Parte Ⅰ: Los glucósidos feniletanoides de Cistanche tubulosa inducen la apoptosis de las células de carcinoma hepatocelular por vías dependientes de mitocondrias y MAPK y mejoran el efecto antitumoral a través de la combinación con cisplatino
Mar 05, 2022
Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com
Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li
Resumen
Cistanche tubulosaes un tipo de medicina herbal china y ejerce varias funciones biológicas. Estudios previos han demostrado queCistanche tubulosa glucósidos feniletanoides (CTPG)exhibir efectos antitumorales en una variedad de células tumorales. Sin embargo, los efectos antitumorales de CTPG en células de carcinoma hepatocelular (CHC) HepG2 y BEL-7404 aún son difíciles de alcanzar. Nuestro estudio mostró que CTPG inhibió significativamente el crecimiento de las células HepG2 y BEL-7404 a través de la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis, que se asoció con la activación de las vías MAPK caracterizadas por la fosforilación regulada al alza de p38, JNK, y ERK1/2 y vía mitocondrial dependiente caracterizada por la reducción del potencial de membrana mitocondrial. La liberación de citocromo c y la escisión de caspasa-3, -7, -9 y PARP aumentaron posteriormente mediante el tratamiento con CTPG. Además, CTPG suprimió significativamente la migración de HepG2 al reducir los niveles de metaloproteinasa de matriz-2 y factores de crecimiento del endotelio vascular. Curiosamente, CTPG no solo mejoró la proliferación de esplenocitos sino que también redujo la apoptosis de esplenocitos inducida por cisplatino. En el modelo de ratón con tumor H22, CTPG combinado con cisplatino inhibió aún más el crecimiento de las células H22 y redujo los efectos secundarios del cisplatino. En conjunto, CTPG inhibió el crecimiento de HCC a través del efecto antitumoral directo y el efecto de inmunopotenciación indirecta y mejoró la eficacia antitumoral del cisplatino.
Palabras clave
Cistanche tubulosaglucósidos feniletanoides, apoptosis, vía MAPK, vía mitocondrial dependiente, cisplatino, inmunopotenciación.
Introducción
Se predijo que el cáncer de hígado sería el sexto cáncer más comúnmente diagnosticado y la cuarta causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo en 2018, con aproximadamente 841 000 casos nuevos y 782000 muertes al año en el sudeste asiático (Mongolia, Camboya y Vietnam) .1 En China, el cáncer de hígado fue la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer en 2015.2 Más del 90 % de los cánceres primarios de hígado son carcinomas hepatocelulares (HCC) en todo el mundo. Actualmente, la hepatectomía, el trasplante hepático y la ablación percutánea son los principales métodos para el tratamiento del CHC. Desafortunadamente, estos tratamientos son efectivos para el 30 por ciento de los pacientes diagnosticados con cáncer de hígado temprano, mientras que los pacientes con diagnóstico de cáncer de hígado avanzado (que representan el 40 por ciento) tienen que depender de un tratamiento paliativo para extender su tiempo de supervivencia.3,4 Sorafenib en combinación con hígado El quimioembolismo arterial es una terapia paliativa común e importante para la mayoría de los pacientes con CHC avanzado en la región de Asia y el Pacífico. producción y promueve la apoptosis de las células tumorales. Sorafenib prolonga significativamente el tiempo de supervivencia del paciente de 3 a 5 meses, pero tiene efectos secundarios graves y está estrechamente relacionado con la aparición de resistencia a los medicamentos.6 Por lo tanto, es urgente desarrollar nuevos medicamentos o estrategias para el CHC.
