Parte Ⅱ: La sobreexpresión de PKD1 causa enfermedad renal poliquística

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Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté y Marie Trudel

Los mecanismos patogénicos subyacentesdominante autosómico poliquistico enfermedad en los riñones(ADPKD) quedan por dilucidar. Si bien hay evidencia de que PKD1 (poliquistosis renal 1) la haploinsuficiencia génica y la pérdida de heterocigosidad pueden causar la formación de quistes en ratones, niveles paradójicamente altos de PKD1 (poliquistosis renal 1) se han detectado en los riñones de pacientes con ADPKD (enfermedad renal poliquística autosómica dominante). Para determinar si PKD1 (poliquistosis renal 1) ganancia de función puede ser un proceso patogénico, un PKD1 (poliquistosis renal 1) cromosoma artificial bacteriano PKD1 (poliquistosis renal 1)-BAC) se modificó mediante recombinación homóloga para dirigirse únicamente a una PKD1 sostenida (poliquistosis renal 1) expresión preferentemente al riñón adulto. Se generaron varias líneas transgénicas que sobreexpresaban específicamente la PKD1 (poliquistosis renal 1) transgén en los riñones 2- para 15-doblar PKD1 (poliquistico enfermedad en los riñones1) niveles endógenos. Todos los ratones transgénicos desarrollaron de manera reproducible quistes tubulares y glomerulares e insuficiencia renal y murieron de insuficiencia renal. Este modelo demuestra que la sobreexpresión de PKD1 de tipo salvaje (poliquistosis renal 1) solo es suficiente para desencadenar una cistogénesis similar a la ADPKD humana (dominante autosómicopoliquistico enfermedad en los riñones). Nuestros resultados también descubrieron un sorprendente aumento de la expresión renal de c-Myc en ratones de todas las líneas transgénicas, lo que indica que c-Myc es un efector crítico in vivo aguas abajo de PKD1 (poliquistosis renal 1) vía molecular. Este estudio no solo produjo un invaluable y primer PKD（poliquistico enfermedad en los riñones） modelo para evaluar la patogénesis molecular y las terapias, pero también proporciona evidencia de que la ganancia de función podría ser un mecanismo patogénico en la PQRAD (poliquistosis renal autosómica dominante).

Cistanche para el tratamiento de la enfermedad renal

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RESULTADOS

Producción de PKD1 (poliquistosis renal 1)-Ac-BAC por recombinación homóloga. Para determinar si PKD1 (poliquistosis renal 1) la ganancia de función por sí sola es suficiente para producir el fenotipo ADPKD (enfermedad renal poliquística autosómica dominante), primero aislamos un clon genómico que contiene la PKD1 completa (poliquistosis renal 1) gen en una biblioteca del vector BAC 129/Sv. Esta biblioteca fue examinada por PCR con dos juegos de cebadores para PKD1 (poliquistosis renal 1) gen que abarcó el exón 1 en el extremo 5' y los exones 39 a 40 hacia el extremo 3' (Fig. 1). Un clon BAC positivo para PKD1 (poliquistosis renal 1) se identificó el gen que incluía todo el cuerpo del gen Tsc2 adyacente. El inserto de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) se caracterizó en detalle para garantizar que la estructura genómica coincidiera con la de la PKD1 endógena (poliquistico enfermedad en los riñones1) gen de la cepa de ratón 129/Sv de la que se derivó el inserto y de la cepa endogámica C57BL/6J. Mapas genómicos de la PKD1 (poliquistosis renal 1) locus en el BAC y en estas cepas endogámicas por análisis de transferencia Southern, con cuatro digestiones con enzimas de restricción y siete sondas que cubren la totalidad de PKD1 (poliquistosis renal 1)gen, parecía idéntico sin evidencia de reordenamientos (Fig. 1). Este BAC contenía una inserción de -121-kb que incluía ~37 kb de flujo ascendente y -39 kb de una secuencia descendente del PKD1 (poliquistico enfermedad en los riñones1) gen determinado por electroforesis y secuenciación.

