Parte 6: Mapeo de la interacción epigenómica y transcriptómica durante la formación y recuperación de la memoria en el conjunto de engramas del hipocampo

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Fig. 1. Identificación temporal y espacial de células de engrama activadas y reactivadas.

(a) Representación esquemática del diseño experimental. Los ratones TRAP se expusieron inicialmente a un entrenamiento en el que se emparejaron estímulos condicionados (contexto) e incondicionados (shock en el pie, FS) dentro de una breve ventana de exposición a 4-hidroxitamoxifeno (TAM). Se clasificaron cuatro poblaciones neuronales diferentes (basal, activada temprana, activada tardía y reactivada) mediante citómetro de flujo y se sometieron a preparación de bibliotecas para nRNA-seq, ATAC-seq, Hi-C y pc-HiC.

(b) Imágenes representativas (DG) y cuantificaciones de todo el hipocampo de eYFP más neuronas después del tratamiento con TAM en una jaula casera (ingenuos, n=4 ratones/6 cortes por animal), 1,5 h (Activado - temprano, n {{4 }} ratones/4 cortes por animal) y 5 días (Activado – tardío, n=4 ratones/8 cortes por animal) después de la exposición después de FS. La barra de escala representa 200 μm. El diagrama de puntos indica la media y las barras de error (SEM), ANOVA unidireccional (paramétrico, no apareado), F (2, 70)=240.3, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test;="" hc="" vs.="" early="" ***p="0.0007," hc="" vs.="" late****p="" <="" 0.0001,="" early="" vs.="" late="" ****p="" <="">

( c ) Cuantificaciones de neuronas activadas, tardías y reactivadas en el hipocampo en dos grupos experimentales; CFC con (CFC más TAM, n {{0}} ratones/8 cortes por animal) o sin (CFC NO-TAM, n=4 ratones/6 cortes por animal) administración de tamoxifeno. El gráfico de puntos indica la media y las barras de error (SEM), la prueba t de Student no pareada bilateral, Activada – tardía; t=25.65, df=47, Reactivado; t=11.00, df=52, ****P <>

( d ) Imágenes representativas y cuantificaciones de diferentes regiones del hipocampo. El número de núcleos positivos se analizó utilizando IMARIS (ver métodos) de la DG, CA1 y CA3. La barra de escala representa 100 μm. n=5 ratones/ Activado –temprano: 6 cortes por animal, n=6 ratones/ Activado –tardío: 6 Reactivado: 6 cortes por animal. El gráfico de puntos indica la media y las barras de error (SEM), ANOVA unidireccional (paramétrico, no apareado), Early; F (2, 42)=13.46. Tarde; F (2, 95)=556.3. Reactivado; F (2, 89)=83.53. Todos los Ps < 0,0001.="" prueba="" de="" comparaciones="" múltiples="" de="" bonferroni,="" *p="0.029," **p="0.0075," ***p="0.0009,">< 0.0001.="" (e)="" valuation="" of="" context="" effects="" on="" the="" number="" and="" the="" distribution="" of="" hippocampal="">memoriarastros

(f) Cuantificaciones de neuronas activadas tardías y reactivadas en el grupo AB (n=6 ratones/ 6 cortes por animal), en comparación con el grupo AA (n=5 ratones/ 6 cortes por animal). El gráfico de puntos indica la media y las barras de error (SEM), la prueba t de Student no pareada bilateral, Activado – tardío; t=0.08292, df=59, P=0.9342. Reactivado; t=8.385, df=57, ****P< 0.0001.n.s="">

Fig. 2. Paisaje de accesibilidad de la cromatina durante la formación y recuperación de la memoria.

(a) Las regiones accesibles diferenciales (DAR) se muestran en un diagrama de volcán (comparaciones por pares, FDR <0.01; cambios="" de="" pliegue=""> 1.5), n=3 muestras biológicamente independientes. (b) Análisis de la región común ganada-accesible (estable), adquirida 90 min después del FS (Activado - temprano), que permanece accesible en el estado tardío de consolidación (Activado - tardío) y recuerdo (Reactivado). Los DAR estables superpuestos solo se consideraron si aparecían en al menos 2 réplicas biológicas en una condición determinada.