La medicina tradicional china (MTC), sola o en combinación con otras estrategias, se ha utilizado para tratar el CHC y ha demostrado beneficios clínicos que incluyen un mayor tiempo de supervivencia, una mejor calidad de vida, menos reacciones adversas, etc.7,8Cistanchees un TCM que contiene glucósidos de feniletanoide (PhG), iridoides, lignina y polisacáridos que tiene varias funciones biológicas, como antioxidantes, antiinflamatorias, antienvejecimiento, mejora de la memoria y funciones de mejora inmunológica.9 Los PhG se han considerado como los principales componentes activos deCistanchey tienen múltiples funciones, incluidas la antioxidación, la antiinflamación, la antiapoptosis, la hepatoprotección y la neuroprotección.10-12 Nuestro grupo informó queCistanche tubulosa glucósidos feniletanoides(CTPG) podría inhibir el crecimiento de células B16-F10 de melanoma, células Eca-109 de carcinoma esofágico y células HCC H22 a través de vías de señalización extrínsecas o intrínsecas in vitro o in vivo; además, CTPG tuvo un efecto inmunoestimulador.13-15
En este estudio, investigamos el efecto antitumoral y el mecanismo de CTPG en células HepG2 y BEL-7404 in vitro, analizamos la función inmunomoduladora de CTPG in vitro e in vivo, y evaluamos más a fondo el efecto terapéutico de CTPG combinado con la quimioterapia. fármaco cisplatino en ratones con tumor HCC H22 in vivo. Descubrimos que CTPG podría inhibir el crecimiento de las células HepG2 y BEL-7404 a través de la apoptosis dependiente de las mitocondrias y la vía de señalización de MAPK. CTPG inhibió significativamente la migración de células HepG2 al reducir los niveles de metaloproteinasa de matriz-2 (MMP-2) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Además, CTPG promovió la proliferación y activación de células inmunitarias y mejoró la inmunidad de los ratones. Es importante destacar que CTPG combinado con cisplatino puede inhibir aún más el crecimiento de las células H22 in vivo y reducir los efectos secundarios del cisplatino.
Materiales y métodos
animales
Se compraron ratones machos BALB/c, Kunming y ratones hembra C57BL/6 de aproximadamente 6 a 8 semanas de edad del Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, China) y se alojaron en una instalación para animales de la Universidad de Xinjiang a temperatura ambiente. (RT) de 25±3 grados, y un periodo de luz-oscuridad de 12/12 horas.
Líneas celulares y cultivo celular
Las células murinas H22 se adquirieron de Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China), y las células HCC HepG2 y BEL-7404 humanas se obtuvieron del Laboratorio Clave de Recursos Biológicos e Ingeniería Genética de Xinjiang. , Universidad de Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, China) y cultivadas en medio RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.) o medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) que contiene 10 por ciento de suero bovino fetal inactivado por calor (MRC, China), 1 por ciento L -glutamina (100mM), penicilina 100U/mL y estreptomicina 100ug/mL a 37 grados en una atmósfera humidificada de 5 por ciento de CO2.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Los principales compuestos de CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghái, China) se calificaron y cuantificaron mediante HPLC como se informó anteriormente.13 Se utilizó una columna ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5 μm). y la fase móvil consistió en una solución de ácido fórmico al 0,2 por ciento y metanol con un gradiente de 23 por ciento a 31 por ciento. Se inyectó un total de 10 μl de muestra y se detectó a 330 nm. Los estándares de echinacósido y acteosido (Yuanye, Shanghai, China) se utilizaron para analizar los componentes de CTPG.
Análisis de Viabilidad Celular
Los efectos antitumorales de CTPG en células HepG2 y BEL-7404 se evaluaron usando MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolio bromuro). Las células HepG2 y BEL-7404 se sembraron en 96-placas de pocillos (5 × 104 células/pocillo) y se trataron con 0, 200, 400 y 600 ug/ml de CTPG durante 24 y 48 horas, respectivamente, después de 24 horas de incubación a 37 grados. Se utilizaron aproximadamente 35 ug/ml de cisplatino (Yuanye) como control positivo. Luego se agregaron 100 μL de MTT (0,5 mg/mL, diluido en medio sin medio FBS) a cada pozo y se cultivaron durante 3 horas a 37 grados y 5 por ciento de CO2. Después de la incubación, las placas se centrifugaron a 1200 rpm durante 7 minutos, se retiró el medio y se añadieron 200 ug/ml de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán formados. Los valores de OD490 se midieron con un lector de microplacas de 96-pocillos (Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.). Para evaluar los efectos de CTPG en los esplenocitos, las células se aislaron de ratones C57BL/6 y se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 1 × 105 células/pocillo. Los esplenocitos se trataron con 0, 200, 400 y 600 ug/ml durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente. La viabilidad celular se calculó mediante la fórmula siguiente: Viabilidad celular (porcentaje)=(OD tratada/OD no tratada) × 100 por ciento.