HIGO. 2.Producción de construcciones SBPkdlrAc y ratones transgénicos. (a) Se llevaron a cabo eventos de recombinación homóloga sucesivos en el Pkdl-BAC murino para introducir dos modificaciones: los elementos reguladores de SB insertados inmediatamente aguas arriba del codón de iniciación de Pkdl y una mutación puntual silenciosa de EcoRI (RI*) introducida en el exón (ex) 10 El vector de recombinación BAC contiene un origen de replicación R6Ky, un gen resistente a la ampicilina, un gen SacB, un gen RecA y un sitio de clonación Smal único en el que se clonaron los elementos reguladores "SB" (o la mutación del punto silencioso del exón 10) con brazos flanqueantes del gen Pkd1. El vector de recombinación de BAC se sometió a electroporación en células de E. coli (DH10B) que contenían el tipo salvaje Pkdl-BAC y, tras la selección, se produjo un primer evento de recombinación homóloga a través de uno de los dos brazos de Pkd1 para producir cointegrados de BAC. El vector de recombinación y las regiones Pkdl duplicadas de los cointegrados BAC se eliminaron en un segundo paso de selección. Los Pkdl-BAC resueltos pueden volver al tipo salvaje o incluir la modificación prevista. Luego se puede introducir una recombinación homóloga posterior en el BAC recién modificado. (b) El ADN ienómico de SBPkd l-etransgenic mxce se analizó mediante transferencia de Southern. orientación de cola a cola y/o de cola a cola. El extremo 5' se analizó mediante digestión de ADN genómico con HindIII y se hibridó con la sonda SB del transgén específico (panel izquierdo). Las tres líneas de ratones transgénicos generaron el 10 esperado. .9-banda kb para la inserción de la cabeza a la cola; la banda adicional observada en la línea 39 muy probablemente representa un fragmento de unión entre SB y el genoma del ratón. La integridad interna del transgén fue monitoreada por varias digestiones con enzimas de restricción, y Se muestra una transferencia representativa de ADN genómico digerido con EcoRI e hibridado con la sonda Pkdl (exón 7-15) (panel central).

Este SBPKD1 (poliquistosis renal 1El clon )-BAC fue modificado por dos eventos de recombinación homóloga sucesivos en E. coli. El gen PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) se marcó en el exón 10 mediante la sustitución de un nucleótido (G por A) para crear un nuevo sitio EcoRI en la posición 2355 en el mapa de ADNc. Esta mutación puntual silenciosa se produjo para distinguir la PKD1 (poliquistosis renal 1) gen y transcrito del BAC a partir del de origen endógeno. Además, hemos sustituido los elementos reguladores 5' del PKD1 (poliquistosis renal 1)-BAC aprovechando los elementos específicos del epitelio renal "SB" previamente identificados del SBM (vinculado a c-Myc) o SBF vinculado a c-fos) construcción-trans-gen para restringir la expresión a los riñones (36, 38)(Fig. 2a).

Este nuevo SBPkdlrAG-BAC se digirió con NotL, un sitio único ubicado inmediatamente aguas arriba de los elementos SB, y ClaI dentro del cuerpo del gen Tsc2, truncando los elementos reguladores de Tsc2 y la mitad 5' del cuerpo del gen para garantizar la falta de T'sc2. expresión exógena en todos los tejidos y para eliminar las secuencias del vector BAC procariótico (Fig. 1 y 2). Este fragmento linealizado NotI-ClaI de 70-kb se aisló y purificó. y cuantificado para microinyección de ovocitos (36).

BENEFICIO CITANCHE: TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RENALES

Producción y análisis de ratones transgénicos SBPkdl-ac. Cuatro fundadores transgénicos que portaban varias copias del transgén SBPkdlrAc desarrollaron constantemente PKD. De los cuatro SBPKD1 (poliquistosis renal 1)Ratones fundadores de RAC determinados por análisis de Southern, tres SBPKD1 (poliquistosis renal 1) Se establecieron líneas transgénicas TAG con dos a nueve copias del transgén (Fig. 2b). La caracterización de la integridad del transgén en estas líneas se controló con sondas 5', internas y 3' como se muestra en los ejemplos representativos de la Fig. 2b. Las líneas transgénicas revelaron con la sonda 5'"SB" una banda de 10,9 kb compatible con SBPkdlrAc el trans-gen se integró en una orientación de cabeza a cola y reveló con la sonda 3' una banda de 7.1-kb (Fig. 2b). Además, la sonda interna detectó la banda endógena de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) de 9.4-kb, así como las bandas de 6.9-kb y 2.5-kb del transgén debido al sitio de inserción de EcoRI en el exón 10 (Fig. 2b). Estos ratones contenían copias completas del transgén basándose en el análisis de la estructura de superposición genómica.

