Parte Ⅱ Los efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre el rendimiento del crecimiento, la aparición de gota, las comunidades microbianas intestinales y la inmunorregulación en el eje intestino-riñón de los pichones

Resultados

1. Los efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre el rendimiento del crecimiento y la aparición de gota en pichones

La gota surgió cuando los pichones tenían entre 7 y 9 días de edad y alcanzó su punto máximo entre el día 10 y el día 14, después de lo cual la tasa de mortalidad disminuyó gradualmente hasta el final de la tercera semana. La morbilidad de la gota en los grupos alimentados con dietas con 22 por ciento de PC fue considerablemente mayor que la de los grupos con 18 PC durante todo el experimento (P < 0.001), además de lo cual Se observó que la morbilidad relacionada con la gota de gosling disminuyó ligeramente con el aumento de los niveles de CF en la dieta (P=0.062; Figura 1). En la Tabla 3 se muestran los efectos de la fibra dietética en el desempeño del crecimiento de pollitos de 1 a 21 días de edad. No hubo diferencias significativas entre los grupos en BW1, BW21, ADFI y ADG de d 1 a 21. Los pollitos en el grupo 22CP tuvo un FCR más bajo que los del grupo 18CP (P < 0.05). Se muestran los parámetros de función renal correspondientes a los diferentes niveles de PC y FC (tabla 4). En el día 9, el nivel de AU en suero en el grupo de 22CP fue más alto que en el grupo de 18CP (P < 0,001), además se observó que aumentaba con el aumento de los niveles de CF en la dieta (P < 0,001). En particular, los pichones alimentados con dietas con un 22 % de PC y un 7 % de CF mostraron niveles peligrosamente altos de AU (483,28 mmol/L), que estaban por encima del límite superior para las hembras normales (357 mmol/L). De manera similar, las concentraciones séricas de Cr (P=0.041) y las actividades séricas de XOD (P < 0.001) también fueron más altas en el grupo 22CP. No se observaron diferencias en los índices de función renal entre los grupos en el día 18 (P > 0,05).

2. Efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre la morfología, la permeabilidad y las comunidades microbianas del epitelio intestinal en pichones

En el análisis de la microbiota cecal por secuenciación del gen 16Sr RNA (V3 −V4), tras el control de calidad y eliminación de quimeras, se retuvieron 2.263,{{20}}59 etiquetas válidas, con una media de 31.431 etiquetas por muestra , e identificado como de origen bacteriano. Estas secuencias se asignaron a 2459 OTU de especies bacterianas en función de un límite de similitud del 97 por ciento. Una comparación de conjuntos de datos de ARNr 16S bacteriano basada en el análisis de coordenadas principales (PCoA) demostró que la microbiota de los pichones correspondientes a dietas con diferentes niveles de CF no se agruparon por separado de los demás (Figuras 2A y 3A). Sin embargo, se observaron muchas diferencias sutiles entre las comunidades microbianas en pichones alimentados con diferentes niveles de CP y CF en la dieta. Los componentes clave de la biodiversidad, incluida la riqueza, uniformidad y rareza de las especies, se midieron mediante los índices de Shannon, Simpson y Chao1 (Figuras 2B y 3B). En el día 9, las especies observadas y los índices de Chao1 para el grupo de alto CF-22CP aumentaron (P < 0.01) en comparación con los del grupo de bajo CF-22CP. Se muestra la composición general de la microbiota, así como la abundancia relativa promedio a nivel de filo y género en los días 9 y 18 (Figuras 2C y 3C, respectivamente). Entre los grupos, los filos dominantes fueron Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria, mientras que los géneros dominantes fueron Bacteroides, Alistipes y Escherichia-Shigella, Ruminococcus y una bacteria no cultivada en Ruminococcaceae. En el día 9, se incrementó la abundancia de Enterococcus en los grupos de bajo FC (P < 0.05), además de que su abundancia promedio en los grupos de 22CP fue mayor que en los grupos de 18CP (P=0.077; Figura 2D ). Además, la abundancia promedio de Escherichia-Shigella mostró una tendencia decreciente con niveles crecientes de CF, mientras que la de Lactobacillus mostró un aumento (P < 0.01). No hubo diferencias significativas entre las abundancias promedio de Alistipes, Escherichia-Shigella y Lactobacillus en los grupos en el día 18 (Figura 3D). Solo la abundancia promedio de Enterococcus mostró una tendencia creciente en los grupos 22CP en comparación con los grupos 18CP (P=0.097).

