PARTE 1 Preparación y evaluación de la administración transdérmica a base de microemulsión de glucósidos feniletanoides de Cistanche Tubulosa

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

JIANHUA YANG1*, HUANHUAN XU1-3*, & et al.

Resumen.

El objetivo principal del presente estudio fue desarrollar una nueva formulación de microemulsión (ME) para entregarglucósido feniletanoide de cistanche(PG) para usar en aclaradores de la piel y protectores solares. La fase oleosa se seleccionó en función de la solubilidad del fármaco, mientras que el tensioactivo y el cotensioactivo se analizaron y seleccionaron en función de su capacidad solubilizante y la eficiencia con la que formaban ME. Se construyeron diagramas de fase pseudoternarios para evaluar las regiones ME y se seleccionaron como vehículos cinco formulaciones de ME de aceite en agua. Se realizaron experimentos de permeación de la piel in vitro para optimizar la formulación de ME y evaluar su permeabilidad en comparación con la de la solución salina. Las propiedades fisicoquímicas del ME optimizado y la capacidad de permeación del PG(glucósido feniletanoide de cistanche) entregados por este ME también fueron investigados. La formulación ME optimizada estaba compuesta por miristato de isopropilo (7 %, p/p), Cremorphor EL (21 %, p/p), propilenglicol (7 %, p/p) y agua (65 %, p/p). La cantidad acumulada de PG(glucósido feniletanoide de cistanche) la que permeó a través de la piel extirpada del ratón cuando fue transportada por ME fue ~1,68 veces mayor que cuando la PG fue transportada solo por solución salina. La cantidad acumulada de PG en la microemulsión (4149.650±37.3 µg·cm-2 ) fue significativamente mayor que la de PG en la solución salina (2288.63±20.9 µg· cm-2 ). Además, el coeficiente de permeabilidad indicó que la microemulsión optimizada era un vehículo más eficiente para la administración transdérmica de PG que la solución de control (8,87±0,49 cm/hx10-3 frente a 5,41±0,12 cm/hx10-3). En conjunto, la capacidad de penetración de los PG transportados por ME aumentó significativamente en comparación con la solución salina.

cistanche

Introducción

hierba cistanche,una hierba tónica comúnmente distribuida en las regiones desérticas, se ha utilizado con frecuencia en la medicina tradicional china. Hasta la fecha, se han realizado múltiples estudios para investigar sus propiedades biofarmacéuticas, incluida la mejora de la memoria, la potencia sexual, la eliminación de radicales libres y la actividad antienvejecimiento (1). El componente principal de H. cistanche esglucósido feniletanoide (PG). Estudios previos han revelado que el PG inhibe la actividad de la tirosinasa, la enzima limitante de la síntesis de melanina en el cuerpo humano (2). Además, P.G.(glucósido feniletanoide de cistanche) se ha informado que es responsable de la eliminación de radicales 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (3) y de la protección de los queratinocitos de la radiación ultravioleta (UV). Por lo tanto, este componente puede tener potencial en la despigmentación de la piel. La medicación tópica se ha utilizado comúnmente en los campos cosméticos, y el fármaco se administra directamente sobre la superficie del cuerpo (4). Las microemulsiones (ME) son un nuevo sistema de administración de fármacos compuesto convencionalmente por fases de aceite, surfactante, cosurfactante y acuosa (5) y se ha informado que mejoran la tasa y la absorción de fármacos lipofílicos (6). Además, debido a su solubilidad satisfactoria, baja irritación de la piel y alta permeabilidad, se espera que se use en la administración tópica de fármacos (7,8). Hasta donde sabemos, se han realizado pocos estudios en los que se haya administrado PG a través de medicación tópica utilizando microemulsión. En el presente estudio, se estableció un sistema de administración de nanoemulsión de aceite en agua (O/W) para la administración transdérmica y se incorporó PG a la nanoemulsión (9,10). Mientras tanto, la preparación y caracterización de la nanoemulsión basada en PG se realizó investigando la liberación transdérmica in vitro.

Materiales y Métodos Reactivos.