( c ) Pistas representativas del navegador del genoma IGV del locus Arc.

(d) Análisis de anotaciones (herramientas HOMER) para todos los DAR. Los números en el eje Y indican los valores de la relación Log2 de los loci observados (número de DAR) sobre el esperado (tamaño total (pb)) de TTS, exones, intrones, intergénicos y promotores. El valor P fue calculado por HOMER

instrumentos; Basal vs. Activado -temprano (Intergénico *P=1.73 × 10−103), Activado -temprano vs. Activado -tardío (TTS *P=0.0339, Promotor *P {{9} }.48 × 10−39), Activado -tardío vs. Reactivado (Promotor *P=2.48 × 10−6), estable (Intergénico *P=0.0358).

(e) Estados de emisión de modificación de histonas (izquierda) y ofertas de análisis de enriquecimiento sobre emisiones utilizando ChromHMM. Doblar la escala de enriquecimiento (FE) {{0}}–30. El valor p y se determinó mediante el valor de la puntuación z (tal como se calcula en la Fig. 2c de datos ampliados). El análisis completo se informa en la tabla complementaria 3. *P < 0,00001,="" informado="" solo="" para="" valores="" enriquecidos="" (no="">

(f) Chip-qPCR. Las muestras se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra H3K27ac o H3K4me1 y se sometieron a PCR en tiempo real con dos conjuntos de cebadores para los potenciadores putativos identificados. H3K27ac: n=4, H3K4me1 n=3, el diagrama de puntos indica la media y las barras de error (SEM), ANOVA unidireccional (paramétrico, no apareado) con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, Enhancer 1; H3K27ac - F (3, 12)=4.664, P=0.02, (Basal versus Activado-tardío *P=0.0246, Basal versus Reactivado * P=0.0232), H3K4me1 - F (3, 8)=0.845, P=0.506. potenciador 2; H3K27ac - F (3, 12)=5.221, P=0.0155, (basal frente a activado tardío **P=0.0059), H3K4me1 - F (3, 8)=1.719, P=0.24. potenciador 3; H3K27ac - F (3, 12)=29.91, P < 0.0001,="" h3k4me1="" -="" f="" (3,="" 8)="10.39," p="0.0039," (="" basal="" vs.="" activado="" -="" temprano="" *p="0.0298," basal="" vs.="" activado="" -tardío="" **p="0.0021," basal="" vs.="" reactivado="" **p="0.0063)." potenciador="" 4;="" h3k27ac="" -="" f="" (3,="" 12)="6.273," p="0.0083," (basal="" vs.="" activado="" -tardío="" **p="0.007," basal="" vs.="" reactivado="" *p="" {="" {102}}.0152),="" h3k4me1="" -="" f="" (3,="" 8)="9.901," p="0.0045," (basal="" vs.="" reactivado="" **p="0">

Fig. 3. Conmutación de subcompartimentos en las diferentes fases dememoriaformación y recuerdo.

( a ) El mapa de calor de correlación Hi-C representa la compartimentación de chr6 para células basales, activadas - tempranas y activadas - tardías. Compartimentos calculados por Juicer a una resolución de 500 kb (observado-esperado normalizado).

Activado -tarde). El cambio de compartimento solo se consideró si un valor negativo se transformaba en un valor positivo y viceversa.

(c) Imágenes representativas del navegador IGV que muestran un cambio de compartimento estable de A a B (panel superior) y de B a A (panel inferior) en diferentesmemoriaetapas.

( d ) Análisis de superposición entre DAR en la fase temprana (Basal vs. Activado - temprano) y compartimento conmutado estable. El diagrama de Venn izquierdo muestra los DAR ganados y el compartimiento estable cambiado de B a A. El diagrama de Venn a la derecha muestra los DAR perdidos y el compartimiento estable cambiado de A a B.

( e ) Ilustración del cambio de compartimento inducido por la actividad y las interacciones promotoras-potenciadoras específicas.