También nos centramos en los cambios morfológicos en los tejidos cecales de pichones en diferentes grupos (Figura 4A). En el día 9, la profundidad de la cripta de los pichones alimentados con dietas altas en PC aumentó (P < 0.01), mientras que no se encontraron diferencias morfológicas entre pichones con diferentes niveles de CF (P > {{7} }.05). La altura de las vellosidades y la relación V/C (relación altura de las vellosidades/profundidad de las criptas) en pichones en el día 9 aumentó con niveles crecientes de CF (P < 0.05), pero el nivel de CP en las dietas no ejerció un efecto significativo en pichones en diferentes grupos (P> 0.05). En el día 18, la relación V/C de las vellosidades aumentó con el aumento de los niveles de CF (P < 0,01). Sin embargo, no se observaron diferencias en la altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas en el día 18 entre los grupos experimentales (P > 0,05). Además, las actividades de DAO y los niveles de LPS en suero de los grupos se compararon en los días 9 y 18 (Figura 4B). La actividad de DAO en el grupo de 22CP fue ligeramente mayor que la del grupo de 18CP en el día 9 (P=0.067). El mismo día, los niveles séricos de LPS de pichones aumentaron cuando la PC dietética alcanzó el 22 % (P=00,022), pero disminuyeron al aumentar los niveles de CF dietética (P=00,014).

3. Efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre la función inmunitaria circulante en pichones

Se muestran los efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre la función inmunitaria circulante en pichones (Tabla 5). Las concentraciones séricas de IgA e IgG en los grupos de CF alta fueron más altas que las de los grupos de CF baja en los días 9 y 18 (P < 0.05) o muy cerca de P {{5 }}.05. Sin embargo, no se observaron diferencias entre las concentraciones de IgM en suero de los grupos experimentales (P > 0.05). En el día 9, los pichones del grupo 22CP tenían concentraciones séricas de CIC más altas que las del grupo 18CP (P < 0.001), mientras que no se encontraron diferencias entre los grupos en el día 18 (P > 0.05). En comparación con los grupos de 18CP, las concentraciones séricas de TNF-a e IL-1b en los grupos de 22CP fueron más altas en el día 9 (P < 0,05). No se encontraron diferencias en los factores inflamatorios séricos entre los grupos en el día 18 (P > 0,05).

4. Efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre la respuesta inflamatoria del eje intestino-riñón en pichones

También medimos los niveles de ARNm de los receptores tipo toll (TLR), la vía de señalización inflamatoria MyD88/NFkB y las citocinas proinflamatorias en los tejidos renales y las amígdalas cecales de pichones alimentados con diferentes dietas (Figura 5). En el día 9, los niveles de expresión de ARNm de TLR2A (P < 0.0{{30}}1), MyD88 (gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88; P {{9 }}.011), NFkB (factor nuclear-kB) (P=0.089) e IL1b (interleucina-1b) (P < 0.001) en el tejido renal del grupo 22CP aumentó , en comparación con los del grupo 18CP. Los niveles de expresión de ARNm de TLR2A (P=0.032), NFkB (P=0.037) e IL1b (P=0.004) en el tejido renal se redujeron con el aumento de los niveles de CF . En el día 18, los cambios en la proteína y la fibra de la dieta tuvieron un impacto relativamente menor en la expresión del ARNm de los TLR y en la vía MyD88/NFkB (P > 0,05). Solo la expresión de ARNm de TLR2A en el tejido renal se reguló a la baja con el aumento de los niveles de CF en la dieta en el día 18 (P <0,05).

