PARTE Ⅰ: La lesión renal aguda en casos graves de COVID-19 tiene similitudes con la lesión renal asociada a sepsis

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PARTE Ⅰ:La lesión renal aguda en casos graves de COVID-19 tiene similitudes con la lesión renal asociada a la sepsis: un estudio multiómico

Mariam P. Alejandro, MD; Kiran K. Mangalaparthi, doctorado y et al.

INTRODUCCIÓN

La infección por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19. 19).y está asociado conLesión renal aguda(AKI) en más de un tercio de los pacientes hospitalizados. El IRA (Lesión renal aguda) suele ser de moderada a grave y es un factor de riesgo independiente de mortalidad hospitalaria. La lesión tubular aguda se considera el sello patológico deCOVID-19enfermedad renal como se muestra en los estudios renales nativos y de autopsia. Los microtrombos, descritos en el corazón y los pulmones, se informan con poca frecuencia en los riñones. De manera similar, aunque es graveCOVID-19está asociado con una respuesta inflamatoria sistémica e inflamación tanto en los pulmones como en el corazón, se sabe poco sobre la respuesta inmunitaria en los riñones.

Toxicidad viral directa, inestabilidad hemodinámica, tormenta de citoquinas. y la lesión inmunomediada se han propuesto como causas probables de lesión renal enCOVID-19.5,13,14 Estudios recientes han señalado similitudes entre la LRA asociada a sepsis (Lesión renal aguda) (S-IRA (Lesión renal asociada a sepsis)) yCOVID-19renal asociada.,e Hasta la fecha, los informes que evalúan la patología renal enCOVID-19se han centrado en gran medida en microscopía de luz y estudios ultraestructurales; los estudios moleculares han sido limitados.

Aquí presentamos una serie deCOVID-19pacientes que se sometieron a un examen post mortem con énfasis en los hallazgos de patología renal. Nuestro estudio buscó describir el espectro patológico deCOVID-19-injuria renal asociada y caracterizar el perfil molecular deCOVID-19LRA asociada (Lesión renal aguda)en comparación con S-AKI ((Lesión renal asociada a sepsis))LRA no relacionada con sepsis (Lesión renal aguda)(NS. AKI (Lesión renal aguda)para dilucidar similitudes y diferencias en la fisiopatología subyacente.

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PACIENTES Y MÉTODOS

Datos clinicos

Todos los casos deCOVID-19(según lo confirmado por la reacción en cadena de la polimerasa nasofaríngea u orofaríngea antemortem SARS.CoV-2) sometidos a un examen post mortem autorizado por la investigación en Mayo Clinic (Rochester, MN) entre el 2 de abril y el 9 de septiembre de 2020, se incluyeron en el estudio. La información más destacada para todos los casos se extrajo de la microdisección realizada después de la captura con láser del compartimento tubulointersticial que exuda cualquier glomérulo o regiones de fibrosis intersticial o atrofia tubular. La apoptosis en cada grupo se evaluó mediante desoxinucleotidil transferasa terminal del ensayo de marcaje de extremos de muesca de dUTP.

Análisis estadístico

El análisis de la expresión génica posterior a la normalización se realizó con R versión 3.6.3 (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria), los conjuntos de genes de anotación funcional se derivaron utilizando anotaciones basadas en la literatura proporcionadas por NanoString.78 La expresión del conjunto de genes de anotación funcional se determinó utilizando las puntuaciones z de los recuentos z normales medios de los genes constituyentes. Las puntuaciones de Gesetz se compararon entre grupos de muestra mediante la prueba t de Student. Los genes individuales superiores relativamente regulados al alza y a la baja dentro de cada grupo de muestra (frente a todos los demás grupos de muestra) se determinaron utilizando el cambio de pliegue y la prueba t de Student. En el caso de los datos proteómicos cuantitativos, las intensidades de los canales de etiquetas de masa en tándem de las proteínas identificadas se utilizaron para el análisis estadístico mediante Python 3.6.5. Las intensidades de los canales fueron logarítmicas, transformadas y medianas normalizadas antes de aplicar la prueba t de Student independiente. Los valores de p se corrigieron para pruebas de hipótesis múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg. Proteínas expresadas diferencialmente (p<.05) were="" analyzed="" using="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" software(ipa,="" qiagen="" redwood="" city,="" ca,="" usa)to="" identify="" altered="" signaling="" pathways.="" the="" significance="" values="" (p-value="" of="" overlap)for="" the="" canonical="" pathways="" were="" calculated="" by="" the="" right-tailed="" fisher="" exact="" test.="" we="" used="" a="" nonparametric="" rank-sum="" test="" to="" compare="" the="" groups="" because="" of="" the="" small="" number="" of="" cases="" per="" group.="" all="" statistical="" analyses="" were="" perfomed="" using="" imp="" (sas="" institute.="" cary.="" nc:="" version="" 14.1).="" p="" values="" less="" than="" .05="" were="" considered="" to="" be="" statistically="">