PKD1 (poliquistosis renal 1) ganancia de función en ratones transgénicos SBPkdl-Ac adultos. Expresión de la SBPkdl-AG. transgén y PKD1 (poliquistosis renal 1) se investigó el gen en varios órganos. La cuantificación de los niveles de transcripción del transgén y/o el gen endógeno se llevó a cabo mediante análisis de transferencia Northern (Fig. 3a). Como se esperaba, los transcritos del transgén y del gen endógeno tenían una longitud similar (14,2 kb). Basado en el control de la expresión de GAPDH, los riñones de todas las líneas de ratones SBPkd 1 A habían aumentado consistentemente la expresión de la transcripción en comparación con PKD1 normal (poliquistosis renal 1) niveles en riñones adultos (n=3) de edad similar. La expresión transgénica y endógena renal para las diferentes líneas transgénicas mostró un rango de 2- a 15- veces por encima de la PKD1 endógena renal de control(enfermedad renal poliquística 1)(Fig. 3a). En particular, la línea transgénica 39 (n=4) mostró una PKD1 más alta (poliquistosis renal 1) niveles que las líneas 3 (n=3) y 41 (n=4). Además, PKD1 (poliquistosis renal 1Los niveles de expresión medidos por análisis de transferencia Northern se correlacionaron con los obtenidos por PCR en tiempo real usando cebadores en los exones 1 y 2 (Fig. 3b).

FIG. 3.Análisis de expresión renal de ratones SBPkdlrA. ( a ) Análisis de expresión de los transcritos del transgén (Tg) Pkd1 endógeno (endo) y SBPkdlrA en riñones de tres líneas transgénicas mediante transferencia Northern. Se compararon dos muestras de cada línea transgénica, 3, 39 y 41 con el transcrito renal endógeno de Pkdl de ratones de control normal de la misma edad del mismo fondo genético (C5BI 6I ×CBA/DE, las muestras de ARN de riñón se obtuvieron de ratones transgénicos antes de enfermedad renal en etapa terminal. Las transcripciones de endo y Tg tienen -14.2 kb de longitud. Se observó una sobreexpresión sistemática de las transcripciones en los riñones de todos los ratones transgénicos en relación con los controles no transgénicos. Se utilizó GAPDH como control interno La cuantificación de la expresión renal en estos ratones transgénicos osciló entre 2- y 15- veces en relación con los niveles endógenos de Pkd1 de los ratones de control fijados arbitrariamente en 1. (b) Representación esquemática del transgén SBPkdl-. utilizado para amplificar Pkdl total, incluidos los endógenos y transgénicos (exón 1 y exón 2) y solo el transgén Pkd1 (B. exón 2) mediante PCR en tiempo real y RT-PCR semicuantitativa, el análisis de RT-PCR de la expresión del transgén SBPkdlAc se cuantificó en riñón y adicional tejidos renales. Se muestra una evaluación semicuantitativa representativa del transgén SBPkdl.Ac (Tg) que incluye una muestra de tejido renal (K) de un ratón de las tres líneas transgénicas (3, 39 y 41) y de tejidos extrarrenales. H, corazón; Lu, pulmón; B. cerebro; Li, hígado; y S. spleen de un ratón de la línea 39. La expresión del transgén es fácilmente detectable en los riñones de todos los ratones transgénicos, mientras que es baja o indetectable en los tejidos extrarrenales. La expresión del transgén SBPkd1rAc produjo un amplicón de 307-pb específico, mientras que el control interno S16 generó un amplicón de 102-pb. M,100-marcador pb; H, O, control negativo para amplificación por PCR. ( c ) Análisis de expresión de PCR en tiempo real de SBPkdlr. El transgén se determinó a partir de varios ratones independientes. El transgén SBPkdl.Ac de las tres líneas de ratones transgénicos 3 (n=5), 39 (n =7) y 41 (n=5) mostró que las líneas 39 y 41 tenían la mayor niveles de expresión renal. La expresión del transgén SBPkdlrAc en tejidos extrarrenales de ratones (n=3) de las tres líneas transgénicas se evaluó mediante PCR en tiempo real. En comparación con los riñones de cada línea transgénica (100 por ciento), el análisis de los tejidos extrarrenales mostró que los niveles de expresión transgénica fueron consistentemente más bajos de 10- a 1,000- veces en el cerebro, el corazón, el hígado y el páncreas. , bazo y pulmón. ( d ) Expresión del gen c-mc endógeno en los riñones SBPkdl.Ac mediante RT-PCR semicuantitativa. Una ilustración esquemática muestra los cebadores utilizados para amplificar c-Myc. Como era de esperar, la expresión de c-Myc es mínima en riñones adultos no transgénicos (controles). Por el contrario, se detecta una mayor expresión de c-Mye en todos los riñones adultos SBPkdlrAc de las tres líneas, como se observa en los riñones adultos transgénicos SBM utilizados como un control positivo. El amplicón de c-Myc fue de 250 pb; el amplicón de S16, un control interno, fue de 102 pb.M, 100-pb marcador.

