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I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* y Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1Instituto de Posgrado en Medicina Regenerativa Neural, Facultad de Ciencias y Tecnología Médicas, Universidad Médica de Taipei, Taipei 11031, Taiwán

2Instituto de Biología Molecular, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwán

3Instituto de Medicina Clínica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwán

4Centro de Investigación de Medicina Clínica, Hospital Universitario Nacional Cheng Kung, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwán

5Departamento e Instituto de Posgrado de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Taoyuan 33302, Taiwán

6Centro de Investigación de Neurociencia, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Linkou 33302, Taiwán

7Contacto principal

*Correspondencia: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche puede mejorar la memoria

RESUMEN

La variación fenotípica es un prerrequisito fundamental para la evolución de células y organismos por selección natural. Mientras que el papel de la expresión génica estocástica en la diversidad fenotípica de células genéticamente idénticas está bien estudiado, no se sabe mucho sobre la relación entre la expresión génica estocástica y la variación del comportamiento individual en animales. Demostramos que un miARN específico (miR-466f-3p) está regulado positivamente en el hipocampo de una porción de ratones endogámicos individuales en una tarea de laberinto de agua de Morris. Significativamente, miR- 466f-3p regula positivamente la morfología, la función y el aprendizaje espacial de las neuronas, ymemoriacapacidad de los ratones. De forma mecánica, miR-466f-3p reprime la traducción de MEF2A, un regulador negativo del aprendizaje/memoria. Finalmente, mostramos que la regulación ascendente variada de miR-466f-3p del hipocampo resulta de la fosforilación aleatoria de la unión del elemento de respuesta al AMP cíclico del hipocampo (AMPc) (CREB) en individuos. Este hallazgo de modulación del aprendizaje espacial ymemoriaa través de un eje de señalización del hipocampo aleatorio tras la estimulación neuronal representa una demostración de cómo la variación en la expresión génica del tejido conduce a un comportamiento animal variado.

INTRODUCCIÓN

La variación fenotípica entre individuos otorga una ventaja evolutiva ya que proporciona la diversidad poblacional sobre la que actúa la selección natural (Pavlicev et al., 2011). Los antecedentes genéticos y los factores ambientales contribuyen a generar dicha variación natural (Bendesky y Bargmann, 2011). Experimentalmente, los ratones endogámicos a menudo se han utilizado para estudiar las bases moleculares y celulares de los fenotipos y comportamientos promedio para minimizar los efectos de las diferencias genéticas entre los individuos evaluados (Casellas, 2011). Sin embargo, se ha demostrado la variación de la abundancia de transcritos de tejido entre ratones isogénicos individuales. Los genes que exhiben niveles de expresión altamente variables a menudo se asocian con la función inmunológica, las respuestas al estrés y la regulación hormonal, es decir, procesos sensibles a señales ambientales (Vedell et al., 2011). Algunos de estos estudios también han demostrado que las diferencias en la expresión génica o la señalización celular, con o sin la influencia de factores ambientales como el lamido materno, el suministro de nutrientes en el útero o la resiliencia frente a la susceptibilidad inducida por el estrés (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), puede dar lugar a diferencias en fenotipos y comportamientos (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

aprendizaje espacial ymemoriaLa formación controlada por el cerebro se puede separar en dos sistemas: (1) navegación egocéntrica que emplea automovimiento y señales internas y (2) navegación alocéntrica que involucra principalmente el hipocampo y las estructuras cerebrales cercanas que es estimulada por señales distales fuera de los organismos (Ekstrom). et al., 2014). La capacidad de aprendizaje espacial ymemoriapermite que la mayoría de las especies animales ajusten progresivamente sus comportamientos para adaptarse a entornos espacial y temporalmente variables, lo cual es fundamental para su supervivencia. Esto se puede evaluar en animales de laboratorio mediante la aplicación de paradigmas de comportamiento como el laberinto acuático de Morris (MWM) (Vorhees y Williams, 2014). En particular, se ha demostrado que los roedores endogámicos genéticamente idénticos exhiben una variación fenotípica en el aprendizaje espacial ymemoria(Tsai et al., 2002), pero los mecanismos subyacentes de esta variación de comportamiento seguían siendo desconocidos.