Cremorphor EL y miristato de isopropilo (IPM) se adquirieron de Sigma Aldrich; Merck Millipore (Darmstadt, Alemania). El etanol, el ácido oleico (OA) y el Tween-80 se adquirieron de Guangcheng Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). El oleato de etilo se adquirió de Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Todos los productos químicos y disolventes utilizados eran de grado reactivo analítico. Preparación y evaluación de la administración transdérmica a base de microemulsión de glucósidos feniletanoides de Cistanche tubulosa JIANHUA YANG1*, HUAN HUAN XU1-3*, SHANSHAN WU2, BOWIE JU2, DANDAN ZHU2, YAO YAN1, MEI WANG2 y JUMPING HU{{9} } Departamento de Farmacia, El Primer Hospital Afiliado; 2 Departamento de Medicina Natural, Facultad de Farmacia, Universidad Médica de Xinjiang, Urumqi, Xinjiang 830011; 3 Department of Pharmacy, Kanghua Hospital, Dongguan, Guangdong 523003, PR China Recibido el 2 de diciembre de 2015; Aceptado el 29 de noviembre de 2016, DOI: 10.3892/MMR.2017.6147 Correspondencia a: Dr. Junping Hu, Department of Natural Medicines, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, 393 Xinyi Road, Urumqi, Xinjiang 830011, PR China Correo electrónico: hujp0551 @yeah.net * Contribuyó igualmente Palabras clave: glucósido de feniletanoide, microemulsión, administración transdérmica, aclarador de la piel, protector solar yang et al: PG A BASE DE ME PARA APLICACIÓN COSMÉTICA 1110 Preparación de PhG. PhG(glucósido feniletanoide de cistanche) se preparó como se describe rutinariamente (11).

El secado al aireC. tubulosafue alimentado y extraído por percolación con 80 por ciento de EtOH. El percolado se evaporó bajo presión, seguido de filtración del fluido residual. El filtrado se concentró y se cromatografió en una columna de resina macroporosa SP-825 usando 0, 30, 50, 70 y 90 por ciento de EtOH en agua como eluyentes. Los 30-50 por ciento de eluyentes de EtOH se concentraron y secaron para obtener una fracción rica en PhG. La espectrofotometría UV indicó el contenido de PhG(glucósido feniletanoide de cistanche) fue del 87,6 por ciento. Detección de aceites, tensioactivos y cotensioactivos para ME. Se realizaron pruebas de solubilidad para seleccionar los componentes apropiados para la preparación de una formulación de ME con una alta capacidad de carga de fármaco. En este proceso, se añadió una cantidad en exceso de PG a 4 ml de cada uno de los siguientes reactivos: IPM, parafina líquida, OA, Cremophor EL, Tween‑80, etanol absoluto, propilenglicol, glicerina y PEG400 , respectivamente. Después de esto, la mezcla resultante se agitó recíprocamente a 37 °C durante 72 h, seguido de centrifugación a 12 830 xg durante 10 min. Posteriormente, el sedimento se resuspendió en metanol y se determinó el PG mediante espectrofotometría UV a 333 nm. Las soluciones diluidas apropiadas de aceites, tensioactivos y codisolventes en metanol sirvieron como control en blanco. Construcción del diagrama de fase. Para obtener un rango de concentración de componentes para el límite de microemulsión existente, se construyeron diagramas de fase pseudoternarios usando un método de titulación de agua como se describió anteriormente (12). Se prepararon diagramas de tres fases con relaciones en peso de tensioactivo a cotensioactivo de 1:3, 1:1 y 3:1. A continuación, la fase oleosa y la mezcla de tensioactivos se mezclaron en proporciones ponderales de 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 y 9:1. . La mezcla de aceite y surfactante se mezcló homogéneamente y se diluyó gota a gota con agua purificada bajo agitación magnética (300 rpm) a temperatura ambiente hasta obtener ME transparente. Se registró la concentración de los componentes para completar el diagrama de fase pseudoternario. Con base en estos diagramas, se seleccionaron las concentraciones apropiadas de materiales para la preparación de ME a base de PG. Preparación de ME y la solución acuosa de PG. Se seleccionaron un total de 5 ME (ME1-5) de acuerdo con los diagramas de fase con una relación en peso de tensioactivo: cotensioactivo de 3:1 (Tabla I). Los sistemas de microemulsión se prepararon mezclando aceite con la mezcla de tensioactivo y cotensioactivo, y se añadió agua con precisión en las fases oleosas con agitación magnética (300 r/min) a 37 ˚C. Los sistemas se equilibraron usando agitación magnética suave durante 30 minutos, seguido de la disolución de la cantidad adecuada de PG bajo ultrasonidos. La solución acuosa se preparó con el mismo contenido de PG disuelto en agua purificada. Caracterización de la microemulsión. El tamaño promedio de gota y el índice de polidispersidad de los ME se evaluaron mediante espectroscopia de correlación de fotones (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Reino Unido). Todas las muestras se diluyeron con agua en una proporción de 1:5 y se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm. La prueba se realizó en una cámara termostática a 25˚C por triplicado. La morfología de las microemulsiones de PG se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (JEM-100CXII; JEOL Ltd., Tokio, Japón). Brevemente, se depositó una gota de muestra diluida en una rejilla de cobre recubierta de película, seguida de tinción con una gota de solución acuosa de ácido fosfotúngstico al 2 por ciento.

