PARTE Ⅰ: Efectos de las condiciones ambientales en el número de nefronas
Mar 20, 2022
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PARTE Ⅰ: Efectos de las condiciones ambientales en el número de nefronas: modelado de enfermedades maternas y regulación epigenética en el desarrollo renal
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & et al.
1. Introducción
El desarrollo fetal se ve afectado por el entorno del útero, y un entorno adverso puede predisponer a enfermedades como la hipertensión, las enfermedades cardiovasculares y la enfermedad renal crónica más adelante en la vida [1-4]. Una variedad de alteraciones intrauterinas puede dar como resultado una reducción en la dotación de nefronas y compromiso de la función renal en la descendencia. En roedores, las condiciones que conducen a un número reducido de nefronas al nacer incluyen restricción del crecimiento intrauterino (RCIU), dieta materna baja en proteínas, medicamentos (incluidos corticosteroides o antiinflamatorios no esteroideos), mutaciones monogenéticas y niveles bajos de vitamina A, así como diabetes materna. y deficiencia de hierro [5-10]. En humanos, actualmente no existe un método no invasivo para medir el número de nefronas. Sin embargo, los estudios postmortales han demostrado una correlación negativa entre el número de nefronas y la presión arterial [4,11]. Además, se sabe que las afecciones intrauterinas asociadas con un número reducido de nefronas, como la RCIU, están asociadas con mayores tasas de hipertensión y ERC [12].
Los experimentos in vivo en los que se inducen artificialmente condiciones intrauterinas adversas en animales preñados han resultado invaluables para la detección y descripción de las alteraciones renales inducidas en la descendencia. Sin embargo, cualquier intervención experimental durante la gestación da como resultado alteraciones complejas en la fisiología materna, placentaria y fetal que pueden afectar el entorno de los metanefroi en desarrollo. Las técnicas de modelado ex vivo evitan esto al permitir la investigación del desarrollo renal completamente separada de la influencia del animal madre, la placenta u otros órganos del feto. Trowell realizó inicialmente cultivos aislados de metanefroi en una interfaz de medio aire en 1950 [13] y posteriormente se refinaron mediante el cultivo de riñones en membranas de filtro [14], proporcionando una base para condiciones de cultivo de una sola variable.
En resumen, existe un creciente cuerpo de evidencia que sugiere que las agresiones prenatales asociadas con un bajo número de nefronas son relevantes para los factores de riesgo de hipertensión y ERC. Para desarrollar estrategias preventivas que aseguren una dotación adecuada de nefronas al nacer, es necesaria una comprensión mecánica de los factores que influyen en el desarrollo renal y la nefrogénesis. En el presente trabajo, el cultivo de órganos metanéfricos se usó para modelar diferentes aspectos de la regulación ambiental para estudiar sus efectos sobre el crecimiento renal y las posibles implicaciones para la función renal a largo plazo y se usó para detectar reguladores epigenéticos usando compuestos pequeños aprobados por la FDA.
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2. Resultados
2.1. Uso de cultivos de órganos metanéfricos para estudiar el efecto de las condiciones ambientales en el desarrollo renal
Para modelar condiciones ambientales adversas, se cultivaron riñones de embriones de día embrionario (E) 12.5 en la interfaz de medio aire (Figura 1A). Para facilitar la monitorización del desarrollo de nefronas y glomerulares, Six2. Cre y Pod. Se usaron ratones reporteros de doble fluorescencia Cre, respectivamente (Figura 1B, C). Una afección común durante el embarazo es la fiebre, que afecta a más del 10 % de los embarazos durante las primeras 16 semanas de gestación. [15] El calor es un teratógeno bien caracterizado y se ha demostrado que la hipertermia durante el embarazo provoca aborto fetal, retraso del crecimiento, y defectos del desarrollo, como agenesia renal, hipoplasia y bajo peso al nacer en varias especies [16-21]. Para evaluar el impacto de las condiciones hipertérmicas prolongadas en el rango de la fiebre en el crecimiento renal y la formación de nefronas, los riñones se aislaron y mantuvieron a 37 o 40 grados (Figura 1D). Después de 7 días de cultivo, los riñones cultivados a 40 °C eran, en promedio, un 18,36 % más pequeños que sus homólogos cultivados en condiciones fisiológicas (Figura 1E). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el número de glomérulos por riñón entre los grupos (Figura 1F). No obstante, la disminución del crecimiento global de los riñones demuestra un efecto negativo del aumento de la temperatura sobre el crecimiento metanéfrico.
