¿Cómo beneficia el equinacósido de cistanche a los pacientes con enfermedad de Parkinson?

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Parte III.:Mecanismo de regulación de la autofagia en ratones PD inducidos por MPTP a través de la vía de señalización MTOR por equinacósido

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La ocurrencia deEnfermedad de Parkinson(PD) está relacionado con muchos factores, pero los principales mecanismos patológicos parecen centrarse en el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la agregación anormal de proteínas. Todos estos mecanismos están altamente correlacionados con la autofagia.16 Para los organismos vivos, la autofagia juega un papel importante. Desempeña un papel clave en la eliminación de las proteínas mal plegadas, las proteínas anormalmente agregadas y los orgánulos dañados. Se ha informado que la regulación ascendente de la autofagia puede eliminar algunas proteínas relacionadas con la enfermedad en la EP.(Enfermedad de Parkinson), como α-sinucleína, ubiquitina y otras proteínas mal plegadas, reduciendo así la incidencia de EP(Enfermedad de Parkinson). Mientras tanto, los estudios también han señalado que la regulación a la baja de la autofagia puede conducir a disfunción mitocondrial, ruptura mitocondrial, deposición de SNCA / α-sinucleína insoluble y proteínas de ubiquitina.10 Por lo tanto, es importante regular la autofagia para mantener la función normal.

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Los estudios preliminares de nuestro grupo de investigación también confirmaron en estudios Vivo y Vitro queEquinacósidotuvieron un cierto efecto neuroprotector9,20–23 y pueden reducir la expresión de α-sinucleína. Explorar más a fondo el mecanismo específico deEquinacósidoen el aclaramiento de α-sinucleína, realizamos un estudio más profundo sobre el mecanismo neuroprotector de la ECH en la EP inducida por MPTP(Enfermedad de Parkinson) ratones desde la perspectiva de la autofagia. En el presente estudio, los neurocomportadores en ratones de cada grupo fueron evaluados primero. Se encontró que en comparación con el grupo M, el tiempo de escalada de los ratones en el grupo EH fue significativamente más corto, y la latencia para caer y la longitud de zancada de las extremidades anteriores y posteriores se extendieron significativamente. La capacidad de actividad autónoma en ratones en el grupo eh también aumentó significativamente. Los resultados de HPLC mostraron que el contenido de neurotransmisores de monoamina aumentó significativamente en el grupo EH en comparación con el grupo M, especialmente la expresión de DA y DOPAC. Los resultados de Western blot también revelaron que la expresión de TH en la sustancia negra aumentó notablemente en el grupo EH en comparación con el grupo M. Si bien las funciones neuroconductuales anteriores se deterioraron significativamente en el grupo CQ y el grupo WO, el contenido de DA y TH también fue significativamente menor que en el grupo EH, y la mortalidad fue significativamente mayor. Según los resultados del presente estudio, la mortalidad en los grupos inhibidores de la autofagia fue mayor que en los otros grupos. La mortalidad en el grupo de CQ fue del 28%, y la del grupo de WO fue del 12%, mientras que no hubo muertes en los otros grupos. Para verificar el efecto de los inhibidores de la autofagia enEquinacósido, se adoptaron la doble inmunofluorescencia de la TH y la tinción de α-sinucleína, junto con la inmunoblotting proteica de α-sinucleína, para observar la expresión de α-sinucleína. Los resultados confirmaron queEquinacósidoredujo significativamente la expresión de α-sinucleína en comparación con el grupo M. Sin embargo, con la aplicación de inhibidores de la autofagia, la expresión de α-sinucleína aumentó bruscamente. Los estudios han señalado que los efectos tóxicos de MPTP están estrechamente relacionados con la aparición de α-sinucleína porque los ratones del knockout de α-sinucleína muestran un alto grado de tolerancia a la toxicidad de MPTP.24 Esto podría sugerir indirectamente que para el DP inducido por MPTP(Enfermedad de Parkinson) Modelos de ratones, cuanto mayor sea la expresión de α-sinucleína, más fuerte será el efecto tóxico de MPTP en ratones. En el presente estudio, la mortalidad de ratones en el grupo de inhibidores de la autofagia fue significativamente mayor que la de otros grupos, lo que podría estar correlacionado con el aumento de la expresión de α-sinucleína y la disminución de la tolerancia a los efectos tóxicos de MPTP. Por lo tanto, inferimos que el efecto neuroprotector deEquinacósidopodría estar correlacionado con la promoción de la autofagia, y los inhibidores de la autofagia podrían aumentar significativamente la expresión de a-sinucleína, lo que podría estar correlacionado con la muerte de ratones.

