Parte Ⅰ Identificación y validación de una firma de pares de genes relacionados con la inmunidad para tres cánceres urológicos

Abstracto

Se necesitan biomarcadores confiables para reconocer a los pacientes con cáncer urológico con alto riesgo de recurrencia. En este estudio, construimos una nueva firma de pares de genes relacionados con el sistema inmunitario para predecir simultáneamente la recurrencia de tres cánceres urológicos. Recopilamos 14 perfiles de expresión génica disponibles públicamente, incluidos el cáncer de vejiga, próstata y riñón. Se clasificaron un total de 2700 muestras en el conjunto de entrenamiento (n=1,622) y el conjunto de validación (n=1,078). La firma de 25 pares de genes relacionados con el sistema inmunitario que consta de 41 genes únicos se desarrolló mediante el análisis de regresión del operador de selección y contracción mínima absoluta y el modelo de regresión de Cox. La firma estratificó a los pacientes en grupos de alto y bajo riesgo con una supervivencia libre de recaídas significativamente diferente en el conjunto de metaentrenamiento y sus subpoblaciones, y fue un factor pronóstico independiente de los cánceres urológicos. Esta firma mostró una capacidad sólida en la metavalidación y múltiples cohortes de validación independientes. La respuesta inmunitaria e inflamatoria, la quimiotaxis y la actividad de las citoquinas se enriquecieron con genes relevantes para la firma. Se encontró un nivel de infiltración significativamente mayor de macrófagos M1 en el grupo de alto riesgo frente al grupo de bajo riesgo. En conclusión, nuestra firma es un biomarcador pronóstico prometedor para predecir la supervivencia libre de recaídas en pacientes con cáncer urológico.

Palabras clave

cánceres urológicos; biomarcadores; pares de genes relacionados con la inmunidad; Supervivencia libre de recurrencia; biomarcador pronóstico;Beneficios de la Cistanche.

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Introducción

El cáncer de vejiga, cáncer de próstata y cáncer de riñón son los principales tumores en el sistema urinario, y cada año se diagnostican cerca de 2,4 millones de casos nuevos [1]. El avance de la terapia dirigida y la terapia neoadyuvante ha prolongado la supervivencia de los pacientes [2–4]. Sin embargo, numerosos pacientes sufren recaídas incluso después de una resección quirúrgica completa [5–7], y sus pronósticos aún no son optimistas. Un biomarcador de pronóstico confiable que pudiera identificar a los pacientes con un mayor riesgo de recaída y seleccionar a los pacientes que responden a las terapias sería valioso para el tratamiento de los cánceres urológicos.

Se han identificado firmas de expresión génica para la estratificación de supervivencia del cáncer de vejiga [8, 9], cáncer de próstata [10, 11] y cáncer de riñón [12, 13]. Sin embargo, la mayoría de los biomarcadores no se han trasladado a la práctica clínica debido al ajuste excesivo de los conjuntos de datos de entrenamiento o a la falta de validación suficiente [14]. La oportunidad de desarrollar biomarcadores pronósticos más confiables ha sido brindada por suficientes conjuntos de datos públicos de expresión génica a gran escala [15, 16]. Sin embargo, es un desafío integrar datos derivados de diferentes plataformas. El método tradicional ha dificultado la normalización de diferentes conjuntos de datos, dados los sesgos técnicos y la heterogeneidad biológica de múltiples plataformas [17, 18]. Se han utilizado nuevos métodos basados ​​en la clasificación relativa de los niveles de expresión génica para eliminar el requisito de preprocesamiento de datos y se han obtenido resultados sólidos en muchas aplicaciones [19-21].

Cada vez hay más pruebas que indican que el microambiente inmunitario tumoral se correlaciona con la formación y progresión de los tres principales tumores urológicos [22-24]. Las moléculas del punto de control inmunitario, como la muerte celular programada 1 (PD-1), el ligando 1 de PD-1 (PD-L1) y el antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) , han demostrado una respuesta notable y duradera en el cáncer de vejiga [25, 26], el cáncer de próstata [27, 28] y el cáncer de riñón [29, 30]. Los biomarcadores relacionados con el microambiente inmune del tumor pueden tener el potencial como marcadores de pronóstico de cánceres urológicos.