Detección de Ki-67
La detección de Ki{{0}} se realizó de acuerdo con nuestro estudio anterior.16 En resumen, las células BEL-7404 se trataron con diferentes concentraciones (0, 200, 400 y 600 ug/mL) de CTPG o cisplatino (35ug/mL). Después de 24 horas, las células se recolectaron y lavaron con PBS, luego se fijaron y permeabilizaron con Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La tinción intracelular se realizó usando anticuerpo Ki-67 conjugado con FITC (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron por citometría de flujo (BD FACSCalibur, CA, EE. UU.).
Análisis de Apoptosis Celular y Ciclo Celular
Se sembraron células HepG2 y BEL-7404 a una densidad de 2,5 x 105 células/placa y se incubaron a 37 grados durante la noche. Las células se tripsinizaron y se recolectaron mediante centrifugación después del tratamiento con varias concentraciones de CTPG o pretratadas con inhibidor de caspasa (Z-VAD-FMK) o inhibidor de caspasa-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, China) durante 2 horas antes del tratamiento con CTPG. Después de 24 horas, se detectó la apoptosis por citometría de flujo. En resumen, las células recolectadas se lavaron con PBS frío (Gibco) y se resuspendieron en tampón de unión anexina con 2,5 μl de anexina V-FITC y 5 μl de solución de tinción de PI-PE (Solarbio, Beijing, China), y luego las células se incubaron a temperatura ambiente. en la oscuridad durante 15 minutos. Para el análisis de la distribución del ciclo celular, las células se recogieron después del tratamiento con CTPG y se fijaron en etanol frío al 70 por ciento a 4 grados durante 30 minutos. Las células se tiñeron con PI (BD Biosciences) en la oscuridad durante 30 minutos. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur). Los niveles de expresión de la apoptosis celular y las proteínas relacionadas con el ciclo se detectaron mediante transferencia Western.
mancha occidental
Se realizó Western blot de acuerdo con nuestro estudio previo. 17 Los CHC se trataron con CTPG durante 24 horas. Después de lavar dos veces con PBS helado, todas las células adherentes y flotantes se recolectaron y lisaron en RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) durante 20minutos en hielo. Después de la centrifugación a 12000 rpm 4 grados durante 10 minutos, se determinó la concentración de proteína utilizando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. La misma concentración de proteínas se separó mediante SDS-PAGE al 12 por ciento y se transfirió a membranas de PVDF. Después de lavar con tampón PBST (PBS con 0,05 por ciento de Tween-20), las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 por ciento a 37 grados durante 1 hora y luego se incubaron con los anticuerpos primarios (Cell Signaling Technology, MA, EE. UU. ) en diluciones apropiadas durante la noche a 4 grados . Después de lavar 3 veces con PBST, la membrana se incubó con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con HRP (eBioscience) durante 2 horas a 37 grados. Las proteínas diana se detectaron utilizando un kit de ensayo ECL (Beyotime). Los datos de escaneo en escala de grises fueron obtenidos por Image J.
Análisis del Potencial de Membrana Mitocondrial (Δψm)
Δψm se determinó mediante colorante JC-1 permeable a la membrana (Beyotime). Brevemente, las células HepG2 y BEL-7404 se trataron con diferentes concentraciones de CTPG (0, 200, 400 y 600 ug/ml) durante 24 horas. Todas las células se recogieron y se lavaron con tampón de lavado JC-1. Las células se tiñeron con la sonda fluorescente JC-1 según las instrucciones del fabricante durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar dos veces con PBS, todas las muestras se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur).
Tinción Hoechst 33342
La tinción con Hoechst 33342 se realizó de acuerdo con nuestro estudio anterior.16 Los cambios morfológicos de los núcleos se examinaron utilizando colorante de unión a ADN permeable a la membrana Hoechst 33342 (Beyotime). Brevemente, las células se inocularon en una placa de 6-pocillos a una concentración de 1 × 105 células/pocillo en 2 ml de medio. Cuando se alcanzó una confluencia del 70 al 80 por ciento, las células se trataron con 200, 400 y 600 ug/mL de CTPG o cisplatino durante 24 horas. Las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído helado al 4 por ciento a 4 grados durante 10 minutos. Después de lavar con PBS, las células se tiñeron con Hoechst 33342 a 4 grados durante 10 minutos. Las muestras se observaron mediante un microscopio invertido de fluorescencia (Nikon Eclipse Ti-E, Japón).