La formación de nuevos recuerdos es un proceso complejo que requiere transcripción de genes dependiente de la actividad, síntesis de nuevas proteínas y

Figura 1. Correlación entre la variación del aprendizaje espacial ymemoriacapacidad e inducción miR-466f-3p

(A) Tarea MWM de ratones C57BL/6J consanguíneos de tipo salvaje. Panel izquierdo: rendimientos de MWM de ratones GLN (puntos) y ratones PLN (cuadrados). De un total de 289 ratones probados, 180 se clasificaron como GLN y 109 como PLN. Panel derecho: prueba de prueba de la tarea MWM (n=47y 30 en cada grupo). Las medias y las duraciones gastadas en cada uno de los cuatro cuadrantes y la región de la plataforma se comparan en el histograma. P, lugar de la plataforma que falta; T, zona objetivo sin P; R, zona derecha; O, zona opuesta; L, zona izquierda. (B) Análisis RT-qPCR de la expresión de miARN. Los niveles de expresión relativos de seis miARN ubicados dentro del grupo miR-466-669 y miR-132-3p, como un control positivo enriquecido en el cerebro, se analizaron y normalizaron con el control interno U6 snRNA de hipocampo de ratón GLN y PLN (n=9–18 por grupo). yo, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3p.

redes neuronales específicas finamente ajustadas comomemoriaengramas para hacer nuevas conexiones neuronales y plasticidad sostenida (Asok et al., 2019). Los engramas del hipocampo, que son poblaciones escasas de neuronas en la circunvolución dentada (DG), representan conjuntos de neuronas que muestran una mayor actividad despuésmemoriaformación. Si bien las neuronas del engrama DG exhiben un patrón muy distinto de expresión génica (Rao-Ruiz et al., 2019), los mecanismos moleculares específicos del engrama subyacentesmemoriaconsolidación siguen siendo en gran parte desconocidos. Se sabe que varios factores y vías de señalización regulan positiva o negativamente el aprendizaje ymemoriase han identificado procesos (Abraham et al., 2019; Humeau y Choquet, 2019). Entre ellos, la forma activada de la proteína de unión al elemento de respuesta (CREB) de AMP cíclico (cAMP) estimula la transcripción de genes en respuesta a los aumentos dependientes de la actividad de Ca2 plus intracelular en las neuronas (Kandel, 2012). Por otro lado, la vía camp/PKA reprime la actividad transcripcional del factor 2 potenciador de miocito (MEF2) al evitar la exportación nuclear de su correpresor, HDAC5, y la importación nuclear del coactivador NFAT (Belfield et al., 2006). Además, a diferencia de CREB, la actividad de MEF2A restringememoriaformación (Cole et al., 2012). Además de los factores proteicos, los microARN (miARN) también participan en la regulación de las funciones neuronales, incluido el aprendizaje y la memoria (McNeill y Van Vactor, 2012). Los miARN son ARN no codificantes pequeños (22 nt) que actúan principalmente como reguladores postranscripcionales de la expresión génica a través del emparejamiento de bases específico de secuencia con sus sitios de reconocimiento en las 30 regiones no traducidas (30 UTR) de ARNm específicos (Daugaard y Hansen, 2017). Los miARN participan en una variedad de vías de señalización en las neuronas posmitóticas y median en los procesos celulares dependientes de la actividad, incluido el crecimiento y la ramificación dendríticas, la formación de sinapsis y la maduración. Al regular la expresión génica, también juegan un papel importante en las formas duraderas de plasticidad sináptica que subyacenmemoriaformación, recuperación y consolidación (Chen y Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

A continuación, presentamos evidencia de un vínculo causal entre la expresión génica del tejido estocástico y la variación del comportamiento individual en animales. En particular, mostramos que la activación estocástica de un eje hipocampal CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A modula la variación individual del aprendizaje espacial ymemoriacapacidad en ratones consanguíneos.

RESULTADOS

Variación individual del aprendizaje espacial ymemoriala capacidad se correlaciona con la inducción de miR-466f-3p de un grupo de miARN específico

Identificar miRNAs involucrados en la regulación del aprendizaje ymemoriaformación, utilizamos la tarea MWM para distinguir ratones C57BL/6J de tipo salvaje endogámicos con buena o mala capacidad de aprendizaje y memoria (Figura 1A). Definimos a los ratones que completaron la tarea en 30 s en la última (6.ª) sesión como "buenos aprendices" (GLN), mientras que los ratones que no pudieron encontrar la plataforma en 30 s en la última sesión se consideraron "pobres aprendices". ' (PLN). Como se muestra en la Figura 1A (panel izquierdo), el 62 por ciento de los ratones pertenecían al grupo GLN (180 de 289 ratones), mostrando una marcada reducción en la latencia de escape de 98,1 s (primera sesión) a 21,8 s (sexta sesión). Por el contrario, la latencia de escape del 38 por ciento restante de los ratones, el grupo PLN (109 de 289 ratones), solo se redujo moderadamente entre la primera y la sexta sesión (de 111,8 s en la primera sesión a 82,1 s en la sexta sesión). . La prueba de la sonda, que indica que los ratones habían aprendido la tarea durante las seis sesiones, también mostró que los ratones GLN permanecieron más tiempo en la región de la plataforma que los ratones PLN (Figura 1A, par de barras de la izquierda en el panel derecho).