La cuantificación de los niveles de expresión del transgén en concreto se realizó mediante PCR en tiempo real y RT-PCR semicuantitativa en las tres líneas transgénicas en edad adulta utilizando cebadores en la región 5' no traducida (B, -promotor de globina) y en el exón 2 de PKD1 (poliquistosis renal 1)(Fig.3b). El SBPKD1 (poliquistosis renal 1) La expresión de RAC en ratones transgénicos se comparó con el producto del gen de la proteína ribosomal S16 como estándar interno. Las condiciones utilizadas para la amplificación por RT-PCR semicuantitativa estuvieron dentro del rango lineal. La expresión transgénica por PCR en tiempo real y RT-PCR semicuantitativa mostró de manera consistente y específica la expresión más alta en el riñón de todas las líneas transgénicas en relación con otros órganos (Fig. 3b y c). Los niveles de expresión renal para una muestra individual fueron reproducibles con cualquiera de las técnicas de detección utilizadas. Los niveles más altos de PKD1 (poliquistosis renal 1) se midió la expresión renal del transgén para las líneas 39 y 41. Para controlar si el aumento de la expresión de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) se debió al transgén o al gen endógeno, se comparó la PKD1 renal del mismo grupo de ratones de las tres líneas transgénicas ( enfermedad renal poliquística 1) expresión transgénica y para PKD1 renal (enfermedad renal poliquística 1) expresión total (transgénica y endógena) mediante PCR en tiempo real. Curiosamente. las líneas 39 y 41 en relación con la línea 3 mostraron que el aumento de PKD1 (poliquistosis renal 1) la expresión renal del transgén fue similar o superior a la expresión renal total de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1), lo que indica que el transgén es específicamente responsable de esta expresión inducida. En varios órganos (incluidos el corazón, los pulmones, el cerebro, el hígado, el páncreas y el bazo), el SBPKD1 (poliquistosis renal 1) RAC; el transgén mostró una expresión muy débil detectada ocasionalmente en el bazo y el pulmón, con una expresión escasa o indetectable en otros órganos (Fig. 3b). La cuantificación mediante PCR en tiempo real demostró un nivel 10-a 1,000- veces menor de la expresión transgénica en tejidos extrarrenales en relación con la expresión renal (Fig. 3c). Los elementos reguladores "SB" del transgén SBPkdlrAc confirieron expresión renal preferencial; esta distribución particular de órganos también se determinó cuando se usó en transgenes vinculados a c-Myc (SBM) y c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, un efector aguas abajo de PKD1 (poliquistosis renal 1) vías de señalización en SBPkdlrAc: ratones. Para obtener información sobre el mecanismo patogénico intracelular de los ratones transgénicos SBPkdlrAc, a continuación buscamos monitorear el nivel de expresión renal de c-Myc en función de nuestra observación previa de la desregulación de c-Myc en riñones humanos con ADPKD (enfermedad renal poliquística autosómica dominante) (22). El análisis de los riñones se llevó a cabo a partir de las tres líneas transgénicas 3(n=4).39(n=7) y 41 (n =4), así como controles (n {{9 }}). Como se muestra en la Fig. 3d, hay una expresión sustancial de c-Mye endógena inducida en ratones SBPkdlrAa en relación con ratones de control de edad similar. Curiosamente, el nivel de expresión de c-Myc en algunos riñones SBPkdlrAG, en particular la línea 39, alcanzó niveles comparables a los observados en el modelo de ratón transgénico PKD SBM producido por la expresión renal de c-Myc.