Ensayo de migración
La migración de células HCC se detectó a través del ensayo de cicatrización de heridas. En resumen, se sembraron células HepG2 (2x104/pocillo) en una placa de 24-pocillos. Después de alcanzar una confluencia del 80 por ciento, se rascó una vez el centro de cada pocillo con una punta de pipeta de 20 μl. Después de lavar con PBS, las células se trataron con cisplatino (35 ug/mL) o diferentes concentraciones (0, 200, 400 y 600 ug/mL) de CTPG a 37 grados. Después de 24 horas, se tomaron imágenes de cada muestra bajo un microscopio (Nikon Eclipse Ti-E). Las distancias promedio de migración celular se analizaron mediante la Imagen J. El porcentaje de cicatrización de heridas se calculó mediante la ecuación: cicatrización de heridas (porcentaje)=(1−área de rasguño en el punto de tiempo indicado/área de rasguño a las 0 horas) × 100 por ciento Los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con la migración celular MMP-2 y VEGF se detectaron mediante transferencia de Western.
Proliferación y apoptosis de esplenocitos
Para el análisis de proliferación, se aislaron esplenocitos de 3 ratones C57BL/6 y se tiñeron con CFSE (eBioscience). Las células marcadas con CFSE se inocularon en 24-placas de pocillos a una densidad de 2 × 106 células en 1 ml de medio por pocillo y se trataron con diferentes concentraciones de CTPG (200, 400 y 600 ug/ml) o se combinaron con 35 ug /ml de cisplatino durante 72 horas. El análisis de citometría de flujo se realizó después de la tinción con CD3-APC y CD19-PE (BD Biosciences). Para el análisis de apoptosis, se inocularon esplenocitos en 24-placas de pocillos a una densidad de 2 × 106 células en 1 ml de medio por pocillo y se trataron con diferentes concentraciones de CTPG (200, 400 y 600 ug/ml) o se combinaron con cisplatino durante 24 horas. El análisis de citometría de flujo se realizó después de la tinción con 2,5 μl de anexina V-FITC y 5 μl de solución de PI-PE.
Evaluación de seguridad y actividades inmunoestimuladoras de CTPG in vivo
Para evaluar las actividades inmunoestimuladoras in vivo de CTPG, se dividieron aleatoriamente ratones Kunming macho de 6 a 8 semanas en 7 grupos (5 ratones/grupo). Se aplicó inyección subcutánea (sc, 200, 400 mg/kg), inyección intraperitoneal (ip, 200, 400 mg/kg) e intragástrica (ig, 200, 400 mg/kg) cada 2 días por un total de 7 veces. , mientras que el grupo control no recibió ningún tratamiento. Los ratones se pesaron cada dos días y se observó el estado de los ratones todos los días. Después del tratamiento con CTPG, los órganos de los ratones se separaron y pesaron. Los índices de órganos se calcularon según la fórmula: índice de órganos=peso de órganos (mg)/peso corporal (g). Los esplenocitos se recolectaron, contaron y tiñeron con anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC o anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Las muestras se detectaron por citometría de flujo (BD FACSCalibur).
Eficacia antitumoral de CTPG combinado con cisplatino en ratones portadores de tumores H22
A ratones BALB/c macho de aproximadamente 6 a 8 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea células H22 (1,0 × 106 por ratón en 100 μl de PBS). Cuando los volúmenes del tumor alcanzaron aproximadamente 60 mm3, los ratones portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en 4 grupos (6 ratones/grupo) y se trataron con cisplatino (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatino (4 mg/kg) más CTPG ( 400mg/kg), o sin tratamiento (grupo control), respectivamente. A los ratones tumorales se les inyectó por vía intraperitoneal CTPG los días 5, 7, 9, 11 y 13, respectivamente. El cisplatino se inyectó por vía intravenosa los días 7 y 11. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron cada dos días. El volumen del tumor se calculó de la siguiente manera: Volumen del tumor (V)=a × b2 /2, en el que a y b representan el diámetro más largo y más corto de un tumor medido con un calibrador vernier, respectivamente. El día 20 se aislaron y pesaron órganos y tumores. Los esplenocitos se recolectaron, contaron y tiñeron con anti-CD3-APC y anti-CD19-PE o anti-CD4-FITC y anti-CD8-APC o anti-CD11b-PE y anti-Gr-1-APC o anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC y anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Posteriormente, las frecuencias y el número de células se analizaron por citometría de flujo (BD FACSCalibur).
Análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico se llevó a cabo usando un análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías usando el software Prism5.0. PAGS<.05 was="" considered="" statistically="">
Resultados
CTPG inhibió la proliferación de células HCC in vitro
Los componentes de CTPG se calificaron y cuantificaron mediante HPLC utilizando estándares de equinacósido y actósido (Figura 1A complementaria), que eran los componentes principales de los glucósidos feniletanoides de Cistanche. 18 De acuerdo con los tiempos de retención pico y las áreas pico, CTPG contenía 28 por ciento de equinacósido y 9,9 por ciento de acteósido. Además, el contenido de polisacáridos en CTPG fue del 34,8 por ciento por el método de fenol-ácido sulfúrico.19 El ensayo MTT mostró que CTPG redujo significativamente la viabilidad de las células BEL-7404 y HepG2 de una manera dependiente de la dosis y el tiempo ( Figura 1A). De manera constante, la proliferación de células BEL-7404 se inhibió significativamente mediante el tratamiento con CTPG, que se analizó mediante tinción con Ki-67 (Figura 1B). El efecto de CTPG sobre la proliferación de esplenocitos in vitro también se analizó mediante ensayo MTT. Observamos que CTPG mejoró la proliferación de esplenocitos de una manera dependiente de la dosis (Figura 1C).
La vía de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) juega un papel fundamental en la supervivencia, diferenciación y resistencia a los medicamentos de las células cancerosas humanas.20 Para investigar si la vía de señalización de MAPK estaba involucrada en el efecto inhibitorio de CTPG sobre la proliferación de células HCC, se analizaron los niveles de fosforilación de varias proteínas de la vía de señal MAPK en células HepG2 después del tratamiento con CTPG a diferentes concentraciones y diferentes puntos de tiempo. La fosforilación de JNK (P-JNK) y p38 (P-p38) aumentó de forma dependiente de la dosis mediante el tratamiento con CTPG. La fosforilación de ERK (P-ERK) se reguló a la baja con 200 y 400 ug/ml de tratamiento con CTPG, mientras que P-ERK se reguló al alza con 600 ug/ml de tratamiento con CTPG (Figura 1D). Además, los niveles de P-JNK, P-p38 y P-ERK aumentaron de forma dependiente del tiempo (Figura 1D). Estos resultados sugirieron que CTPG podría inhibir la proliferación de células HCC a través de la vía de señalización MAPK
Detención del ciclo celular de HCC inducida por CTPG en la fase S
Además, analizamos si CTPG inhibía la proliferación de células HCC mediante la inducción de la detención del ciclo celular. Después del tratamiento con CTPG, se observó una acumulación de células BEL-7404 en la fase S de forma dependiente de la dosis. De manera similar, CTPG también indujo la detención del ciclo celular de HepG2 en la fase S y las frecuencias aumentaron del 40,66 % en el grupo de control al 61,90 % en el grupo tratado con 600 ug/ml de CTPG (Figura 2A). Las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclina (CDK) desempeñan funciones importantes en el control y el desarrollo de la división celular,21 de las cuales se asociaron con la fase G2/M.22 El nivel de expresión de la ciclina D1 disminuyó de forma dependiente de la dosis con el tratamiento con CTPG, pero promovió la G1 a Progresión de la fase S. Los niveles de expresión de Cyclin B1, CDK1 y CDK2 también se redujeron; estas proteínas se asociaron con la fase G2/M (Figura 2B). Estos resultados sugirieron que CTPG suprimió la proliferación de células HCC al inducir la detención del ciclo celular.
Vía de apoptosis dependiente de mitocondrias activada por CTPG en células de HCC
También detectamos si CTPG desencadenó la apoptosis en células HCC y descubrimos que CTPG inducía la apoptosis en células HepG2 y BEL-7404 de una manera dependiente de la dosis (Figura 3A). Además, los niveles de expresión de Bax y Bcl-2 aumentaron y disminuyeron con el tratamiento con CTPG de forma dependiente de la dosis, respectivamente (Figura 3B). La apoptosis de las células HepG2 se determinó adicionalmente mediante tinción con Hoechst 33342 después del tratamiento con CTPG durante 24 horas. La morfología nuclear se observó mediante un microscopio de fluorescencia invertido. Como se muestra en la Figura 3C, las células HepG2 de control se tiñeron homogéneamente, mientras que las células HepG2 tratadas con CTPG mostraron condensación y fragmentación de la cromatina de manera dependiente de la dosis, similar a las células HepG2 tratadas con cisplatino. Estos resultados indicaron que CTPG inducía la apoptosis de las células de HCC.