Los diámetros de gota promedio de las microemulsiones se determinaron mediante un instrumento de espectroscopia de correlación de fotones (BI{{0}}SM; Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, EE. UU.) a temperatura ambiente. La viscosidad de los vehículos ME se midió a 25˚C, usando el viscosímetro digital NDJ-8S (Shanghai Precision and Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) con un n. 1 rotor ajustado a 60 rpm. determinación del pH. Los valores de pH de los ME se determinaron a 25 °C utilizando el acidímetro digital Phs-3C (Shanghai REX Instruments Factory, Shanghai, China). Los índices de refracción se midieron con un refractómetro termostático Abbe (Optical Instrument Factory, Shanghai, China). Preparación de tejidos de la piel. Se compraron ratones Kunming macho que pesaban 20 g en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Xinjiang (Xinjiang, China). 10 ratones (6 semanas de edad) fueron sometidos a alimentación adaptativa durante 1 semana en un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad, a temperatura ambiente (24±2˚C), con una humedad de 50±15 por ciento. Todos los animales tenían acceso a una dieta estándar y agua. El pelo se eliminó con una maquinilla eléctrica. Después de la anestesia terminal con hidrato de cloral (10 por ciento) mediante inyección subcutánea, se extirparon los tejidos de la piel de la región abdominal y se eliminaron la grasa subcutánea y el tejido conectivo. Los tejidos se colocaron en un refrigerador a 4˚C durante la noche. Los protocolos de estudio fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad Médica de Xinjiang (Xinjiang, China). Estudio de permeabilidad in vitro. Los experimentos de permeación se realizaron como se describió previamente (12). La piel extirpada se sujetó entre el donante y la cámara receptora de una celda de difusión vertical con un área de difusión efectiva de 2,8 cm2. La cámara receptora se llenó con solución salina normal fresca. La celda de difusión se mantuvo a 37 °C usando un baño de agua recirculante y la solución en las cámaras receptoras se agitó continuamente a 200 rpm. Después de esto, la formulación de prueba (1,0 ml) se colocó suavemente en la cámara del donante. Posteriormente, se extrajeron 3 ml de la solución de la cámara receptora y se reemplazaron con un volumen igual de solución salina normal fresca a intervalos predeterminados (0, 2, 4, 6, 8, 10 y 24 h). La muestra obtenida de la cámara del receptor se utilizó para determinar PG(glucósido feniletanoide de cistanche)niveles utilizando espectroscopia UV a una longitud de onda de 333 nm. La cantidad acumulativa de PG que penetró a través de la piel de ratón extirpada se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

Donde Qn era la cantidad acumulada en un tiempo dado t, Cn es la concentración de fármaco de la solución receptora en cada momento de muestreo, Ci es la concentración de fármaco de la muestra, S es el área de difusión efectiva (S{{0 }}.8 cm2), y V0 y Vi son los volúmenes de la solución receptora y la muestra, respectivamente. La cantidad acumulada (Qn) de PG(glucósido feniletanoide de cistanche)permeado se representó en función del tiempo (t) para cada formulación. La tasa de penetración de PG en estado estacionario (Jss, µg/cm-2 /h-1 ) a través de la piel del ratón se calculó a partir de la pendiente de la porción lineal de las gráficas de Qnversus tiempo. El coeficiente de permeabilidad (Kp, cm/h) se calculó según la siguiente fórmula:

Donde Kp es el coeficiente de permeabilidad, Jss es el flujo de salida calculado en estado estacionario y C0representa la concentración de fármaco que permaneció constante en el vehículo. Estudio de retención de piel. Las siguientes secciones detallan la comparación del comportamiento de permeación ex vivo, la cantidad acumulada, la tasa de permeabilidad, el coeficiente de permeabilidad y las características de retención de la piel entre las formulaciones de ME optimizadas (contenido de PG, 2 por ciento, p/p) y la solución acuosa. Al final del experimento de permeación, se determinó el nivel de fármaco residual en la piel utilizando un método de homogeneización. Después de lavar con solución salina normal, la piel se cortó en pequeñas secciones y se colocó en un tubo de vidrio que contenía 3 ml de metanol en un baño de hielo. La muestra se homogeneizó con una velocidad de 12000 r/min. rpm durante 2 min y luego se centrifugó a 12.830 xg horizontalmente durante 30 min a 25˚C. El sobrenadante se pasó a través de un filtro microporoso (0,45 µm), y el PG(glucósido feniletanoide de cistanche)los niveles en el sobrenadante se determinaron mediante espectroscopia UV a una longitud de onda de 333 nm. Estudio de estabilidad. La estabilidad física de la EM cargada con PG se investigó a través de la claridad, el análisis del tamaño de las partículas y la separación de fases, que se observó a 2‑8 °C y a temperatura ambiente durante 3 meses. La centrifugación se realizó a 12 830 xg durante 30 min a 25 °C para evaluar la estabilidad física de la EM. La separación de fases y la concentración de PG se investigaron mensualmente para juzgar la temperatura de almacenamiento óptima. La estabilidad química se evaluó en formulaciones cargadas de fármaco, almacenadas a 2‑8 ˚C ya temperatura ambiente, con el contenido de PG determinado por espectrofotometría UV a 333 nm. Prueba de sensibilidad de la piel. Se realizaron pruebas de sensibilidad cutánea en conejos (con un peso de 2,02,5 kg) para evaluar el potencial irritante de la aplicación tópica de la formulación desarrollada como se describió anteriormente (13). Nueve conejos Holland (16 semanas de edad, con un peso de 2,0-2,5 kg; 5 machos y 4 hembras) se obtuvieron del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Xinjiang. Los animales se sometieron a alimentación adaptativa durante 1 semana en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad, a temperatura ambiente (24±2˚C), con una humedad del 50±15 por ciento. Todos los animales tenían acceso a una dieta estándar y agua. Se utilizó embolismo aéreo para el sacrificio. Los protocolos utilizados en el presente estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Xinjiang (Xinjiang, China). Se eliminó el vello de la espalda ~24 h antes de la administración de las formulaciones de ME. Los animales se dividieron en los siguientes grupos: un grupo de ME optimizado (n=3), con administración tópica de ME optimizado que contenía 2 por ciento (p/p) de PG; un grupo de solución salina de PG (n=3), con administración tópica de solución salina que contiene 2 por ciento (p/p) de PG; y grupo de solución salina de control (n=3), sujeto a administración tópica de solución salina normal. La administración se realizó dos veces al día durante 5 días. Se observó a los animales en busca de signos de picazón o cambios en la piel, incluidos eritema, pápula, descamación y sequedad (14). Después de la retirada del fármaco, se continuó la observación durante 3 días para administraciones únicas o múltiples. Las puntuaciones de irritación del área de prueba se evaluaron juzgando la extensión del eritema y el edema de acuerdo con los siguientes criterios: 1, sin reacción visible; 2, una ligera reacción; 3, una reacción moderada y 4, una reacción severa (15,16). Finalmente, las puntuaciones totales de irritación para cada condición se calcularon utilizando la siguiente ecuación:

Análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. El análisis de datos se realizó utilizando un análisis de varianza de una vía seguido de la prueba de diferencia mínima significativa. Los datos se analizaron utilizando el software SPSS versión 19.0 (IBM SPSS, Armonk, NY, EE. UU.). PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultados y discusión

Detección de aceites, tensioactivos y co-tensioactivos para ME. PG(glucósido feniletanoide de cistanche)fue casi insoluble en parafina líquida y ácido oleico, pero se observó una solubilidad moderada en IPM (Tabla II). IPM aumenta el coeficiente de difusión en la piel y da como resultado el aumento del coeficiente de permeación (17,18). Además, IPM se selecciona comúnmente para la preparación de ME debido a sus conocidas propiedades de mejora de la permeación y biocompatibilidad. La selección de surfactantes es crítica para la formulación exitosa de ME, ya que contribuye a la reducción de la tensión interfacial al formar una película en la interfaz agua-aceite (19). En el presente estudio, PG mostró una mayor solubilidad en Cremophor-EL (40,193 mg/ml; Tabla II) en comparación con Tween-80 (28,051 mg/ml; Tabla II). Por lo tanto, se seleccionó CremophorEL para su uso en estudios posteriores debido a su perfil de solubilidad y su bajo nivel de toxicidad como tensioactivo no iónico. Además, su solución acuosa demostró buena solubilidad de PG. La mayor solubilidad de PG entre los cosurfactantes se observó en propilenglicol (48,714 mg/ml; Tabla II). Además, el propilenglicol tiene la capacidad de formar ME con IPM y CremophorEL. En conjunto, IPM, CremophorEL y propilenglicol se utilizaron como fase oleosa, tensioactivo y cotensioactivo, respectivamente, para la formulación de ME cargados con PG. Construcción de diagramas de fase pseudo-ternarios. En el presente estudio, se construyeron diagramas de fase para seleccionar el rango de concentración de componentes para las microemulsiones, y las áreas marcadas indican la región O/WME clara (Fig. 1). Anteriormente se informó una estrecha relación entre el efecto de hidratación del estrato córneo y la permeación dérmica (20), y la actividad termodinámica de los fármacos en los EM fue una fuerza impulsora significativa detrás de la liberación y penetración de los fármacos en la piel (20,21 ). Se demostró que la actividad termodinámica de los fármacos en la EM con un contenido más bajo de mezcla de surfactantes es una fuerza impulsora importante para la liberación y penetración del fármaco en la piel (22,23).