Con un 19 por ciento estimado de mujeres embarazadas que sufren de anemia por deficiencia de hierro [22], la deficiencia de hierro es una de las condiciones más extendidas con el potencial de alterar el desarrollo renal [23]. Los datos in vivo han demostrado que el crecimiento renal, el número glomerular y la captación renal de hierro se reducen durante los embarazos afectados por deficiencia de hierro materna [24]. Para evaluar el impacto de la reducción del suministro de hierro unido a la transferrina en el crecimiento renal y la nefrogénesis, los explantes se cultivaron en un medio que contenía 50 ug/mL de holotransferrina saturada de hierro o 50 ug/mL de apotransferrina empobrecida en hierro. respectivamente. Los riñones con restricción de hierro permanecieron mucho más pequeños que sus contrapartes con suficiente hierro y mostraron una mayor apoptosis en las yemas ureterales y una ramificación y proliferación reducidas de las yemas ureterales (Figura 1G, Figura complementaria S1A-F). Si bien la población de nefronas no se vio afectada morfológicamente, se pudo observar una disminución en la parte distal en desarrollo de la nefrona, así como en los túbulos distales (Figura 1H, I, Figura complementaria S1G-J). Los riñones con deficiencia de hierro tenían, en promedio, un 47,9 % del tamaño de sus homólogos cultivados con holotransferrina (Figura 1) y mostraron una reducción en el número total de glomérulos por riñón del 69,9 % después de 7 días en cultivo (Figura 1K) . Por lo tanto, la depleción de hierro por la apotransferrina mostró efectos severos sobre el crecimiento renal con un fenotipo de nefrogénesis totalmente proximal.
Figura 1. Uso de cultivos de órganos metanéfricos para estudiar el efecto de las condiciones ambientales en el desarrollo renal.(A) La cresta urogenital de embriones de ratón E12.5 (panel izquierdo) se extrajo microquirúrgicamente (segundo panel) y los riñones se aislaron (tercer panel) y se colocaron en insertos Transwell (panel derecho). Barras de escala∶ 1 mm (panel izquierdo), 500 μm (tercer panel). (B) Se usaron ratones transgénicos con expresión dual Tomato/EGFP para el marcaje condicional de células Six2-positivas y su descendencia usando Six2. Células positivas para podocina Cre o (C) utilizando Pod. Cre ratones. (D) Se cultivaron explantes del mismo embrión durante 7 días a 37 o 40 grados. Barras de escala∶ 500 μm. (E) Áreas de superficie de explantes cultivados durante 7 días a 37 o 40 grados .n=40 pares, prueba t pareada, media ± SD.(F) El número de glomérulos en los grupos de explantes después de 7 días.n{{ 17}} pares, prueba t pareada, media ± DE. (G) Se cultivaron explantes del mismo embrión durante 7 días en un medio que contenía holo-Tf o apo-Tf. Barras de escala∶ 500 μm. (H) Las imágenes de campo amplio de un par de explantes cultivados de holo-Tf y apo-Tf teñidos contra SIX2 y E-cadherina después de 48 h de cultivo muestran un grupo de células progenitoras normales y defectos en la morfología temprana de la nefrona. Barra de escala∶100 μm. (I) Imágenes de campo amplio de un par de explantes cultivados con holo-Tf y apo-Tf teñidos contra WT1 y JAG1. Barras de escala∶100 μm. （） Áreas de superficie de explantes cultivados con holo-Tf y apo-Tf después de 7 días.n=30 pares, prueba t pareada, media ± SD.(K) Número de glomérulos en los grupos de explantes después de 7 días.n =17 pares, prueba t pareada, media ± SD.