Anomalías renales en SBPKD1 (poliquistosis renal 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 para cada línea) desarrollaron múltiples quistes tubulares (T) y glomerulares (G) (Fig. 4d, f y g). Se observaron quistes en los túbulos de las regiones cortical y medular, así como en los túbulos colectores de la papila (Fig. 4d y e). Los ratones transgénicos mostraron hiperplasia epitelial tubular (punta de flecha) que involucraba túbulos quísticos y no quísticos e hipertrofia frecuente (Fig. 4g y h). pero la gravedad varió entre ratones individuales. Se observaron con frecuencia fibrosis intersticial (F), infiltrados linfoides perivasculares y cilindros proteináceos (P) (Fig. 4d y e)

Figura 4

Para definir con mayor precisión el sitio de localización del aumento de PKD1 (poliquistosis renal 1)expresión en los riñones, llevamos a cabo la hibridación in situ usando la sonda del exón 36-45 utilizada anteriormente(16). La señal de hibridación se localizó específicamente en las células epiteliales que revisten el quiste y los túbulos hiperplásicos, así como en los quistes glomerulares. Además, se observó alguna señal sobre el epitelio de los túbulos no quísticos o ligeramente dilatados, lo que probablemente identifique los túbulos predestinados a sufrir futuros cambios quísticos (Fig. 4i y j). El análisis histológico renal también se llevó a cabo en ratones transgénicos al nacer (n=8), día postnatal 10 (P10) (n=3), P20 (n=5), P35 (n{ {10}}), y P45 (n= 3) en comparación con compañeros de camada negativos del mismo grupo de edad (n =2 a 4). Curiosamente, todos los ratones transgénicos recién nacidos mostraron dilatación tubular y glomerular en relación con compañeros de camada negativos de control (Fig. 4k y 1), lo que indica que las anomalías renales se iniciaron en el útero como se observa en ratones SBM y en ADPKD (poliquistosis renal autosómica dominante) pacientes. La dilatación tubular y glomerular aumentó en tamaño y número con la edad progresiva. Para P35, los ratones transgénicos mostraron hiperplasia más severa y evidencia de glomeruloesclerosis Funciones fisiológicas renales alteradas en ratones SBPkdlrsc. Las funciones fisiológicas renales de todos los ratones transgénicos mostraron características similares a las de la PKD, mientras que los compañeros de camada no transgénicos nunca desarrollaron la enfermedad. A los pocos meses del nacimiento, los animales afectados desarrollaron insuficiencia renal crónica. Estos animales fueron controlados en cuanto a los parámetros funcionales renales mediante la medición de los niveles en suero y orina. nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina, osmolalidad urinaria, proteína urinaria y excreción de iones (Tabla 1). Todos los ratones de las tres líneas en comparación con los controles mostraron defectos de concentración, un hallazgo común en ADPKD (poliquistosis renal autosómica dominante). y en consecuencia mostró disminución de BUN urinario. concentraciones de creatinina, proteínas y hierro. SBPKD1 transgénico (poliquistosis renal 1Los fundadores de )rAc y las progenies (n=6) de cada línea se controlaron cualitativamente para detectar proteinuria en muestras de orina mediante SDS-PAGE (Fig. 5). Los ratones mayores de 2 meses mostraron proteinuria no selectiva que progresó con la edad. Además, los niveles de BUN sérico y creatinina sérica estaban elevados, lo que revela insuficiencia renal (Tabla 2). Debido a que la insuficiencia renal crónica conduce comúnmente a alteraciones en los parámetros hematológicos, estos se examinaron en ratones transgénicos SBPkdlAc de 3 a 14 meses de edad (Tabla 2). Estos ratones transgénicos estaban anémicos, como lo demuestra la disminución significativa del recuento de glóbulos rojos, con hemoglobina y hematocrito que alcanzan la mitad de los niveles normales. Otros parámetros de los glóbulos rojos, como el porcentaje de reticulocitos, no se vieron afectados, como era de esperar cuando los indujo un defecto renal. }) para la línea transgénica 39 y en edades posteriores,-14.6± 3.1 meses (n= 20) y-11.7 ±6.5 meses (n=7) ,para las líneas 3 y 41, respectivamente.