The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2:8 estaban turbios e inestables (Fig. 2).

Las composiciones finales de ME1‑5 se enumeran en la Tabla I. Preparación y caracterización de ME. Las propiedades físicas de ME1-5 se enumeran en la Tabla III. Los sistemas dispersos eran macroscópicamente idénticos, homogéneos y transparentes, sin precipitados. Los tamaños medios de las gotas de estos ME oscilaron entre 30,56 y 79,21 nm (Fig. 3; Tabla III), con valores de índice de polidispersidad que oscilaron entre 0,187 y 0,321 (Cuadro III). Esto indicó un ME uniforme con una distribución de tamaño estrecha. Además, el tamaño de las gotas aumentó en proporción con el contenido de aceite pero disminuyó con el contenido de la mezcla de tensioactivos. Este fenómeno puede atribuirse a la expansión del núcleo de aceite ME y la alta concentración de surfactante que reduce con fuerza la tensión interfacial aceite-agua para reducir el tamaño de las gotas. Además, la viscosidad ME se elevó como resultado del aumento del nivel de tensioactivo y la disminución del agua. Los valores de pH de todos los ME se encontraban dentro del intervalo apropiado de 5,0-7,5 (Tabla III) y, por lo tanto, eran compatibles con los de los tejidos de la piel. En cuanto a la estabilidad física, no se observó separación de fases, rotura o precipitación de fármacos en ninguno de los ME probados, lo que indica que los ME poseían una estabilidad termodinámica satisfactoria frente a la centrifugación. La prueba de solubilidad del colorante reveló que un colorante soluble en agua (naranja de metilo) se distribuía uniformemente por todo el sistema ME, lo que implicaba que el ME formado era del tipo O/W (datos no mostrados). Las micrografías revelaron gotas individuales de ME5 separadas con un contorno esférico (Fig. 4). Estudio de permeación cutánea exvivo. Los perfiles de permeación de todos los vehículos probados siguieron una cinética de liberación de orden cero (26,27) y ME5 proporcionó el mayor flujo transdérmico de PG (86.795±0.23 µg/cm{{28 }} /h-1; Fig. 5; Tabla III). En el presente estudio, se determinaron los efectos del contenido de aceite y la mezcla de surfactantes en la penetración de PG en la piel. Los resultados indicaron que los tensioactivos mejoran la penetración de la piel al aumentar la fluidez de la membrana, la solubilización del fármaco y la extracción de lípidos del estrato córneo. La tasa de permeación de ME5 (86.795±0.23µg/cm-2 /h-1) aumentó significativamente en comparación con las tasas de permeación de ME1 (69.57±{ {48}}.78, P=0.0094), ME2 (44.326±0.84, P{{50}} .0052), ME3 (79,859±0,12, P=0,039) y ME4 (58,332±0,39 µg/cm-2 /h-1 , P=0.0063, Fig. 5; Tabla III) Esto fue consistente con los resultados de un estudio previo, en el cual la actividad termodinámica de la carga de fármaco ME puede disminuir con el aumento de los niveles de surfactante (12,28 ). La viscosidad de ME5 (30.43±0.12 mPa.s) fue menor en comparación con los otros ME1 (80.51±0.87 mPa.s, P=0.0076), ME2 (47.52±0.54 mPa.s, P{{88 }}.0089), ME3 (60.49±1.34 mPa.s, P=0.0094) y ME4 (43.27±0.21 mPa.s, P=0.0059).