireccional (paramétrico, no emparejado), Basal vs. Temprano; F (5, 248) = 389,9. Temprano vs. Tardío; F (5, 2374) = 2183. Tardío vs. Reactivado. F (5, 1357) = 945.5, Todos los Ps< 0.0001.="" bonferroni’s="" multiple="" comparisons.="" n.s="non-significant," ***p=""><>

c) Se midieron las relaciones exón/intrón en cada grupo en todas las condiciones (escala Log2FC). La gráfica del violín indica la media, el rango intercuartílico y el mínimo y el máximo, unidireccional ANOVA (paramétrico, no emparejado), F (5, 1143) = 260.2, P<0.0001. bonferroni’s="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p=""><>

d) Análisis de superposición entre las AD y los DEG durante diferentesmemoriaFases. Los DARs en las regiones intergénicas e intrones se mapearon a sus respectivos genes con los mapas de interacción pc-HiC. El análisis de superposición se llevó a cabo mediante el paquete GeneOverlap R. El valor P (números) y la razón de probabilidades (color) de la prueba exacta de Fisher se presentan en el mapa de calor. n.s – no significativo.

e) Correlación de Pearson entre los valores log2FC de los DEDAR y los DEG log2FC que se anotaron en esa región (las regiones intergénicas se mapearon a través del conjunto de datos pc-HiC). Los cambios de accesibilidad a la cromatina se compararon con las lecturas exónicas analizadas (línea roja), las lecturas intrónicas (líneas azules) y los cambios transcripcionales totales (lecturas intrónicas y exónicas) medidas por Desq2 (línea gris). Todos los valores r y p se indican en el cuadro suplementario 9.

Datos extendidos Fig. 5: Los cambios transcripcionales en las neuronas activadas-tardías se correlacionaron más alto

(a) Las lecturas exónicas (rojas) e intrónicas (azules) se cuantificaron por separado en todas las condiciones para cada uno de los grupos identificados en la Fig. 5B. Las lecturas se normalizaron (RPKM) y se presentan los cambios de log2FC para cada clúster.

b) Se midieron las relaciones exón/intrón en cada grupo en todas las condiciones. La gráfica de violín indica la media, el rango intercuartílico y el mínimo y el máximo, n = 3 muestras biológicamente independientes ANOVA unidireccional (paramétricas, no apareadas), Dw –Cluster tardío; F (3, 968)

652) = 93,97, p<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni’s="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p=""><>

Extendido Datos Higo. 6: Distinto Temporal transcripcional Programas son ser sincronizado Para

una manera dependiente en presencia de tamoxifeno. En el panel derecho, imágenes representativas de IHC de la DG. Verde – AAV-eYFP, Rojo – Arco endógeno. La barra de escala representa 50 μm.

b) Evaluación de la morfología de las espinas durante diferentesmemoriaFases. El panel derecho muestra un solo eje dendrítico eYFP + con diferentes tipos de espinas (Stubby, Thin, Mushroom, Agrandado). La barra de escala representa 5 μm. boxplot indica la media, el rango intercuartílico y el mínimo y máximo, Activado -temprano: n = 4 ratones /5 sección por animal, Activado -tardío: n = 4 ratones /4 sección por animal, Reactivado: n = 4 ratones /2 sección por animal. ANOVA unidireccional (paramétrico, no emparejado), Stubby; F (2, 36) = 2,313, P =0,1135. Delgado; F (2, 36) = 35,12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="">< 0.0001.="" bonferroni’s="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p=""><>

c) Imágenes representativas de la IHC y cuantificación de los niveles de proteínas de dos miembros de la familia del MIM; (izquierda) Eif2a y (derecha) Eif3e. La barra de escala representa 10 μm. Los datos para el eje dendrítico se presentan como una relación entre el número y la longitud (μM). n = 4 ratones /5 sección por animal, boxplot indica la media, el rango intercuartílico y el ANOVA unidireccional mínimo y máximo (paramétrico, no apareado) con la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni, n.s - no significativo, Eje Eif2a; F (2, 20) = 4,484, P=0,0246. Soma; F (2, 21) = 19,58, P< 0.0001.="" (activated="" -early="" vs.="" activated="" -late="" *p="0.0142," activated="" -early="" vs.="" reactivated="" *p="">< 0.0001,="" activated="" -late="" vs.="" reactivated="" *p="0.0303)." eif3e="" shaft;="" f="" (2,="" 14)="1.983," p="0.1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (activated="" -early="" vs.="" reactivated="" *p="0.0057," activated="" -late="" vs.="" reactivated="" *p="">

(d) El gráfico circular presenta el porcentaje de espinas de hongos agrandadas (Dh ≥ 3Dn) y espinas de hongos de neuronas activadas -tardías y reactivadas.

e) Imágenes representativas (panel izquierdo) y cuantificación (panel derecho) de los niveles de ARNm de Gria1, durante las diferentes fases dememoria. Los datos se presentan como una relación entre varios puntos y la longitud del eje dendrítico. La barra de escala representa 10 μm. N = 4 ratones /5 sección por animal, boxplot indica la media, rango intercuartílico y el mínimo y máximo, Eje; ANOVA unidireccional (paramétrico, no emparejado) F (2, 15) = 10,41, P = 0,0015. Prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni, **P = 0.0011. panel inferior - Soma; ANOVA F unidireccional (2, 12) = 0,13, P = 0,88.