RESULTADOS

Características Clínicas

La demografía de los 17COVD-19los casos de autopsia se proporcionan en la Tabla 1. La cohorte tenía una mediana de edad de 78 años (rango, 29 a 94 años), y 14 (82,4 por ciento) tenían más de 70 años. Había 15 hombres. y todos se autoidentificaron como blancos (64.7 por ciento). Tres (17,6 por ciento) pacientes adicionales se autoidentificaron como asiáticos, ninguno como negro. El tiempo de permanencia en el hospital varió ampliamente, con 12 (70,6 por ciento) habiendo estado hospitalizados durante 5 o más días antes de la muerte. Las comorbilidades frecuentes y notables incluyeron hipertensión en 9 (52,9 por ciento), diabetes mellitus en 4 (23,5 por ciento), enfermedades cardiovasculares (como la enfermedad de las arterias coronarias) o accidente cerebrovascular en 12 (70,6 por ciento), y enfermedad renal crónica en 1 (5,9 por ciento). ). Solo 1 de 17 pacientes (5,9 por ciento) no tenía antecedentes de hipertensión, diabetes mellitus, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad renal crónica u obesidad. Siete (41,1 por ciento) estaban ventilados mecánicamente al momento de la muerte.

Los 17 pacientes que murieron conCOVID-19LRA desarrollada (Lesión renal aguda). Entre los pacientes con LRA (Lesión renal aguda)que tenían un nivel de creatinina sérica terminal dentro de las 24 horas posteriores a la muerte, ocho tenían AKI (Lesión renal aguda) etapa 1 (47.1 por ciento), dos tenían LRA (Lesión renal aguda)etapa 2 (11.8 por ciento), y tres tenían LRA (Lesión renal aguda)etapa 3 (l7.6 por ciento). Un paciente con LRA (Lesión renal aguda)el estadio 3 recibió terapia de reemplazo renal continua. La evaluación de proteinuria con tira reactiva de orina no estuvo disponible en cuatro pacientes, pero en los 13 pacientes restantes (76,5 por ciento) tenían 100 mg/dl o menos. Seis de 17 pacientes habían recibido tratamiento paraCOVID-19incluyendo dexametasona sola (n=1), remdesivir (n=1), una combinación de dexametasona y remdesivir (n=2), y una combinación de remdesivir y plasma convaleciente (n{{ 3}}).

Los 17 pacientes tuvieron una reacción en cadena de polimerasa SARS-CoV-2 positiva, diagnosticada en un intervalo medio de 12 días antes de la autopsia. En el momento de la autopsia, tres (17,6 por ciento) dieron negativo para SARS-CoV-2. La mediana del intervalo post mortem fue de 18 horas y la autolisis fue leve en 11 pacientes (64,7 por ciento). Dieciséis (94,1 por ciento) murieron por complicaciones deCOVID-19(los 16 tenían enfermedad pulmonar grave, incluida bronconeumonía aguda superpuesta a daño alveolar difuso en ocho [50.0 por ciento), neumonía aguda y organizada en cuatro [25,0 por ciento], neumonía organizada en tres [ 18,8 por ciento], y daño alveolar difuso solo en uno [6,3 por ciento]).