En la amígdala cecal de pichones, en el día 9, los niveles de expresión de ARNm de TLR2A (P < 0.05), TLR4 (P=0.083) , NF-kB (P < 0.01), IL1b (P < 0.01) y TNFa (P < 0. 01) en el grupo 22CP estaban regulados al alza, en comparación con los del grupo 18CP. Los niveles de expresión de ARNm de TLR2A (P=0.074) y TNFa (P=0.074) en la amígdala cecal se redujeron ligeramente cuando aumentaron los niveles de CF en la dieta. En el día 18, los niveles de expresión de ARNm de TLR2A (P=0.066), TLR4 (P < 0.05), MyD88 (P=0.05), IL1b (P < 0.01) y TNFa ( P < 0,05) en las amígdalas cecales de los pichones del grupo 22CP estaban regulados al alza en comparación con los del grupo 18CP. Sin embargo, los cambios en la fibra dietética tuvieron un impacto relativamente menor en la expresión del ARNm de los TLR y la vía MyD88/NFkB en el día 18 (P > 0,05).

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Discusión

En la producción de gansos, los científicos siempre se enfocan en aumentar la tasa de supervivencia de los polluelos recién nacidos; algunos informes han indicado que los niveles de proteína y fibra dietética ejercen efectos significativos en el desarrollo y la resistencia a enfermedades de los gansos (Li et al., 2017; Xi et al., 2020a). En este estudio, analizamos la relación entre la gota y los niveles de proteína y fibra en la dieta. Descubrimos que las dietas altas en CP o bajas en CF predisponían a los pichones a la gota. La gota de Gosling está, en la mayoría de los casos, estrechamente relacionada con la lesión renal, en la que la función renal general se evalúa midiendo las concentraciones séricas de UA, Cr, UN y XOD (Xi et al., 2019; Wu et al., 2020). Los resultados del presente estudio indican que las concentraciones séricas de UA y Cr, así como la actividad sérica de XOD en pichones alimentados con una dieta con 22 por ciento de PC, aumentaron en el día 9 de edad. Estos resultados concuerdan con los de estudios previos sobre pollos y gansos (Guo et al., 2005; Xi et al., 2020a). Se sabe que las dietas ricas en proteínas, que aumentan significativamente la producción de AU, inducen daño renal que conduce a la gota. Curiosamente, aunque nuestras dietas altas en CF también aumentaron los niveles séricos de AU en el día 9, no se observaron cambios en las concentraciones séricas de Cr o la actividad XOD. La categorización de los pichones jóvenes como un grupo de alto riesgo de hiperuricemia se atribuye a la falta de urato oxidasa, que oxida el AU poco soluble a alantoína soluble en agua, lo que resulta en la elevación del AU en sangre (Guo et al., 2005). Sin embargo, cabe señalar que el daño renal asociado con la hiperuricemia no es causado directamente por la AU, sino por los radicales libres de superóxido producidos durante la formación de AU por XOD (Lin et al., 2016). Por lo tanto, sostenemos que los niveles de fibra dietética que oscilan entre el 3 y el 7 por ciento pueden no influir en la función renal, a pesar del aumento de los niveles séricos de AU. Además, los índices de función renal entre los grupos no mostraron diferencias en el día 18, lo que puede atribuirse a la maduración gradual de los riñones en los pichones.