Datos extendidos Fig. 7: Las interacciones con distintos potenciadores combinatorios conducen a una dirección

(a) Los diagramas de Venn muestran el porcentaje de superposición entre la accesibilidad a la cromatina (DAR) en todos losmemoriafases (BAS vs. Activado -temprano, círculo de cuadrícula verde claro; Activado -temprano vs. Activado -tarde, círculo de cuadrícula verde oscuro; Activado -tarde vs. Reactivado, círculo de cuadrícula naranja) y cambios transcripcionales totales de todos los grupos identificados (Dw –tarde, Arriba –tarde, Estable, Reactivación, círculo de cuadrícula azul). Los DARs intergénicos e intrones se mapearon a sus respectivos genes con los mapas de interacción pc-HiC. El porcentaje de superposición se calculó a partir de todos los DEG identificados en los grupos (n = 1095).

b) Análisis de superposición entre las AD (por pares) y los DEG de cada grupo. Los DARs intergénicos e intrones se mapearon a sus respectivos genes con los mapas de interacción pc-HiC.

El análisis de superposición se llevó a cabo mediante el paquete GeneOverlap R. Los valores P y los valores de Jaccard (color) de la prueba exacta de Fisher se presentan en el mapa de calor (izquierda). El porcentaje de superposición se calculó a partir de todos los DEG identificados en los grupos (derecha).

c) Imagen representativa de la cromatina y los cambios transcripcionales del locus gabrb3 del grupo Dw-late. Mientras que las interacciones de estado temprano fueron entre promotores y potenciadores con activadores transcripcionales (Ap1), las interacciones de estado tardío fueron con represores transcripcionales (Slug). Las pistas del navegador del genoma IGV superior (púrpura - Basal, verde claro - Activado - temprano, verde oscuro - Activado - tardío y naranja - Reactivado) presentan cambios transcripcionales (ncRNA-seq), las pistas medias muestran la dinámica de accesibilidad de la cromatina (ATAC-seq) en el promotor (rectángulo rojo) y potenciadores (rectángulo gris). Las interacciones significativas promotor-potenciador se representan como arcos (pistas del navegador WashU). La pista inferior presenta motivos que se identificaron a través de herramientas HOMER (Slug, Ap1 y Rest).

d) Parcelas de agregación para motivos individuales. Los valores de enriquecimiento (motivos por bp/ por pico) de seis motivos seleccionados (dos represores, dos activadores y dos bivalentes) se evaluaron alrededor del centro de picos (−/+ 4000bp) de cada grupo.

Datos extendidos Fig. 8: Modelo propuesto de la accesibilidad a la cromatina, la interacción promotor-potenciador y la dinámica transcripcional de las neuronas de engrama de memoria del hipocampo

regiones, que albergan motivos activadores transcripcionales. Esta reprogramación promotor-potenciador da como resultado un aumento de la expresión génica que presumiblemente permite la estabilización de lamemoria. Las neuronas de engrama reactivadas utilizaron un subconjunto de interacciones promotor-potenciador cebadas, que se asocia con cambios transcripcionales involucrados en el transporte de ARNm a los compartimentos sinápticos y la traducción de proteínas. Factor de transcripción – TF, E(1–3) – diferentes potenciadores que interactúan con el mismo promotor, Rojo - represores transcripcionales, Azul - activadores transcripcionales.

Material complementario

Consulte la versión web en PubMed Central para obtener material complementario.

Reconocimientos

Agradecemos a E. Niederst, J. Penney, S. Barker, R.T. Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin y a los miembros de L.H.T. Laboratorio para discusiones y sugerencias útiles. Agradecemos a los gerentes de laboratorio Y. Zhou, E. McNamara por el mantenimiento de la colonia de ratones. Agradecemos a P. Autissier (Whitehead Institute) por su ayuda con FACS. Financiamiento: Estos trabajos fueron apoyados por las subvenciones de los NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, el consorcio CURE Alzheimer's Fund CIRCUITS y The Robert A and Renee E. Belfer Family Foundation to L-H.T. Este trabajo también fue apoyado en parte por las subvenciones de los NIH R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 a M.K. y L-H. T, y R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, R01HG008155, U24HG009446 a M.K. V.D está respaldado por una subvención AARF-19-618751 de la Asociación de Alzheimer. H.S.M cuenta con el apoyo del Burroughs Wellcome Fund y la beca postdoctoral UNCF-Merck. C. A cuenta con el apoyo de la Fundación JPB. R.M.R cuenta con el apoyo de la subvención NIH T32 5T32HD09806. El kit de preparación de bibliotecas Hi-C fue recibido como un generoso regalo de DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, EE. UU.). Agradecemos al equipo de Dovetail por su útil discusión y sugerencias.