TABLA 1. Datos demográficos de la cohorte y características clínicas relevantes

Características de la patología

Los hallazgos de la autopsia renal se caracterizan en la Tabla 2. La patología renal se caracterizó por lesión tubular aguda de moderada a grave en todos (Figura 1A). La mayoría mostró una marcada simplificación del epitelio de revestimiento y ectasia luminal. Se observaron cilindros de mioglobina en dos casos y tubulopatía osmótica en uno. La inflamación tubulointersticial fue leve con predominio de macrófagos y células T CD3-positivas. Capilaritis peritubárica, con un inmunofenotipo mixto de células T y macrófagos, se observó en 13 (76,5 por ciento) (Figura 1B-F). De manera similar, se observó glomérulo, con un inmunofenotipo mixto de células T y macrófagos en los mismos 13 (76,5 por ciento). Los cuatro pacientes que no mostraron inflamación microvascular habían sido tratados con una combinación de remdesivir y dexametasona (n=2) o plasma convaleciente (n=2). Los pacientes tratados con dexametasona sola o remdesivir solo tenían inflamación microvascular. La inflamación microvascular neutrofílica y la infiltración intersticial no fueron características destacadas en ninguno de los casos. La patología glomerular no inmunitaria indujo glomeruloesclerosis diabética nodular en 1 (5,9 por ciento); mientras que no se identificó glomeruloesclerosis segmentaria focal colapsante ni microangiopatía trombótica aguda. En todos los casos se observó una marcada congestión capilar peritubular (Figuras 1B y C). Se observaron arteriosclerosis de moderada a grave y hialinosis arteriolar en 14 (82,4 por ciento) y 11 (64,7 por ciento), respectivamente. Solo glomeruloesclerosis leve (<25%)and tubulointerstitial=""><25%)were noted="" in="" all="" 17="">

Los hallazgos de inflamación microvascular sugirieron una lesión mediada por el sistema inmunitario en pacientes graves.COVID-19-Enfermedad renal asociada. Además, buscamos caracterizar el perfil molecular y ultraestructural deCOVID-19riñones Se evaluaron los perfiles ultraestructurales, transcriptómicos y proteómicos de los riñones de siete pacientes que solo tenían una autólisis leve y para quienes se disponía de tejido fijado con glutaraldehído para el examen ultraestructural. Los hallazgos se compararon con dos estudios noCOVID-19cohortes de control con LRA (Lesión renal aguda): S-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)(todos con bronconeumonía) y NSAKI. Las características clínicas de los tres grupos se muestran en la Tabla 3. La edad media de los grupos fue de 78,71 y 74 años, respectivamente (P=,6). Había más mujeres en el S-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)grupo que en cualquiera de los otros dos grupos. El nivel medio de creatinina sérica terminal fue de 3,0 mg/dl, 1,6 mg/dl y 1,3 mgdl, respectivamente (p=,32). Los tres grupos tenían números similares de comorbilidades y eran comparables con respecto a los cambios microestructurales crónicos en el parénquima renal.

Características morfológicas de los tres AKI (Lesión renal aguda)Cohortes

La inflamación microvascular (glomerulitis y capilaritis peritubular) fue más prominente en pacientes conCOVID-19(5 de 7 pacientes) y S-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)(7 de 7 pacientes), en comparación con NS-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)controles (0 de 7 pacientes). Las células inflamatorias mononucleares fueron el tipo de célula inflamatoria predominante en ambos, mientras que los neutrófilos se observaron con poca frecuencia y solo en S-AKI. (Lesión renal asociada a sepsis). La inflamación tubulointersticial parenquimatosa fue parcheada, leve (3 de 7 pacientes) o moderada (4 de 7 pacientes) y en gran parte mononuclear enCOVID-19y S-AKI (Lesión renal asociada a sepsis), en comparación con la inflamación mínima en el NS-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)controles (7 de 7 pacientes).

En la evaluación ultraestructural deCOVID-19LRA (Lesión renal aguda). hubo evidencia de lesión tubular con vacuolización citoplasmática, pérdida del borde en cepillo y lesión mitocondrial. Este último se caracterizó por hinchazón, vacuolización y distorsión de las crestas. Se identificaron mitocondrias condensadas y mitocondrias circulares distorsionadas. También se identificaron densidades floculentas y vesículas grandes con abundantes vesículas recubiertas de clatrina que se asemejan a partículas virales (Figura 2A-C) No se observaron inclusiones tubulares reticulares en el citoplasma endotelial deCOVID-19casos. Se observó la lesión del endotelio capilar peritubular. No se apreció la multicapa de las membranas basales de los capilares glomerulares y peritubulares, características de una lesión endotelial más crónica. La apoptosis de las células epiteliales tubulares fue más común enCOVID-19(3,1/hpf) y S-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)(4,1/hpf) en comparación con NS-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)controles (0.7/hpf (P<.001)(figure>

SARS-CoV-2 HC y los estudios de hibridación in situ en secciones de riñón fueron negativos en los sieteCOVID-19casos. No se identificaron inclusiones virales definitivas en estudios ultraestructurales de podocitos, endotelio o túbulos.