Como es bien sabido, el cáncer de vejiga, el cáncer de próstata y el cáncer de riñón están estrechamente relacionados desde el punto de vista anatómico y son el resultado de lesiones similares que promueven la formación de tumores [31–33]. Por lo tanto, en este estudio hemos desarrollado una firma basada en pares de genes relacionados con el sistema inmunitario (IRGP) para predecir simultáneamente la recurrencia del cáncer de vejiga, el cáncer de próstata y el cáncer de riñón.

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Materiales y métodos

1. Diseño del estudio y conjuntos de datos

Analizamos exhaustivamente 14 perfiles de expresión génica en tres tumores urológicos de cáncer de vejiga, próstata y riñón, incluidos siete conjuntos de datos de micromatrices y siete conjuntos de datos de RNA-Seq (Figura 1 complementaria). Los números de acceso, las plataformas y los tamaños de muestra de estos perfiles de expresión génica se muestran en la Tabla complementaria 1. Los datos de RNA-Seq se descargaron de UCSC Xena y el Consorcio Internacional del Genoma del Cáncer (ICGC). Los datos de micromatrices se descargaron del Gene Expression Omnibus (GEO). Se utilizaron cohortes de The Cancer Genome Atlas (TCGA) como conjunto de entrenamiento y otros conjuntos de datos se usaron como conjunto de validación. Solo se incluyeron pacientes con información completa de supervivencia. También excluimos a los pacientes que habían recibido radioterapia, terapia neoadyuvante y terapia molecular dirigida en todas las cohortes de entrenamiento independientes. En total, 2.700 casos fueron incluidos en nuestro estudio. Nuestro proyecto fue aprobado por el Comité de Revisión Ética de la Universidad Médica de Chongqing.

2. Procesamiento de datos de expresión génica

Los conjuntos de datos disponibles públicamente de GEO se normalizaron en primer lugar mediante la función normalizeBetweenArrays tal como se implementó en el paquete 'limma' y luego se transformaron aún más en registros. Los métodos de normalización no se utilizaron en las cohortes TCGA e ICGC.

3. Identificación de IRGP específicos para la predicción del pronóstico

Descargamos genes relacionados con el sistema inmunitario (IRG) de la base de datos de ImmPort a la que se accedió el 3/3/2021. 2483 IRG únicos, que constituyen 17 categorías, que incluyen citoquinas, receptores de citoquinas, procesamiento de antígenos, vías de presentación, interleucinas, citotoxicidad de células asesinas naturales, TGFb y miembros de la familia TNF. Solo se eligieron los IRG medidos por todas las plataformas con una desviación absoluta mediana > 0.5 en todos los conjuntos de entrenamiento independientes. La puntuación de cada IRGP se generó mediante comparaciones por pares del nivel de expresión génica en una determinada muestra de perfiles. La puntuación de IRGP se definió como 1 si el nivel de expresión de IRG 1 era mayor que IRG 2; de lo contrario, la puntuación de IRGP se estableció en 0 [34]. Después de eliminar los IRGP con valores constantes en cualquier conjunto de datos individual, los IRGP restantes se analizaron más a fondo.

4. Construcción del índice de pares de genes relacionados con el sistema inmunológico (IRGPI) para la predicción del pronóstico

Los IRGP de pronóstico se seleccionaron en función de los siguientes pasos. En primer lugar, se evaluó la capacidad predictiva de cada IRGP para predecir la supervivencia libre de recaída (SLR) de los pacientes mediante el uso del modelo de regresión de Cox en el conjunto de datos de metaentrenamiento y los IRGP con un valor de p <0.05 fueron seleccionados como marcadores candidatos iniciales. En segundo lugar, se utilizó el análisis del operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) para filtrar aún más algunos IRGP menos informativos. El parámetro de ajuste se determinó mediante el error de generalización esperado estimado a partir de la validación cruzada de 10-veces. Para mejorar la solidez, dividimos aleatoriamente el conjunto de datos de metaentrenamiento completo en nuevos conjuntos de datos de entrenamiento y prueba con una proporción de 2:1 y repetimos el esquema de división aleatoria 30 veces para estabilizar el procedimiento de selección de IRGP. Luego se aplicó el modelo LASSO a los 30 conjuntos de entrenamiento y se seleccionaron aquellos IRGP con una frecuencia > 15. Finalmente, se utilizó el modelo de regresión multivariado de Cox para construir el modelo de predicción basado en IRGP y generar el IRGPI para todas las muestras. Los pacientes se clasificaron en grupos de bajo y alto riesgo inmunológico utilizando el valor medio de IRGPI.