2.2. La exposición alta a la glucosa Ex Vio conduce a cambios asociados con la nefropatía diabética en el riñón en desarrollo
La diabetes materna es otra condición común durante el embarazo, con una prevalencia global de hiperglucemia en el embarazo de ~17 por ciento y más de 20 millones de nacidos vivos cada año [25]. Se ha demostrado que la diabetes inducida en modelos de ratones y ratas conduce a una descendencia con un número de nefronas más bajo [10,26,27]. El cultivo de órganos metanéfricos se ha utilizado antes para estudiar el efecto de la glucosa alta en el desarrollo renal [27-29]. Anteriormente, informamos una reducción en el tamaño, el número de nefronas y la metilación del ADN en condiciones de glucosa alta de 55 mM [30]. En contraste con los datos publicados [28], no se pudo observar ningún efecto sobre el tamaño del explante o el número glomerular en nuestras muestras cuando se cultivaron en diferentes medios de glucosa 30 mM en comparación con las condiciones de control de 5 mM después de 7 días (Figura complementaria S2A, B). Además, no se pudo detectar ninguna disminución en la metilación del ADN en LINE-1 y los principales sitios satélite (Figura complementaria S2C, D). El efecto de glucosa alta 55 mM en el desarrollo renal después de un período de cultivo de 7- días se analizó más, mostrando una disminución en la tasa de crecimiento a partir del día 3 en cultivo (Figura 2A, B). Las tinciones de inmunofluorescencia no mostraron defectos morfológicos del grupo de células progenitoras positivas SIX2- (Figura 2C), pero mostraron una tinción reducida del marcador de podocitos podocalyxin (PODXL, Figura 2D). Se encontró que los glomérulos contenían una matriz basal glomerular engrosada visible en las tinciones histológicas (Figura 2E). Se hicieron hallazgos similares en microscopía electrónica, mostrando un aumento en el grosor de la membrana basal glomerular (Figura 2F), uno de los primeros marcadores de prediabetes y nefropatía diabética (ND) [31,32], en cinco de seis riñones y ninguno de siete riñones de control de compañeros de camada. Para desentrañar aún más los cambios en el transcriptoma, se realizó un análisis de expresión génica diferencial (DGE) por pares de cultivos de riñón de tres camadas, con un riñón de cada embrión cultivado con glucosa alta y el otro con medio de control y los riñones agrupados para el análisis ( n=3).DGE confirmó la regulación positiva de los componentes de la matriz extracelular como el principal proceso biológico regulado positivamente (Tabla complementaria S1). Los genes regulados negativamente estuvieron involucrados principalmente en la activación de células (inmunes) y la exocitosis / secreción (Tabla complementaria S1). La ontología del fenotipo de los mamíferos indicó una morfología anormal de la corteza renal y del corpúsculo renal debido a la regulación negativa de genes como Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb y Vegfa (Tabla complementaria S1). Se encontró que la expresión renal de varios genes, como Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa y Txnip, que se ha demostrado que están reguladas al alza en la nefropatía diabética [33-36], aumenta en condiciones de hiperglucemia. Para comparar el perfil de expresión génica del cultivo de riñón con alto contenido de glucosa con la DN humana, los datos de la DGE se compararon con datos humanos de glomérulos y túbulos microdiseccionados de biopsias de pacientes con nefropatía diabética del Banco Europeo de ADNc Renal (ERCB). De los 216 genes regulados diferencialmente emparejados después del análisis por lotes, 94 genes se regularon diferencialmente correspondientemente en las fracciones glomerular y/o tubular (Figura 2G). La superposición de nuestro modelo y los genes DN humanos mostró 40 de los 95 genes regulados al alza en los glomérulos y 34 genes en los túbulos (25 genes en común) (Figura 2H). Los genes estaban principalmente involucrados en una organización de matriz extracelular (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) y adhesión celular (ITGBL1, CLDN15). Además, los genes asociados con la diabetes, como TXNIP, SPON2 y PAPPA, estaban regulados al alza. De los 120 genes regulados a la baja de los cultivos de riñón, 22 también estaban regulados a la baja en los glomérulos y 39 también estaban regulados a la baja en los túbulos (16 en común (Figura 2I). Estos genes estaban involucrados en respuesta al estímulo endógeno (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), el desarrollo del epitelio de la nefrona (PTPRO, PODXL, VEGFA) y la regulación positiva de la quimiotaxis de células endoteliales (LGMN, P2RX4, VEGFA). Además, los genes asociados con la diabetes como RASGRP3, SIRPA, GATM y ESM1 se redujeron [ 37-39]. Los genes regulados diferencialmente que no se superponen con los datos de ERCB también reflejaron cambios asociados con la diabetes, como la matriz extracelular (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) o diabetes gestacional (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1) Por lo tanto, el desarrollo renal en condiciones de glucosa alta mostró similitudes notables con la nefropatía diabética en adultos humanos.