La regulación adecuada del valor nutritivo de las dietas de las aves puede mejorar la integridad del tejido intestinal, mantener el equilibrio entre las poblaciones microbianas y un bajo número de cepas potencialmente patógenas, respaldar las respuestas inmunitarias adecuadas y controlar la inflamación, todos los cuales son factores que afectan la resistencia a las enfermedades en las aves jóvenes ( Jha y Mishra, 2021; Luo et al., 2021). En el presente estudio, utilizamos la secuenciación de alto rendimiento de la región V3-V4 de los genes 16S rRNA para investigar los efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre la composición de la microbiota cecal en pichones. El índice de especies observadas refleja el número de especies microbianas, mientras que el índice Chao1 refleja la abundancia de microbiota. En general, una comunidad microbiana intestinal más diversa muestra una homeostasis más fuerte y resistencia a los patógenos (Li et al., 2018b). Nuestros resultados mostraron que los pichones en el grupo con alto contenido de FC alimentados con dietas con un nivel de PC del 22 % tenían especies y valores de Chao1 observados más altos que los del grupo con bajo contenido de CF en el día 9, lo que indica que aumentar los niveles de CF en la dieta puede mejorar la diversidad microbiana e incluso la resistencia a enfermedades. en pichones, alimentados con una dieta alta en PC (Wang et al., 2012). Además, los resultados del presente estudio, que indicaron que Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria eran las principales bacterias en el ciego de los pichones, fueron corroborados por los resultados de Liu et al. (2018). Se ha informado una situación similar en pollos (Yang et al., 2017). Algunos datos anteriores también sugieren que los gansos adultos (5-13 semanas) alimentados con una dieta alta en fibra pueden contener una mayor abundancia de Firmicutes y una menor abundancia de Bacteroides (Liu et al., 2018). En este sentido, las aves jóvenes se diferencian considerablemente de los adultos y tienen un sistema digestivo muy pobre en fibra. En este estudio, cambiar los niveles de CF en la dieta no afectó la abundancia promedio de Firmicutes y Bacteroidetes, aunque los miembros de estos 2 filos son capaces de degradar la fibra de una manera que beneficia al huésped (Matsui et al., 2010). Por lo tanto, se supone que aunque los cambios en la dieta CF solo ejercen un efecto limitado sobre los microorganismos que descomponen la celulosa de los pichones jóvenes, estos cambios pueden afectar a los pichones al excluir patógenos potenciales del intestino (Baughn y Malamy, 2004). Curiosamente, aunque Bacteroides no es un patógeno común, su proliferación parece estar estrechamente relacionada con la aparición de gota tanto en humanos como en aves (Guo et al., 2005; Shao et al., 2017), y los estudios han demostrado que las dietas ricas en proteínas siempre favorecen el crecimiento de Bacteroidetes (Wu et al., 2011). Sin embargo, nuestros resultados no indicaron que la abundancia promedio de Bacteroidetes mostrara una tendencia creciente con niveles crecientes de PC, posiblemente debido al uso de alimentos fermentados en dietas para pichones en este estudio, lo que puede haber aliviado la proliferación de Bacteroidetes causada por alimentos ricos en proteínas. dietas (Xi et al., 2020a). Las proteobacterias fueron el tercer grupo principal de bacterias en la microbiota intestinal de los gansos en este estudio. Este filo incluye una amplia variedad de patógenos, como Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter y muchos otros géneros notables (Rizzatti et al., 2017). Escherichia y Shigella son bacterias gramnegativas con forma de bastón que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Los gansos tienen una menor tolerancia a las infecciones por Escherichia y Shigella. En este estudio, cabe destacar que la abundancia promedio de Escherichia-Shigella mostró una tendencia decreciente con niveles crecientes de CF en ambos días de muestreo, lo que indica que las dietas ricas en CF podrían tener un efecto inhibitorio aparente sobre las bacterias dañinas en los pichones. La cascarilla de arroz fue el principal material fibroso utilizado en nuestras dietas y la capa única de sílice nanoporosa en la superficie del polvo de cascarilla de arroz permitió que la microscopía electrónica de barrido revelara la colonización y la fuerte unión de células bacterianas, lo que puede haber llevado a la supresión de bacterias intestinales dañinas (Nu~nal et al., 2014). Además, datos previos de nuestro estudio revelaron que los pichones con gota generalmente sufren de disbiosis intestinal asociada con la infección por Escherichia-Shigella (Xi et al., 2019). Por lo tanto, los pichones alimentados con dietas ricas en fibra pueden beneficiarse de la reducción de las infecciones por Escherichia-Shigella y la aparición de gota puede aliviarse. Además, era obvio que las dietas ricas en proteínas o bajas en fibra utilizadas en el presente estudio pueden haber facilitado una mayor proliferación de Enterococcus, en donde el efecto de una dieta alta en proteínas continuó hasta el día 18. Se ha demostrado que las dietas altas en PC siempre mejoran la proliferación de Enterococcus. en el intestino del ansarón (Xi et al., 2020a). Sin embargo, se observó un aumento significativo de Enterococcus en los grupos de CF baja en el día 9. Aunque algunos miembros de Enterococcus participan en la descomposición de la fibra, eso no explica el aumento en la abundancia de Enterococcus en pichones alimentados con una dieta baja en CF. Enterococcus es la flora natural que emana del enterón de los gansos y se considera una bacteria indicadora importante del grado de desequilibrio de las bacterias intestinales en la gota de ansarón (Xi et al., 2019, 2020a). Por lo tanto, la proliferación de Enterococcus puede estar asociada con disbiosis intestinal en pichones que ingieren dietas bajas en fibra. Además, también encontramos que la abundancia promedio de Lactobacillus, un probiótico común, aumentó con el aumento de los niveles de CF en el día 9, lo que sugiere que el nivel de fibra dietética, que beneficia la salud gastrointestinal de los pichones, también fue adecuado para aliviar el riesgo de gota (Li et al., 2014) y aumentar la supervivencia de los pichones jóvenes.