TABLA 2. Resumen de los principales hallazgos de la autopsia con énfasis en la patología renal

Características moleculares de los tres AKI (Lesión renal aguda)Cohortes

Definir el fenotipo de infiltrados celulares y la arquitectura espacial de AKI (Lesión renal aguda)enCOVID-19riñones, se realizó citometría de masas de imágenes de alto parámetro para detectar 23 marcadores de superficie celular en un sistema de imágenes Hyperion acoplado a un citómetro de masas de tiempo de vuelo Helios (Tabla complementaria Sl, disponible en línea en http://www.mayoclinicprocedments.org ). La evidencia de una respuesta inmune adaptativa fue sugerida por el agrupamiento de células CD3 CD45RO plus en el tubulointersticial en cada caso. La respuesta inmune innata predominante fue subrayada por una población enriquecida de macrófagos (CD68 plus) tanto en el intersticio como en las asas capilares glomerulares (Figura 3A). El análisis de vecindad multiplex computacional reveló que, en general, las células CD3 más CD4t se enriquecieron muy cerca de las células presentadoras de antígeno (HLA-DR), en comparación con las células T CD3 CD4 y las células no T (Figura 3B).

Muestras de riñón deCOVID-19los casos y los controles fueron analizados por la plataforma NanoString usando el Panel de Trasplante de Órganos Humanos nCounter que perfila la expresión de 770 genes asociados con diferentes vías relacionadas con la respuesta inmune, la lesión tisular y los mecanismos de acción de los fármacos inmunosupresores.7

El análisis de la expresión génica reveló queCOVID-19los riñones tuvieron un enriquecimiento significativo de múltiples conjuntos de transcripciones de anotaciones funcionales, incluida la apoptosis, la autofagia, la expresión del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y I, y la diferenciación de células T auxiliares tipo 1 y células T reguladoras (Treg). Los patrones de expresión génica de losCOVID-19los casos se parecían a los de S-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)(Figura 4).

A la luz de la inflamación observada enCOVID-19riñones tanto morfológicamente como a nivel molecular, queríamos identificar alteraciones en el proteoma que pudieran sugerir mecanismos únicos paraCOVID-19LRA (Lesión renal aguda). Por lo tanto, realizamos un análisis proteómico cuantitativo a partir de secciones de riñón embebidas en parafina y fijadas con formalina deCOVID-19y ambos conjuntos de muestras de control. Se identificaron un total de 3594 proteínas, de las cuales 164 se expresaron diferencialmente entre los grupos (P<.05):87 between="" covid-19="" and=""> (Lesión renal asociada a sepsis)(16 con un cambio de pliegue> 1.2), 81 entre S-AKI (Lesión renal asociada a sepsis)y NS-IRA (Lesión renal asociada a sepsis) (8 with a fold-change >1.2), y 64 entreCOVID-19y S-AKI (Lesión renal aguda)(6 with a fold-change >1.2). Se realizó un agrupamiento jerárquico para todas las proteínas encontradas en los tres grupos y se generó un mapa de calor (Figura 5A). El Ingenuity Pathway Analysis demostró queCOVID-19LRA (Lesión renal aguda)los riñones se enriquecieron en proteínas involucradas en las vías de señalización de sirtuina y necroptosis, ambas involucradas en la respuesta reguladora a la inflamación (Tabla complementaria S2, disponible en línea en http://www.mayodinicproceedings.org). La regulación positiva de la vía de señalización de ceramida fue única enCOVID-19riñones en comparación con NS-AKI (Lesión renal asociada a sepsis), mientras que la fosforilación oxidativa se reguló negativamente enCOVID-19LRA (Lesión renal aguda)(Figura B).

FIGURA 1. Lesión tubular aguda e infiltración de células inmunitarias en riñones con enfermedad por coronavirus 2019.(A) La corteza renal en el microscopio óptico muestra una lesión tubular aguda con ectasia de la luz (tinción con hematoxilina y eosina [HE], aumento original*20). (B) Se observa infiltración intersticial mononuclear leve y congestión capilar peritubular (tinción HE, aumento original*40). (C y D) La capilaritis peritubular (flecha) es una característica notable dentro de los capilares congestionados (C) El microvascular en la inflamación está compuesto por células T CD3-positivas (E) y macrófagos CD68-positivos (F ) (aumento original*40 para E y F).