Figura 2. La exposición alta a la glucosa ex vivo conduce a cambios asociados con la nefropatía diabética en el riñón en desarrollo.(A) riñones embrionarios de Pod.Cre; Animales de tomate/EGFP cultivados durante 7 días en condiciones de glucosa baja (LG, 5,5 mM -D-glucosa, manitol 55 mM) o glucosa alta (HG, 55 mM -D-glucosa). Barra de escala: 500 um.(B)Área de superficie renal de condiciones HG y LG.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Influencias de la exposición ex vivo a la glucosa alta en la formación de la memoria a largo plazo a través de la metilación del ADN
Para comprender mejor los cambios moleculares mediados por un entorno hiperglucémico, los cultivos de riñón se cultivaron en condiciones de glucosa alta durante 3,5 días y luego se cambiaron a condiciones de glucosa baja durante la misma cantidad de tiempo (Figura 3A). Sorprendentemente, la incubación en condiciones fisiológicas después del período de incubación más corto en medio con alto contenido de glucosa no revirtió la reducción del crecimiento después de 7 días en cultivo con cultivos creciendo al mismo ritmo que bajo el tratamiento continuo con alto contenido de glucosa (Figura 3B). Además, la metilación del ADN mostró hipometilación del elemento LINE-1 y los principales loci satélites (Figura 2C, D), así como una hipermetilación sostenida del ADN del promotor Ppargcla, tanto en condiciones de glucosa alta como inversas (Figura 3E), lo que indica la formación de memoria metabólica a través de la metilación del ADN debido a las condiciones ambientales adversas anteriores como medio de programación fetal.
Figura 3. La exposición alta a la glucosa ex vivo influye en la formación de la memoria a largo plazo a través de la metilación del ADN.(A) Imágenes de riñones embrionarios E12.5 desde el día 0 hasta el día 7 en medio bajo en glucosa (5,5 mM), medio alto en glucosa (55 mM) o medio alto en glucosa durante 3,5 días y reversión a medio bajo en glucosa para los días restantes. Barra de escala: 500 um. (B) Área de superficie renal durante 7 días. Media ± DE. n=36 riñones. LG, tratamiento de glucosa baja; HG, tratamiento de glucosa alta; HG a LG, 3,5 días de tratamiento con glucosa alta y 3,5 días con glucosa baja.***,LG-HG (prueba t no pareada):p=0.0004;**,LG-HG a LG (prueba t pareada ):pags<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4.Ex Vivo Small Compound Screen identifica reguladores epigenéticos del desarrollo renal
Los resultados de este trabajo, así como de trabajos anteriores, sugieren que los mecanismos epigenéticos desempeñan un papel en el desarrollo renal [30, A40-45]. Por lo tanto, queríamos evaluar sistemáticamente el efecto de los moduladores epigenéticos de las diferentes clases de enzimas en el desarrollo renal. Para esto, seleccionamos una biblioteca de 22 compuestos pequeños aprobados por la FDA con actividad inhibitoria demostrada [46-56] (Figura 4A). Utilizando ratones Six2.Cre-reporter para evaluar el desarrollo de nefronas, las estructuras renales se cultivaron durante 3 días con los inhibidores en el medio. El tamaño aumentó con el tiempo en comparación con los órganos de control de compañeros de camada, y se verificó la morfología en busca de anomalías en el desarrollo (Figura 4B). Se pudo demostrar que varios inhibidores interfieren con el desarrollo renal normal ex vivo. El entinostato inhibidor de HDAC, un inhibidor de benzamida histona desacetilasa con una alta afinidad por HDAC1, 2 y 3 [57], mostró una reducción constante del crecimiento y falta de diferenciación y proliferación después de 3 días (Figura 4C). TH39 se desarrolló como un inhibidor selectivo de HDAC8 (IC50 HDAC8 88 nM, 26-veces selectivo frente a HDAC1,28-veces selectivo frente a HDAC6[56]), mostró una inhibición similarmente grave del crecimiento en comparación con los órganos de control de compañeros de camada. Además, los quelantes de hierro y los inhibidores de JmJC deferasirox y deferoxamina mostraron una reducción del crecimiento análoga al medio deficiente en hierro. Además, el inhibidor de SET7/9, ciproheptadina [58,59], mostró una reducción del crecimiento y falta de diferenciación y proliferación en comparación con los riñones de control (Figura 4D), pero también pareció interferir con la señalización de Wnt (Figura complementaria S3). Otros inhibidores de HDAC, HAT, HDM y HMT, y el inhibidor de DNMT 5-azacitidina no mostraron reducción del crecimiento ni anomalías en el desarrollo dentro del marco de tiempo medido (Figura 4A).
Figura 4. La pantalla de compuestos pequeños ex vivo identifica los moduladores del desarrollo renal.(A) La lista de compuestos pequeños, sus dianas epigenéticas y la concentración utilizada muestra una reducción del crecimiento renal con entinostat, TH39, deferasirox, deferoxamina y ciproheptadina en más de o igual a 3 experimentos independientes después de 3 días en cultivo. Los cultivos de control se trataron con DMSO. ***, valor p<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