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La proteína y la fibra de la dieta no solo afectan la composición de la microbiota, sino que también influyen en la morfología del epitelio intestinal (Macfarlane y Macfarlane, 2011). Los resultados de este estudio mostraron que el aumento adecuado de los niveles de fibra dietética del 3 al 7 por ciento aumentó la altura de las vellosidades, así como la relación V/C, y mejoró el crecimiento de los intestinos de los ansarones, mientras que el aumento del nivel de proteína dietética del 18 al 22 por ciento aumentó la cripta. profundidad. El acortamiento de las vellosidades y el engrosamiento de las criptas pueden deberse a una apoptosis excesiva de las células de las vellosidades debido a una disbiosis intestinal (Li et al., 2018b). Curiosamente, el efecto prebiótico de los niveles apropiados de fibra sobre la morfología del epitelio intestinal se opone al de los niveles altos de proteína. Estudios previos han demostrado que un aumento en la ingesta de proteínas en la dieta provoca un aumento en los precursores de numerosos metabolitos bacterianos, incluidos amoníaco, sulfuro de hidrógeno, aminas, indoles, fenoles y ácidos orgánicos, que ejercen efectos citotóxicos sobre las células epiteliales intestinales en el intestino distal. (Lan et al., 2015). Por el contrario, el efecto prebiótico de CF estimula bacterias beneficiosas, como Lactobacillus, que optimizan la salud gastrointestinal al adherirse a la mucosa intestinal y prevenir el crecimiento de patógenos en la parte distal del intestino, evitando así infecciones intestinales (Jha et al. , 2021). Por lo tanto, un programa nutricional apropiado que equilibre los efectos de la dieta FC y los niveles de proteína puede facilitar el desarrollo de la luz y la pared cecal en pichones

Los gansos adultos muestran sistemas inmunológicos innatos y adquiridos altamente eficientes, mientras que los pichones recién nacidos muestran una susceptibilidad transitoria a las enfermedades infecciosas durante los primeros 10 días de vida. Se han observado patrones similares en otras aves de corral (Jha et al., 2021). Tal susceptibilidad a corto plazo en el ansarón puede estar estrechamente relacionada con la aparición de gota, causada por la activación inmunitaria en el eje intestino-riñón durante la primera semana de vida (Jin et al., 2018; Xi et al., 2020a). En el presente estudio, nos enfocamos en los efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre la activación inmunológica en el eje intestino-riñón. Medimos las concentraciones de inmunoglobulina y encontramos que las concentraciones séricas de IgA e IgG en los grupos con alto contenido de FQ eran más altas que las de los grupos con bajo contenido de FQ tanto en el día 9 como en el día 18. En este estudio, usamos polvo de cáscara de arroz (un subproducto de la molienda del arroz). ) como principal materia prima fibrosa en la dieta, que generalmente contiene de 35 a 45 por ciento de FC, de 74 a 87 por ciento de fibra detergente neutra, de 59 a 69 por ciento de fibra detergente ácida, de 14 a 18 por ciento de hemicelulosa, de 20 a 26 por ciento de lignina y otros constituyentes (Li y Lei, 2019). Estas sustancias fibrosas aumentan la actividad inmunológica, posiblemente al actuar como factores estresantes. Se informó que la relación heterófilos a linfocitos, una medida del estrés, aumentó en todas las aves alimentadas con una gran cantidad de sustancias fibrosas (Huff et al., 2011) Gao et al. (2008). informaron que los pollos de engorde alimentados con una dieta a base de maíz y soja complementada con 2,5 g/kg de pared celular de levadura exhibieron una mayor actividad de lisozima sérica, una mejor morfología intestinal, concentraciones más altas de IgM y concentraciones de sIgA, en comparación con los pollitos del grupo de control. Los CIC macromoleculares consisten en inmunoglobulina polimérica, inmunocomplejos que contienen inmunoglobulina o ambos. Los CIC se encuentran con una frecuencia relativamente alta en el suero de pacientes con enfermedades renales (Van et al., 1988). El presente estudio reveló que las dietas ricas en proteínas aumentaron las concentraciones de CIC en suero en pichones en el día 9, mientras que los niveles de fibra dietética no tuvieron ningún efecto. Estudios previos han demostrado que las dietas ricas en proteínas están implicadas en la lesión renal y la disbiosis intestinal asociada con la aparición de gota (Xi et al., 2020a), lo que sugiere que la activación inmunitaria en el sistema circulatorio puede actuar como un puente entre la lesión renal y disbiosis intestinal.

