¿Cómo previene el equinacósido la enfermedad de Parkinson?

Contacto: emily.li@wecistanche.com

Parte Ⅰ: Mecanismo de regulación de la autofagia en ratones PD inducidos por MPTP a través de la vía de señalización MTOR por Echinacoside

Resumen:

Objetivo: El presente estudio tuvo como objetivo investigar el efecto deechinacósido(ECH) en indicadores relacionados con la autofagia a través de la vía de señalización mTOR, especialmente el efecto sobre la eliminación del sustrato de autofagia P62 y -sinucleína, los productos patológicos centrales deenfermedad de Parkinson(PD), para proporcionar nuevas estrategias para el tratamiento de la EP (enfermedad de Parkinson). Métodos: Un modelo de ratón de EP subaguda(enfermedad de Parkinson)se estableció mediante la inyección intraperitoneal de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). En primer lugar, se evaluaron los síntomas neuroconductuales en ratones de cada grupo y se midieron los neurotransmisores de monoamina en el cuerpo estriado de cada grupo con una fase líquida de alto rendimiento. Se adoptó la doble tinción de inmunofluorescencia para observar la expresión de tirosina hidroxilasa (TH), -sinucleína y LC3. El microscopio electrónico de transmisión se utilizó para observar los cambios de ultraestructura en la sustancia negra y la formación de autofagosomas. Luego, las expresiones de TH, -sinucleína, Beclin 1, LC3, P62, mTOR y la proteína AKT cadena arriba se detectaron mediante transferencia de Western. Resultados: Cuando se comparó con el grupo modelo, la función neuroconductual mejoró significativamente en elEC (equinacósido)(P < {{0}}.01),="" junto="" con="" una="" mayor="" expresión="" de="" th,="" da="" y="" dopac="" en="" el="" cerebro="" (p="">< 0.01).="" en="">EC (equinacósido)mientras que las expresiones de Beclin 1 y LC3-II aumentaron (P < 0.01), los niveles de expresión de P62 y -sinucleína disminuyeron significativamente (P < 0,01).EC (equinacósido)podría regular al alza el nivel de expresión de la señal de supervivencia p-AKT/AKT y disminuir la expresión de mTOR. Conclusión:EC (equinacósido)podría aumentar la autofagia al inhibir la expresión de mTOR, promoviendo así la eliminación de -sinucleína y la degradación del sustrato de autofagia P62 y ejerciendo el efecto neuroprotector.

Palabras clave: enfermedad de Parkinson, MPTP,echinacósido, -sinucleína, P62, autofagia, mTOR

Cistanche puede tratar la enfermedad de Parkinson

Introducción

Enfermedad de Parkinson (EP)Es una enfermedad neurodegenerativa crónica y progresiva. Una característica patológica típica de la EP(enfermedad de Parkinson)es la formación de cuerpos de Lewy, y la -sinucleína y la ubiquitina son los componentes principales de los cuerpos de Lewy. Cada vez hay más pruebas que muestran que el trastorno de la regulación de la autofagia finalmente conduce a la acumulación de proteínas mal plegadas y orgánulos lesionados.54 La vía de la autofagia-lisosoma no solo puede degradar proteínas que no pueden ser degradadas por la vía de la ubiquitina-proteasoma, sino también la vía puede degradar -sinucleína. Por tanto, la regulación de la autofagia puede proporcionar una nueva estrategia para el tratamiento de la EP (enfermedad de Parkinson). La autofagia es la vía principal para la degradación de los agregados intracelulares, y la quinasa mTOR es un sitio regulador clave para la autofagia. Por lo tanto, es de importancia teórica y práctica dilucidar la relación entre PD(Enfermedad de Parkinson) y autofagia regulada por la vía de señalización mTOR. Dado que la degradación de la -sinucleína depende principalmente del sistema autofagia-lisosomal con la eliminación de las proteínas anormales como objetivo, el desarrollo de fármacos neuroprotectores capaces de regular la autofagia puede proporcionar indicaciones para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. EC (equinacósido) tiene una fórmula molecular de C35 H46 O20. Es el componente principal de los glucósidos feniletanoides de la medicina china Cistanche. Fue aislado por primera vez por Stoll et al de la raíz delEquináceaAngustifolia DC.EC (equinacósido)Tiene una amplia gama de efectos farmacológicos. Tiene efectos antiinflamatorios, antioxidantes, protección nerviosa, mejora del aprendizaje y la memoria, protección hepática, regulación inmunológica y antitumorales. El presente estudio, partiendo de los mecanismos patológicos centrales de la EP(enfermedad de Parkinson), tuvo como objetivo investigar la regulación de los efectos neuroprotectores deEC (equinacósido)en un ratón PD(enfermedad de Parkinson)modelo inducido por MPTP de la vía autofagia-lisosomal.