EFECTOS DE LA CITANCHE: TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RENALES

DISCUSIÓN

Aquí informamos el aislamiento y la caracterización de un PKD1 murino (poliquistosis renal 1)-BAC. Este PKD1 (poliquistosis renal 1) se marcó el gen y se reemplazaron los elementos reguladores para dirigir la expresión específicamente a los riñones mediante dos eventos de recombinación homóloga sucesivos. Los ratones transgénicos producidos con este nuevo gen SBPkdlrAG mostraron un aumento de 2-a 15- veces en la expresión de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) y desarrollaron alteraciones morfológicas renales tempranas típicas de la PKD de manera reproducible. La insuficiencia renal es evidente en la mediana edad y los ratones mueren prematuramente por insuficiencia renal. Nuestros resultados también indican que el mecanismo de sobreexpresión de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) responsable de este fenotipo está mediado por la señalización de la activación de c-Myc in vivo. Este estudio demuestra que la ganancia de función de PKD1 murino (enfermedad renal poliquística 1) en los riñones es suficiente para producir un fenotipo renal de PKD.

Dado que la PKD1 murina (poliquistosis renal 1) no está duplicado como en humanos (27), hemos identificado y aislado directamente un clon de BAC que contenía el PKD1 completo (poliquistosis renal 1) gen. Caracterización completa de la PKD1 murina 129/Sv (poliquistosis renal 1)-BAC. la comparación indirecta con otras dos cepas de ratones endogámicos confirmó la integridad del locus PKD1 (enfermedad renal poliquística 1). El PKD1 (poliquistosis renal 1)-BACinsert contenía-37 hasta 39 kb de secuencias anteriores y posteriores del gen PKD1 (enfermedad renal poliquística 1). Nuestro análisis demostró que el PKD1 (poliquistosis renal 1) en este BAC era un locus de tipo salvaje murino de buena fe que podría servir para estudios adicionales.

Aunque existe una fuerte evidencia de que la formación de quistes en ADPKD (poliquistosis renal autosómica dominante) puede resultar de la pérdida de heterocigosidad después de la inactivación somática de la PKD1 normal (poliquistosis renal 1) (3.21.32), también hay pruebas que sugieren una expresión sostenida o incluso aumentada de policistina-1 en el epitelio tubular quístico (22.29). La última observación plantea la cuestión de si la sobreexpresión de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) per se es una causa próxima suficiente de cistogénesis. En ratones transgénicos portadores de la PKD1 humana (poliquistosis renal 1), TSC2. RAB26. NTHL1 y SLC9A3R2, solo una minoría de ratones desarrolló quistes y ninguno tenía una expresión transgénica detectable en la edad adulta a pesar de las 30 copias del transgén (31). En esos ratones transgénicos. fue difícil establecer un papel claro para la sobreexpresión de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) en la cistogénesis. Nuestro modelo difiere, ya que de dos a nueve copias de tipo salvaje de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) sola, sin genes contiguos, se integraron en ratones transgénicos. Dado que el gen PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) tiene funciones esenciales en varios órganos o tejidos, como se describe en numerosos ratones con ablación del gen PKD1 (enfermedad renal poliquística 1), una sobreexpresión sistémica de PKD1 (poliquistosis renal 1) podría dar lugar a efectos de confusión adicionales. En consecuencia, hemos abordado el papel de PKD1 (poliquistosis renal 1) ganancia de función utilizando un enfoque que se dirige a PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) específicamente a los riñones. Por recombinación homóloga, primero hemos sustituido la región reguladora corriente arriba de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) con los elementos reguladores restringidos renales "SB", evitando así la disminución de la expresión génica que normalmente se observa para PKD1 (poliquistosis renal 1)en la edad adulta, así como la posible regulación secundaria del circuito de retroalimentación(36,38). En segundo lugar, hemos marcado la PKD1 murina (poliquistosis renal 1) transgén (Pkdlr) con una mutación puntual silenciosa en el exón 10 pero no insertó una etiqueta de epítopo para garantizar que se produciría una proteína de "tipo salvaje" completamente funcional con estructura e integridad conservadas. A partir de este BAC modificado, se purificó un fragmento SBPkdlrAG del gen Tsc2 y del vector BAC para evitar la interferencia del gen Tsc2, que también puede inducir un fenotipo quístico (8.20.28). así como para evitar el efecto inhibitorio de las secuencias procarióticas(5).