Como marcador clave de la autofagia, la cadena ligera 3 de la proteína 1 asociada a microtúbulos (LC3) se usa ampliamente para detectar la aparición de autofagia por inmunofluorescencia o Western blot. P62, también conocido como SQSTM1, está involucrado en la patogénesis de una variedad de enfermedades neurodegenerativas. Puede vincular las proteínas de ubiquitina a LC3 y degradarse a través de la autofagia. El nivel de expresión de proteínas de P62 puede reflejar la finalización del flujo de autofagia.2 Investigar más a fondo el mecanismo de regulación deEquinacósidoen la autofagia inducida por MPTP enPD(Enfermedad de Parkinson) ratones, la expresión de indicadores relacionados con la autofagia como Beclin 1, LC3 y P62 se midieron en ratones de cada grupo. Se encontró que las expresiones de Beclinl y LC3-II. aumentaron significativamente en el grupo M en comparación con el grupo N, junto con un aumento obvio en el número de autofagosomas. Estos sugirieron que el nivel de autofagia en ratones en el grupo M aumentó. Sin embargo, el nivel de P62 no disminuyó con el aumento de la autofagia. En cambio, aumentó significativamente, lo que indica que todo el proceso de autofagia no se completó normalmente. Eso significaba que existía un trastorno de flujo autofágico obvio en el grupo mpTP, que era consistente con los informes en la literatura.26,27 La rapamicina puede aumentar la síntesis de lisosomas y promover el aclaramiento de los autofagosomas. En el presente estudio, se adoptó como control el inductor clásico de autofagia rapamicina como control positivo, y los inhibidores clásicos de la autofagia cloroquina y wortmannina. Se utilizó inmunofluorescencia y Western blot para observar el nivel de expresión de LC3. La expresión de Beclin l se midió mediante Western blot, y la expresión de autofagosomas en cada grupo de ratones se observó mediante un microscopio electrónico de transmisión. Los resultados revelaron que en comparación con el grupo M, las expresiones de Beclinl y LC3-II aumentaron en elEquinacósidogrupo y grupo AR, mientras que los niveles de P62 y α-sinucleína disminuyeron significativamente, lo que indica que en estos dos grupos, el trastorno del flujo autofágico mejoró significativamente que el de la MPTP inducidaPD(Enfermedad de Parkinson)ratón. Las expresiones de Beclin 1, LC3-II y el número de autofagosomas en el grupo WO disminuyeron, acompañados por el aumento de los niveles de P62 y a-sinucleína. Esto se correlacionó con el fracaso del aclaramiento del sustrato de autofagia y los productos patológicos a lo largo del tiempo debido a la inhibición de la autofagia. La expresión de LC3-II y el número de autofagosomas en el grupo CQ aumentaron significativamente, junto con un aumento en los niveles de P62 y a-sinucleína, que se correlacionó con el trastorno del flujo de autofagia.

Se sabe que la quinasa mTOR es un sitio regulador clave para la autofagia, y existe en la célula como dos complejos con diferentes funciones, mTORCl y mTORC2. mTORCl, que es sensible a la rapamicina, es el principal regulador de retroalimentación negativa de la autofagia, mientras que mTORC2, que no es sensible a la rapamicina, puede regular la activación de la proteína quinasa AKT. El AKT activado puede actuar sobre el complejo mTORCl; por lo tanto, AKT puede actuar como el punto de conexión entre mTORC1 y mTORC2.28 A través del presente estudio, se encontró que, al igual que la rapamicina,Equinacósidopodría regular al alza la autofagia inhibiendo la expresión de mTOR y también regulando al alza la expresión de p-AKT/AKT. Especulamos queEquinacósidopodría inhibir la expresión de mTORC1, regulando así la autofagia, logrando el efecto de eliminar la a-sinucleína y P62, y luego activando AKT a través de mTORC2 para promover la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, la cloroquina no es el inhibidor de la inducción de la autofagia dependiente de mTOR y la desfosforilación del regulador, por lo que se evitará en estudios futuros como medio experimental para la inhibición de la autofagia dependiente de mTOR.

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Resumen

En resumen, dirigido a mTOR, el desarrollo de fármacos que puedan aumentar la eficacia clínica y reducir la toxicidad clínica puede ser la dirección de futuras investigaciones.Equinacósidotiene muchas ventajas, como la seguridad, la no toxicidad, los bajos efectos secundarios y el bajo precio. Nuestros experimentos preliminares con animales habían demostrado queEquinacósidopodría inhibir la vía mTOR, aumentar la autofagia y promover la disminución de P62 y la eliminación de productos patológicos como la α-sinucleína. Esto podría traer nuevas estrategias de tratamiento para que la medicina tradicional china intervenga enPD(Enfermedad de Parkinson). Sin embargo, teniendo en cuenta el tamaño insuficiente de la muestra y la ausencia de experimentos celulares relevantes para la verificación, esta sería la dirección de nuestra investigación adicional.

Aprobación ética y consentimiento para participar: Todos los experimentos fueron evaluados y aprobados por el Comité de Ética del Hospital de Medicina China de Nanjing y cumplieron con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (KY2017102).

Agradecimientos: Estamos particularmente agradecidos a todas las personas que nos han dado ayuda con nuestro artículo.

Financiación: Este estudio fue financiado por:1. Subvención del Fondo Especial para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología de la Salud de Nanjing (YKK18134);2. Jiangsu Oficina Provincial de Medicina Tradicional China "Enfermedades Cerebrales de medicina china" Proyecto de cultivo de disciplina clave (NBPY201704)3. La Universidad de Medicina China de Nanjing "Jiangsu University Nursing Advantageous Discipline Construction Project Funding Project" (2019YSHL098);4. Nanjing "Decimotercer Plan Quinquenal"Famoso Doctor en Medicina China (Kong-Jiang Liu) Proyecto de Construcción de Estudio (LKJ-2017-NJ).5. Nanjing"Decimotercer Plan Quinquenal"Famoso Doctor en Medicina China (Jing-Qing Wang)Proyecto de Construcción de Estudio (WJQ-2019-NJ). El organismo de financiación no tuvo ningún papel en el diseño del estudio y la recopilación, el análisis y la interpretación de los datos, ni en la redacción del manuscrito.

Divulgación: Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Referencias

20. Zhao Q, Gao J, Li W, Cai D. Efectos neurotróficos y neurorescate deEquinacósidoen el modelo de ratón MPTP subagudo deEnfermedad de Parkinson.Brain Res. 2010;1346:224–236.

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22. Zhao Q, Yang X, Cai D, et al.Equinacósidoprotege contra la apoptosis neuronal inducida por MPP (+) a través de la regulación de la vía ROS/ATF3/CHOP. Neurosci Bull. 2016;32(4):349–362.

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