Materiales y Aparatos

animales de experimentacion

El grupo experimental consistió en 108 ratones macho C57BL/6J con el grado SPF, ocho semanas de edad, con un peso de 20 a 22 g, cuatro ratones por jaula, mantenidos a 22 a 25 grados. Los ratones fueron proporcionados por el Centro de Animales de Laboratorio de Shanghái, Academia de Ciencias de China, alojado en la Universidad de Medicina China de Nanjing, y los animales recibieron atención humanitaria de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud, en la sala de grado SPF con una temperatura de 22– 25 grados, humedad relativa del 55 por ciento y bajo el ritmo circadiano de 12-horas. Los ratones tenían comida y agua libres.

Reactivos principales

MPTP (Sigma Company), anticuerpo monoclonal anti-TH de ratones (Sigma Company), anticuerpo anti-conejo Alexa Fluor 555 (Instituto de Biotecnología de Biyuntian), anticuerpo anti-conejo Alexa Fluor 488 (Instituto de Biotecnología de Biyuntian), HRP -anticuerpo secundario anti-conejo de cabra (Instituto de Biotecnología de Biyuntian), anticuerpo policlonal de sinucleína de conejo (Cell Signaling Technology Company), anticuerpo secundario anti-ratón de cabra HRP (Instituto de Biotecnología de Biyuntian),ECH(equinacósido) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), anticuerpo anti-p-AKT (Ser473) de conejo (Cell Signaling Technology Company), rapamicina (Cell Signaling Technology Company), cloroquina (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), policlonal de conejo Anticuerpo LC3 (Abcam Company), anticuerpo policlonal P62 de conejo (Enzo Life Science Company), anticuerpo monoclonal de actina de ratón (Santa Cruz Company), anticuerpo policlonal Beclin 1 (Abcam Company).

Información de los materiales:

MPTP (America, Sigma Company), anticuerpo monoclonal anti-TH de ratón (America, Sigma Company), anticuerpo policlonal de sinucleína de conejo (America, Cell Signaling Technology Company), anticuerpo secundario HRP-cabra anti-ratón (China, Biyuntian Institute of Biotechnology ),ECH(equinacósido) (China, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), anticuerpo de conejo anti-p-AKT (Ser473) (America, Cell Signaling Technology Company), rapamicina (America, Cell Signaling Technology Company), cloroquina (America, Sigma Company), Wortmannin (America, Sigma Company), anticuerpo policlonal LC3 de conejo (America, Abcam Company), anticuerpo policlonal P62 de conejo (America, Enzo Life Science Company), anticuerpo monoclonal de actina de ratón (America, Santa Cruz Company), anticuerpo policlonal Beclin 1 ( América, Abcam Company).

Tratamiento de equinacósidoenfermedad de Parkinson

Metodos experimentales

Agrupación de animales de experimentación

Los 108 ratones C57BL/6J se dividieron aleatoriamente en seis grupos, con 18 ratones en cada grupo. Los detalles fueron los siguientes: El grupo de control normal (el grupo de solución salina normal, grupo N), el grupo modelo (grupo MPTP, grupo M), elECH(equinacósido) grupo (MPTP másEC (equinacósido), grupo EH), el grupo de autofagia inducida (MPTP más grupo de rapamicina, grupo RA), el grupo de inhibidor de autofagia A (MPTP másEC (equinacósido)más grupo cloroquina, grupo CQ), el grupo B inhibidor de la autofagia (MPTP másEC (equinacósido)más grupo Wortmannin, grupo WO). La dosis de MPTP fue de 30 mg/kg/d, inyectada de forma continua durante 7 días.EC (equinacósido) se administró a razón de 30 mg/kg/día por vía intragástrica9.