Fig. 4. Los promotores interactúan más frecuentemente con un subconjunto distinto de potenciadores durante cada

(a) El mapa de calor representa la puntuación de interacción definida por Chicago, para cada población. Basal: n=3, Activado -temprano, Activado -tardío y Reactivado: n=4 muestras biológicamente independientes.

(b) Los diagramas de violín muestran la distribución y la intensidad (escala log10) de interacción que fueron únicas o compartidas por al menos 3 poblaciones (común). ANOVA unidireccional (paramétrico, no apareado), F (4, 57922)=2364, P < 0,0001.="" prueba="" de="" comparaciones="" múltiples="" de="" bonferroni,="" ns="no" significativo="" (p="0.7659)," *p=""><>

( c ) Frecuencia de la interacción promotor-potenciador medida por 3C-qPCR para loci seleccionados. Cuatro conjuntos de cebadores que abarcan la interacción entre promotor-potenciador (P/E) y tres loci aleatorios dentro del bucle (P/Ein), fuera del bucle (P/Eout) y en el promotor (P/Pin).

Las lecturas se normalizaron a los valores de interacción promotor-potenciador del gen de limpieza actina. n=3 muestras biológicamente independientes. Los datos se presentan como valores medios con barras de error que indican el SEM, ANOVA de dos vías. Eif3d; población × ubicación de interacción (F

(9, 32)=1.917, P=0.0851), efecto de la ubicación de interacción únicamente (F (3, 32)=22.64, P < 0,0001).="" grik3;="" población="" ×="" ubicación="" de="" interacción="" f="" (9,="" 32)="0.1716." test="" de="" comparaciones="" múltiples="" de="" bonferroni,="" p/e="" basal="" vs.="" reactivado="" **p="">

( d ) Eventos de cebado representativos del locus Eif5a. Pistas del navegador IGV Genome que presentan la dinámica de accesibilidad de la cromatina (pistas de colores) en el promotor (rectángulo gris) y los potenciadores (rectángulo azul). Las pistas del navegador WashU presentan una interacción significativa entre el promotor y el potenciador a través de arcos (púrpura - Basal, verde claro - Activado - temprano, verde oscuro - Activado - tardío y naranja - Reactivado).

Fig. 5. Firma transcripcional de neuronas de engrama reactivadas

(a) El análisis por pares de DEG de los ratones trampa del hipocampo que fueron expuestos a CFC se muestra en un gráfico de volcán (FDR<0.01; log2fc="" >="" 2).="" n="3" biologically="" independent="">

no apareados), seguida de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Dw–Late; F (3, 1032)=42.19, Up-Late; F (3, 280)=752.5, Estable; F (3, 764)=92.28, Reactivación; F (3, 1744) =597.4. Todos los Ps < 0,0001.="" prueba="" de="" comparaciones="" múltiples,="" ns="no" significativo,="" ***p="">< 0,0001.="" (="" d="" )="" análisis="" de="" ontología="" génica="" (go)="" (toppfun)="" para="" deg="" que="" se="" identificaron="" en="" cada="" grupo.="" (e)="" deg="" representativos="" de="" cada="" grupo.="" log2fc="" del="" estado="" basal="" se="" presenta="" en="" tres="" réplicas="" biológicas.="" la="" línea="" representa="" el="" promedio="" calculado.="" n="3" muestras="" biológicamente="" independientes,="" anova="" unidireccional="" (paramétrico,="" no="" apareado)="" con="" la="" prueba="" de="" comparaciones="" múltiples="" de="" dunnett,="" ns="no" significativo.="" gad1;="" f="" (3,="" 8)="4.387," p="0.04." *p="0.0268." gabrb3;="" f="" (3,="" 8)="6.184," p="0.0177." *p="0.0441." descansar;="" f="" (3,="" 8)="23.23," p="0.0003." ***p="0.0268." mapa4k4;="" f="" (3,="" 8)="6.244," p="0.0172." *p="0.0151." nefl;f="" (3,="" 8)="12.06," p="0.0024." **p="0.0059," **p="0.0014." nefh;="" f="" (3,="" 8)="21.50," p="0.0003." *p="0.016," ***p="0.0008," ***p="0.0002." eif5a;="" f="" (3,="" 8)="8.482," p="0.0072." **p="0.004." eif4h;="" f="" (3,="" 8)="26.58," p="0.0002." ***p="">