La integridad de la membrana mitocondrial externa está estrictamente regulada por la familia Bcl-2 y la reducción de Δψm promueve la liberación de citocromo c que activa la cascada de caspasas para inducir la apoptosis.23,24 Cuando Δψm disminuye, el JC{{ El polímero 3}} (fluorescencia roja) se descompone en monómeros (fluorescencia verde).25 Por lo tanto, el Δψm de las células HCC se detectó mediante tinción JC-1 después del tratamiento con CTPG durante 24 horas. Como se muestra en la Figura 4A, la intensidad de fluorescencia verde del canal FL-1 aumentó de forma dependiente de la dosis con el tratamiento con CTPG, mientras que la intensidad de fluorescencia roja del canal FL-2 disminuyó de forma dependiente de la dosis en ambos tratamientos. BEL-7404 y células HepG2. La observación con microscopio de fluorescencia invertida mostró un resultado similar (Figura 4B), lo que indica que CTPG reduce el Δψm de las células HCC. Posteriormente, observamos que los niveles de citocromo c aumentaron en las células BEL-7404 y HepG2 después del tratamiento con CTPG (Figura 4C), lo que confirmó aún más la reducción de Δψm en las células de HCC tratadas con CTPG.
La liberación de citocromo c puede activar la caspasa iniciadora-9 para inducir la apoptosis.26 Los resultados del ensayo de transferencia Western sugirieron que los niveles de caspasa escindida-3, -7 y{{4} } aumentaron mientras que el nivel de caspasa escindida -8 no cambió (Figura 5). La caspasa activada-3 puede escindir la enzima de reparación del ADN de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) para evitar la reparación del ADN y acumular daños en el ADN.27 También observamos niveles regulados al alza de PARP escindida. El papel de la cascada de caspasas en la apoptosis de las células HCC inducida por CTPG se determinó adicionalmente mediante el uso del inhibidor de caspasas (Z-VAD-FMK) y el inhibidor de caspasas-3 (Ac-DEVD-CHO), respectivamente. Z-VAD-FMK revirtió significativamente la apoptosis de las células BEL-7404 y HepG2 inducida por CTPG (Figura 1B complementaria). De manera similar, Ac-DEVD-CHO también revirtió significativamente la apoptosis de las células HepG2 inducida por CTPG (Figura 1C complementaria). Los resultados demostraron que CTPG inducía la apoptosis de las células de HCC mediante una vía dependiente de mitocondrias.
CTPG suprimió la migración de células HCC in vitro
La migración de células cancerosas se considera uno de los procesos críticos en la metástasis tumoral. Para determinar si CTPG afecta la migración de células HCC, se evaluó la motilidad de las células HepG2 mediante el ensayo de cicatrización de heridas. Como se muestra en la Figura 6A y B, la migración de células HepG2 se inhibió significativamente mediante el tratamiento con CTPG de forma dependiente de la dosis. La familia de MMP y VEGF juegan un papel fundamental en la migración de las células tumorales.28 Después del tratamiento con CTPG durante 24 horas, los niveles de MMP-2 y VEGF se redujeron significativamente (Figura 6C), lo que sugiere que CTPG podría suprimir la invasión y la metástasis. de CHC.
CTPG mejoró la inmunidad de los ratones
Se ha informado que los polisacáridos de Cistanche deserticola tienen funciones inmunomoduladoras que incluyen la promoción de la proliferación de linfocitos y la activación de macrófagos.29 Las células T y las células B son los linfocitos principales, que median las respuestas inmunitarias celular y humoral, respectivamente. CTPG contenía un contenido de polisacáridos del 34,8 por ciento. Por lo tanto, examinamos los efectos de CTPG en la proliferación de células T y células B. Como se muestra en la Figura complementaria 2A, CTPG aumentó significativamente la proliferación de células T y células B de manera dependiente de la dosis, incluso en presencia de cisplatino. Curiosamente, CTPG inhibió significativamente la apoptosis de los esplenocitos inducida por cisplatino (Figura 2B complementaria), lo que indica que CTPG podría mejorar los efectos secundarios del cisplatino en el sistema inmunitario de los ratones.
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