Modelado de animales de experimentación y medicación

El grupo N y el grupo EH recibieron solución salina normal yECH(equinacósido) tres días antes del modelado, respectivamente, a siete días después del modelado. Se administraron rapamicina,10 wortmanina,11 y cloroquina durante siete días consecutivos después de la última inyección de MPTP. La dosis de inyección de rapamicina en la vena de la cola se calculó como 2 mg/kg/d. La dosis de inyección intraperitoneal de cloroquina en ratones fue de 50 mg/kg/d. La dosis de inyección de wortmanina en la vena de la cola en ratones fue de 0,7 mg/kg/día (Figura 1 complementaria).

Las observaciones neuroconductuales

Según la literatura,12 con modificaciones menores, el dispositivo de fabricación propia para la prueba del poste era el siguiente: El dispositivo era un tubo fotovoltaico de 55 cm de largo y 1 cm de diámetro con una proyección esférica de 2 cm de diámetro en la parte superior del tubo. dispositivo como punto de conexión para ratones. El dispositivo se cubrió con cinta negra para evitar que los ratones cayeran. Cada ratón se colocó en el punto saliente esférico con la cabeza hacia arriba durante la prueba. Se registró el tiempo desde la parte superior de la barra colocada hasta la cabeza para girar hacia abajo (T-turn) y el tiempo total desde la parte superior de la barra colocada para subir hasta el fondo del tubo para aterrizar (T-total).

La actividad espontánea

La actividad espontánea, también conocida como actividad de campo abierto, es un indicador común para detectar la actividad rara después de la lesión de MPTP.13 En el presente estudio, se adoptó un sistema de análisis de video de experimento de campo abierto. Las operaciones específicas fueron las siguientes: antes del experimento, se colocaron cuatro ratones del mismo grupo en una caja de observación (con una longitud de 25 cm, una anchura de 25 cm y una altura de

25 cm) para adaptarse durante 30 minutos. A continuación, se grabaron en vídeo de forma continua durante 30 minutos. En la ventana de tiempo de observación de 30-minutos, el número de movimientos verticales (Rearing number) se contó por separado en tres intervalos discontinuos de cinco minutos. El sistema de análisis de video analizó automáticamente la trayectoria de las actividades del ratón y obtuvo una distancia total de 30-minutos (Total Distance) como indicador de movimiento horizontal.

El análisis de la marcha

Análisis de la marcha: según la literatura14, se utilizó un dispositivo de análisis de la marcha de elaboración propia. Este dispositivo era el siguiente: Una pasarela de madera (con una longitud de 42 cm, una anchura de

4,5 cm y una altura de 12 cm), un extremo estaba abierto, el otro extremo conducía a la jaula de la ardilla. La jaula de la ardilla estaba cubierta con una tela negra. Se sumergió tinta azul en la planta de los pies del ratón. Luego, el ratón se colocó en el extremo abierto de la pasarela. El ratón se movió naturalmente hacia el final de la jaula de la ardilla que estaba cubierta con tela negra. Se midieron las tres zancadas más largas de las extremidades delanteras y traseras, respectivamente, y se tomaron los valores promedio.

La prueba de Rotarod

El ratón se colocó en un rotarod de velocidad variable, ajustándose la velocidad del rotarod para aumentar de cuatro rondas/minuto a 40 rondas/minuto en cinco minutos. El tiempo desde el comienzo de la rotación del rotarod hasta la caída del ratón desde el rotarod cada vez se registró como latencia hasta la caída. Determinación del contenido de neurotransmisores de monoamina en el cuerpo estriado mediante detección electroquímica por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-ECD)

Muestreo y Tratamiento

Se sacrificó a los ratones, y el cuerpo estriado se separó rápidamente en hielo y se pesó. De acuerdo con la proporción de 1 ml de ácido perclórico al 5 % por 0,1 g de cerebro (peso húmedo), las muestras de cada grupo se colocaron en el vaso que contenía el volumen correspondiente de ácido perclórico y se homogeneizaron en un tubo de suspensión. . El homogeneizado se centrifugó a baja temperatura con 13,000 r/min durante 20 minutos. Se tomó el sobrenadante y se repitió la centrifugación. El sobrenadante se colocó en un refrigerador a baja temperatura para una mayor detección. Las condiciones para HPLC-ECD fueron las siguientes. Se adoptó la cromatografía electroquímica Couloehemlll 5300. Los medios de detección fueron celdas de 5020 y 504 lb, con la columna cromatográfica de MD-150 (3.0*150 mm; 3 um), la fase móvil de MDTM-2, y la sensibilidad de 2uA. El caudal se fijó en 0,6 ml/min, el potencial del electrodo se fijó en 220 mV y la temperatura de la columna se fijó en 30 grados. El volumen de inyección fue de 20 ul (primero diluido diez veces).