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Además, observamos que la concentración de LPS en suero en pichones alimentados con una dieta alta en proteínas fue más alta que en pichones alimentados con dietas bajas en proteínas en el día 9. El LPS, de la microbiota intestinal, es reconocido específicamente por TLR4, un receptor de reconocimiento de la Sistema inmune innato. La activación de TLR4 aumenta la expresión de citoquinas proinflamatorias, como IL1b y TNFa, y también activa la vía de señalización de TLR4/MyD88/NFkB en varios tipos de células epiteliales y endoteliales (Desai et al., 2017). Los resultados del estudio actual indican que las dietas ricas en proteínas causaron inflamación intestinal y renal en pichones jóvenes al activar la vía TLR4/MyD88/NFkB, como lo demuestra la regulación al alza de las expresiones de ARNm relevantes (TLR2A, TLR4, MyD88, NFkB, IL1b y TNFa) en tejidos cecales de amígdalas y riñones y aumentos en las concentraciones séricas de citocinas proinflamatorias (TNF-a e IL-1b). Sin embargo, el efecto que ejercen los niveles de CF en la dieta sobre la activación inmunitaria en el eje intestino-riñón es extremadamente complejo. Por un lado, el uso racional de materia prima fibrosa en la dieta puede inhibir efectivamente la proliferación de bacterias intestinales dañinas y, por lo tanto, disminuir la respuesta inmune inflamatoria a las bacterias y sus metabolitos (Nunal et al., 2014). En este estudio, encontramos que las concentraciones séricas de LPS de pichones disminuyeron con el aumento de los niveles de CF en la dieta a los 9 días de edad. Por otro lado, las propias sustancias fibrosas actúan como estresores, aumentando la actividad inmunitaria tanto a nivel enteral como parenteral (Jha y Mishra, 2021). Esto puede verse como un grado de contrapeso. Ciertamente, considerando que los niveles excesivos de fibra en las dietas reducen la digestibilidad y dificultan el crecimiento de las aves de corral (Liu et al., 2018), los criadores de gansos deben controlar estrictamente la proporción de fibra en el alimento a un nivel de FC en la dieta de aproximadamente el 5 % para aumentar la supervivencia. tasa de los pichones.

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Conclusiones

Es necesario determinar los niveles de inclusión de fibra y proteína en las dietas de los gansos para lograr tasas óptimas de supervivencia y beneficios económicos. En este estudio, una dieta con un 18 % de PC junto con un 5 % de CF como combinación óptima en la alimentación de los ansarinos fue eficaz para prevenir la gota de los ansarinos. Descubrimos que las dietas altas en PC ejercen un efecto negativo sobre la aparición de gota, las comunidades microbianas y la inmunorregulación en el eje intestino-riñón de los pichones, mientras que aumentar adecuadamente los niveles de fibra dietética puede ayudar a mantener el equilibrio intestinal, reducir las concentraciones séricas de LPS y aumentar la supervivencia. tasa.

Yumeng Xi 1, Yuanpi Huang y Yue Li 1, Yunmao Huang 2, Junshu Yan 1 y Zhendan Shi 1.

1. Laboratorio clave para la agricultura integrada de cultivos y animales del Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales, Instituto de Cría de Animales, Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu, Nanjing 210014, China;

2. Facultad de Ciencias Animales, Universidad de Agricultura e Ingeniería de Zhongkai, Guangzhou 510000, China.