A continuación, analizamos los ARN del hipocampo de ratones GLN y PLN mediante hibridación de micromatrices de miARN (n=4 cada grupo). En general, observamos diferencias relativamente menores en los perfiles de expresión de los miARN del hipocampo de ratones GLN y PLN. Sin embargo, observamos que los 10 miARN principales para los que los niveles de expresión eran más altos en ratones GLN que en ratones PLN (datos no mostrados) se derivaron todos del mismo grupo de miARN específico de roedores, miR-466-669, ubicado en el intrón 10 de el gen mSfmbt2 (ver más abajo). Con base en el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) de los niveles de expresión de los miARN seleccionados en el grupo, elegimos miR-466f-3p para una mayor investigación (Figura 1B). La expresión promedio de este miARN fue 1.5- veces mayor en el hipocampo de los ratones GLN en relación con los ratones PLN. En particular, los niveles promedio de miR-466f-3p del hipocampo fueron similares entre el grupo PLN, el grupo de control de jaula casera (HC) y el grupo de control de natación (Figura 1C), excluyendo así los efectos relacionados con el ejercicio durante nadar y apoyar aún más la idea de que miR-466f-3p fue inducido durante el aprendizaje espacial ymemoriaformación.

En la Figura 1C, los datos revelan que los niveles de expresión de miR-466f-3p del hipocampo de más del 42 % de los ratones GLN fueron al menos 1.5-veces más altos que el nivel de expresión promedio de ratones de control HC, mientras que los niveles en el 15 por ciento de los ratones PLN eran la mitad de los de los ratones HC. Aproximadamente el 25 % de los ratones GLN y el 55 % de los ratones PLN tenían niveles similares de miR-466f{{10}}p (0,8- a 1,2- pliegue relativo a HC). En la Figura 1D se presenta el diagrama de dispersión de correlación de Pearson que muestra una correlación positiva entre los niveles de miR-466f-3p y el porcentaje de duración en la plataforma durante la prueba de la sonda. También realizamos hibridación in situ (ISH) de ARN nuclear pequeño (ARNsn) miR-466f-3p y U6 de los cortes de cerebro en ratones GLN y PLN (Figura 1E). El análisis estadístico de las señales miR- 466f-3p a través de ISH confirmó que la inducción de miR-466f- 3p fue de hecho mayor en el DG de ratones GLN en relación con el de

ratones PLN, mientras que no se encontraron diferencias cuando se compararon las señales de snRNA U6 (histograma derecho, Figura 1E). Aunque las señales de miR-466-3p no eran iguales entre las células granulares individuales en DG, aun así aumentaron significativa y ubicuamente en el hipocampo de ratones GLN en comparación con ratones PLN. Por lo tanto, la inducción de miR-466f-3p no ocurrió solo en una pequeña porción de células, por ejemplo, las neuronas del engrama. Estos datos indican que la regulación positiva de miR-466f-3p durante la tarea MWM está estrechamente asociada con un mejor aprendizaje espacial ymemoriacapacidad entre una proporción significativa de ratones GLN.

También analizamos los niveles de expresión promedio de varios miARN específicos del cerebro mediante RT-qPCR. Entre ellos, miR-132-3p se reguló positivamente en el hipocampo de ratón después de la tarea MWM, pero no observamos diferencias significativas entre los grupos GLN y PLN (par de barras VII, Figura 1B). Los niveles de expresión de miR-335-5p y miR-22 fueron similares entre los grupos GLN, PLN y HC (Figura S1A). Por lo tanto, a diferencia de miR-466f-3p, la expresión hipocampal de estos miARN durante el entrenamiento MWM no se correlaciona con el aprendizaje espacial ymemoriahabilidad de los ratones.