Se detectaron los contenidos de los siguientes neurotransmisores Dopamina (DA), ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido vainílico alto (HVA), norepinefrina (NE), {{0}}hidroxitriptamina (5-HT), 5-Ácido hidroxiindolacético (5-HIAA). La tinción inmunofluorescente de TH, -sinucleína, LC3 y p62 Los ratones (n=6 por grupo) fueron sacrificados bajo anestesia profunda (5 por ciento de hidrato de cloral) y perfundidos con 0, 9 por ciento de cloruro de sodio, seguido de paraformaldehído al 4 por ciento a través del ventrículo cardíaco izquierdo. Los cerebros se extrajeron rápidamente y se posfijaron durante 24 horas, luego se transfirieron a solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 30 por ciento de sacarosa a 4 grados C hasta que se hundieron. El tejido se incrustó en parafina y se cortaron secciones coronales (30 µm) a través de la parte compacta de la sustancia negra (SNc; -2,8 a -3,8 mm caudal al bregma) utilizando un micrótomo de trineo. Las secciones se desparafinaron e hidrataron, y la peroxidasa endógena se extinguió con H2O2 al 0,3 por ciento durante 30 minutos. Después de la recuperación del antígeno inducida por calor, los portaobjetos se incubaron con Triton-X100 al 0,5 por ciento y luego con albúmina de suero bovino al 5 por ciento durante 30 minutos cada uno. Luego, las secciones se incubaron con anticuerpos anti- -sinucleína, anticuerpos anti-TH, anticuerpos anti-LC3, anticuerpos anti-p62 y los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes durante la noche a 4 grados C. Después de tres lavados de cinco minutos en PBS , las secciones se incubaron en anticuerpo secundario biotinilado durante una hora, seguido de complejo avidina-biotina durante 30 minutos. La actividad de la peroxidasa se visualizó con 3.3-diaminobencidina.

la detecciónde proteína por Western Blot

Se extrajo la proteína SNc (n {{0}} ratones por grupo), se separó con SDS-PAGE al 12-15 % y se transfirió a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % durante 1,5 horas a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos contra TH, sinucleína, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR y GAPDH a 4 °C durante la noche. . Al día siguiente, las membranas se enjuagaron con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,1 por ciento y se hibridaron con los anticuerpos secundarios correspondientes durante 1,5 horas. Las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada y las bandas inmunorreactivas se analizaron con un software de análisis de imágenes (Gel Doc 1000-UV; Bio-Rad, Richmond, CA) para calcular la densidad óptica de las bandas de -sinucleína y TH normalizadas a GADPH.

Información de anticuerpos: anticuerpo policlonal LC3 de conejo: 1:1000. Anticuerpo policlonal P62 de conejo: 1:1000. Anticuerpo policlonal Beclin 1: 1:1000. Anticuerpo monoclonal anti TH de ratón: 1:1000. Anticuerpo policlonal de sinucleína de conejo: 1:1000.

Observación de la Ultraestructura de la Substantia Nigra por Microscopio Electrónico de Transmisión

Los ratones (n=6 por grupo) fueron sacrificados con hidrato de cloral al 5 por ciento y perfundidos a través del ventrículo izquierdo con PBS helado, seguido de paraformaldehído al 4 por ciento y glutaraldehído al 1 por ciento en PBS. Se extrajeron los cerebros y se fijaron posteriormente en glutaraldehído al 2,5 por ciento a 4 grados C durante seis horas. La SNc se cortó en bloques de aproximadamente 1 mm3 y se fijó en PBS que contenía glutaraldehído al 2,5 por ciento y se conservó a 4 grados C para su posterior procesamiento. Los fragmentos se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1 por ciento en el mismo tampón, se deshidrataron con alcoholes graduados y se incluyeron en Epon 812 (Shell Chemical Co., Houston, TX). Se cortaron secciones ultrafinas (50 nm) con un ultramicrótomo, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se analizaron con un microscopio electrónico de transmisión (Leica TCS SP2CLSM, Centro de Microscopía Electrónica de la Escuela de Medicina, Universidad de Fudan).

Análisis estadístico

Todos los datos de medición en el presente estudio se expresaron en forma de medias ± errores estándar, y el análisis estadístico se procesó con el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). PAGS<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

HAGA CLIC AQUÍ PARA LA PARTE Ⅱ