Cistanche puede mejorar la memoria

( f ) Imágenes representativas y cuantificación de los niveles de proteína Eif4e de Activado - temprano, Activado - tardío y Reactivado. Para la cuantificación, se construyeron dos superficies separadas en IMARIS; soma celular y eje dendrítico. El número de Eif4e puncta se midió solo en los límites de esas superficies. Los datos para el eje dendrítico se presentan como una relación entre el número y la longitud (μM). La barra de escala representa 10 μm. n=4 ratones/5 secciones por animal, el gráfico de caja indica la media, el rango intercuartílico y el ANOVA unidireccional mínimo y máximo (paramétrico, no apareado), eje; F (2, 28)=5.113, P=0.0128. soma; F (2, 43)=3.026, P=0.0589. prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni; Eje; Activado -temprano vs. Reactivado *P=0.0324, Activado -tarde vs. Reactivado *P=0.0324

( g ) Imágenes representativas (panel izquierdo) y cuantificación (panel derecho) de los niveles de proteína Gria1, durante diferentes fases dememoria. Se analizaron tres poblaciones de neuronas (Activadas -tempranas, Activadas -tardías y Reactivadas), en función de la inmunorreactividad de eYFP y Arc endógeno. Para la cuantificación, se construyeron superficies MARIS sobre el eje dendrítico y se midió el número de puntos GRIA1 solo en los límites de la superficie (<1μm threshold).="" data="" is="" presented="" as="" a="" ratio="" between="" several="" puncta="" and="" the="" shaft="" length.="" the="" scale="" bar="" represents="" 10="" μm.="" n="4" mice="" section="" per="" animal,="" boxplot="" indicates="" the="" mean,="" interquartile="" range,="" and="" the="" minimum="" and="" maximum,="" one-way="" anova,="" f="" (2,="" 16)="15.22," p="0.0002." bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" **p="0.002," ***p="">

Fig. 6. Reprogramación secuencial de la accesibilidad de la cromatina, interacciones promotor-potenciador y

Los gráficos de líneas para cada grupo de K-medias muestran el promedio (escala log2) de (a) cambios transcripcionales (valores p como se informa en la Fig. 5c, media de n=3 muestras biológicamente independientes) (b) accesibilidad de la cromatina ( valores normalizados de RPKM, media de n=3 muestras biológicamente independientes) y (c) puntuaciones de interacción promotor-potenciador (calculadas por Chicago, media basal: n=3, Activado -temprano, Activado -tardío y Reactivado : n=4 muestras biológicamente independientes) Medidas repetidas ANOVA unidireccional (entre grupos).

638.7. Estable; F (2.437, 4504)=717.9. Reactivación; F (2.434, 8481) {{10}}. Todos los Ps < 0.0001.="" puntuaciones="" de="" interacción;="" dw-late;="" f="" (2.833,="" 7054)="46.86." hasta="" tarde;="" f="" (2.94,="" 5442)="14.87." estable;="" f="" (2.91,="" 5702)="21.5." reactivación;="" f="" (2.86,="" 11188)="44.94." todos="" los="" ps="">< 0,0001.="" prueba="" de="" comparaciones="" múltiples="" de="" bonferroni,="" ***p=""><>

( de ) Caracterización del enriquecimiento de motivos en potenciadores que interactúan, en cada grupo. ChromHMM se utilizó para construir los estados de emisión utilizando la base de datos de motivos HOEMR (Egr1, Ap1, Slug, Plagl1, Hic2, Rest, CTCF, Yy1, Mecp2) y datos de ChIP-seq publicados anteriormente (Ap1-Junb12, CTCF47, Mecp248). Se identificaron cuatro estados como i) control: muestreo aleatorio del genoma, ii) represores fuertes iii) bivalente iv) activador fuerte. Escala de enriquecimiento de pliegues (FE)

0.15–20.