extracto de cistanche

5. Evaluación y validación del IRGPI

The prognostic value of the IRGPI was evaluated in the meta-training and independent training sets and was further verified in the meta-validation and multiple independent validation sets. The log-rank test and time-dependent receiver operating characteristic (ROC) curves were adopted to assess the prognostic accuracy of the IRGPI. We combined IRGPI with clinical factors of age, gender, and tumor stage in multivariate Cox analyses. Age (>60) se transformó en 1, y la edad (<60) was transformed into 0. Stages III and IV were transformed into 1, and stage I and II were transformed into 0.

6. Perfilado de células inmunitarias infiltrantes

CIBERSORT caracteriza la composición de las células inmunitarias mediante el uso de perfiles de expresión génica de tumores en masa [35]. Infirió las proporciones relativas de 22 tipos de células inmunitarias infiltrantes en función de los valores de expresión génica de referencia (LM22) [35]. En este estudio, las proporciones de 22 células inmunitarias infiltrantes se determinaron utilizando el paquete R 'CIBERSORT'. La permanente se fijó en 1,000, y los casos con un valor p de salida CIBERSORT < 0.05 se seleccionaron para un análisis más detallado. Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar las diferencias en los subtipos de células inmunitarias entre los grupos de IRGPI alto y bajo.

7. Análisis de ontología génica (GO)

El paquete R 'clusterProfiler' se utilizó para realizar un análisis de enriquecimiento GO de los genes relacionados con el IRGPI en la cohorte de meta-entrenamiento. El valor p ajustado por BenjaminiHochberg < 0.05 (tasa de descubrimiento falso, FDR) se usó como umbral para determinar la importancia.

8. Construcción y evaluación del nomograma

Se construyó un nomograma para establecer un enfoque cuantitativo para la predicción de RFS en la cohorte de metaentrenamiento en función del IRGPI y los factores clínicos, que se verificó aún más en las cohortes de metavalidación. Se calculó un punto para cada factor y luego se obtuvieron los puntos totales de todos los factores para la estimación de las tasas de SLR a 1, 3, 5 y 10 años. Luego se dibujaron las gráficas de calibración para evaluar la confiabilidad del nomograma.

Cistanche estandarizada

9. Análisis estadístico

Se utilizaron los paquetes R 'survival', 'glmnet', 'sure miner', 'timeROC', 'rms', 'CIBERSORT' y 'clusterProfiler' para construir el modelo de regresión de Cox, el modelo LASSO, la curva de Kaplan-Meier, el tiempo -curva ROC dependiente, nomograma, cálculo de composición de células inmunitarias y análisis GO. La asociación de la puntuación IRGPI con RFS se analizó mediante la prueba de rango logarítmico. Se adoptó el modelo de regresión de Cox para realizar un análisis multivariante de la asociación de IRGPI con RFS. Un valor p bilateral < 0.05 se consideró estadísticamente significativo para todas las pruebas. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando R (versión 4.0.2).

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Biao Xie 1, Kangjie Li 1, Hong Zhang 1, Guichuan Lai 1, Dapeng Li 2, Xiaoni Zhong 1.

1. Departamento de Bioestadística, Escuela de Salud Pública y Gestión, Universidad Médica de Chongqing, Chongqing, China

2. Instituto de Hepatología, Centro Nacional de Investigación Clínica de Enfermedades Infecciosas, Hospital del Tercer Pueblo de Shenzhen, Shenzhen, China