La regulación positiva de miR-466f-3p promueve el crecimiento de neuritas y la formación de espinas dendríticas

Para confirmar que miR-466f-3p se expresó en las neuronas, realizamos miRNA ISH combinado con tinción de inmunofluorescencia (IF) de NeuN y MAP2 en neuronas primarias del hipocampo. Los resultados mostraron que, al igual que otros miARN (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p se expresaba principalmente en la región del soma neuronal, con algunas señales adicionales en las dendritas (Figura S2A). Comprender las bases moleculares y celulares de la asociación de miR-466f-3p regulado al alza con el aprendizaje ymemoriaformación, primero sobreexpresamos transitoriamente miR-466f-3p junto con un polipéptido de fusión dsRed bajo el control del promotor de ubiquitina de pFUGW- miR-466f-3p- Plásmido dsRed en neuronas hipocampales primarias DIV10 (Figura S2B). A través de miRNA ISH, confirmamos que la señal de miR-466f-3p es más fuerte en el grupo de sobreexpresión de miR-466f-3p en relación con el control del vector o miR mutante{{ 12}}f-3p grupo (flechas, Figura S2B). Paralelamente, también establecimos una plataforma para examinar el efecto de la pérdida de función de miR-466f-3p mediante la inhibición de miR-466f-3p usando una esponja miR ubicada en la 30 UTR del ARNm de EGFP expresado a partir del plásmido pFUGW-miR-sponge-EGFP (Figura S2C). El reportero EGFP en el plásmido esponja sirvió tanto como indicador de la eficiencia de la transfección como sensor de la actividad del miARN celular (Kluiver et al., 2012). En una parte significativa de las células HEK293T transfectadas, la señal de EGFP disminuyó tras la coexpresión con miR-466f-3p de tipo salvaje, pero no con miR-466f{{32 mutante }}p, debido a la inhibición de la traducción del ARNm de EGFP mediante la unión de miR-466f-3p a miR- esponja en la 30 UTR (compare las cuatro imágenes de la izquierda y dos his- programa, Figura S2C) . Por el contrario, no observamos una disminución de la señal de EGFP tras la coexpresión de la esponja de control que codifica ocho copias de una secuencia codificada del plásmido pFUGW-SCR-esponja-EGFP con miR-466f-3p o su mutante (compare las cuatro imágenes de la derecha y los dos histogramas).

Como se muestra en la Figura 2A, la expresión ectópica de miR-466f-3p volvió a dar lugar a cambios morfológicos de las neuronas, más notablemente a un mayor crecimiento de neuritas en relación con las neuronas de control transfectadas con el vector pFUGW- que expresa dsRed. dsRed o mutante miR-466f-3plásmido que expresa pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Los datos de cuantificación mostraron que el número promedio de ramas dendríticas por neurona no fue significativamente diferente entre el grupo que sobreexpresa miR-466f-3p (barra II) y el vector o el control mutante (barras I y III) (derecha). histograma superior, Figura 2A). Sin embargo, la longitud media total de las dendritas y la longitud media de las dendritas primarias aumentaron con la sobreexpresión de miR-466f-3p (compare la barra II con las barras I y III, histograma inferior derecho de la Figura 2A). Paralelamente, inhibimos miR-466f-3p endógeno usando miR-sponge. Como se ve, no hubo una diferencia significativa en el número de ramas dendríticas entre los grupos de control e inhibición de miR-466f-3p (compare la barra IV con las barras I y V, histograma superior derecho, Figura 2A) , pero el grupo de inhibición de miR-466f-3p mostró una reducción notable en la longitud media total de las dendritas, así como en las longitudes medias de las dendritas primarias y secundarias en relación con otros grupos (compare la barra IV con las barras I y V, histograma inferior derecho de la Figura 2A). Además, la tinción IF demostró que la sobreexpresión de miR- 466f-3p, pero no la inhibición, también aumentó la densidad de las espinas dendríticas (Figura 2B, paneles superiores e histograma inferior izquierdo). También realizamos una tinción conjunta para la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y contamos la densidad de las espinas dendríticas colocalizadas para establecer el número exacto de sinapsis excitatorias (Figura 2B, histograma inferior derecho), lo que reveló que miR{{40 }}f-3p sobreexpresión aumentó la densidad de PSD-95-espinas positivas en comparación con otros grupos de control. Sin embargo, la inhibición de miR-466f-3p no alteró significativamente la densidad de espinas positivas para PSD-95-con respecto a la de los grupos de control (Figura 2B, histograma inferior derecho). Juntos, estos datos indican que, en ausencia de estimulación neuronal, la inhibición de miR-466f-3p por sí sola no afecta las densidades de las sinapsis excitatorias o las espinas dendríticas totales.