Se produjeron cuatro ratones fundadores transgénicos SBPkdlrAc diferentes y tres líneas independientes con PKD1 renal específico (poliquistosis renal 1)-expresión mejorada. Particularmente llamativa es la penetración completa del fenotipo en estos ratones transgénicos. El SBPKD1 (poliquistosis renal 1) El fundador de rAc y las líneas de ratones compartían varias características fisiopatológicas en común con la ADPKD (enfermedad renal poliquística autosómica dominante). Estos incluyen el desarrollo de quistes en la corteza, la médula y los glomérulos junto con hiperplasia epitelial, fibrosis intersticial e inflamación intersticial focal.

Debido a que el fenotipo PKD se observó consistentemente en todos los diferentes ratones fundadores transgénicos y la integración del transgén en el genoma del ratón es un fenómeno aleatorio, el fenotipo no puede resultar del efecto de la posición cromosómica sino solo del aumento de PKD1 (poliquistosis renal 1)expresión. De hecho, se demostró que la expresión del transgén PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) en todas las líneas estaba restringida a nivel renal. como se observó previamente para otros transgenes regulados por los elementos "SB" (36, 38). Además, este aumento de la expresión de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) fue causado por el transgén y no por una PKD1 endógena indirecta (poliquistosis renal 1) activación. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una clara evidencia de que la ganancia de función de una PKD1 funcional de tipo salvaje (enfermedad renal poliquística 1) puede producir múltiples quistes renales. Es importante destacar que estas prácticas de SBPKD1 (enfermedad renal poliquística 1) constituyen el primer modelo de ratón generado por la única sobreexpresión del ortólogo de ratón de la PKD1 humana (poliquistosis renal 1) gen.

Los ratones SBPkdl-Ac demuestran que PKD1 (poliquistosis renal 1La sobreexpresión es un mecanismo patogénico primario de la cistogénesis renal. Es importante destacar que los niveles más altos de expresión transgénica en los riñones parecían estar correlacionados con la progresión y la gravedad del fenotipo. También encontramos que la sobreexpresión de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) en el desarrollo de SBPKD1 (poliquistosis renal 1Es probable que el fenotipo )-Ac señale la activación de c-Myc in vivo. Posiblemente, esta activación podría incluso ser directa a través de la cola C-terminal de policistina-1 que experimenta escisión proteolítica y translocación nuclear (7). Dado que se demostró que la expresión renal mejorada de c-Myc en ratones adultos induce PKD, sería muy consistente para apoyar a c-Myc como un importante efector posterior de PKD1 (poliquistosis renal 1) vías de señalización Este resultado también se correlacionó con nuestros hallazgos previos de aumento de la expresión de c-Myc en los riñones de todos los humanos ADPKD (enfermedad renal poliquística autosómica dominante) analizados (22). En conjunto, estos resultados indican que c-Mye es un mediador principal de PKD1 (poliquistosis renal 1)cistogénesis.

Nuestros resultados del PKD1 (poliquistosis renal 1El modelo de ganancia de función, junto con la haploinsuficiencia murina PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) y la pérdida de función, indican que cualquier PKD1 (poliquistosis renal 1) la desregulación podría conducir a la cistogénesis (2.19.23-26.31.40). Desequilibrio grave de PKD1 (enfermedad renal poliquística 1) en ratones inducido por PKD1 (poliquistosis renal 1) la ablación o la sobreexpresión transgénica provocó la aparición temprana y la rápida progresión de los quistes renales y afectó a una alta proporción de túbulos. Por el contrario, una PKD1 más leve (poliquistosis renal 1) desequilibrio como la haploinsuficiencia condujo a una progresión más lenta de la PKD con más quistes focales. El aparente desarrollo paradójico de un fenotipo similar por medio de la desregulación de la policistina -1 opuesta podría explicarse por el resultado común, a saber, un desequilibrio relativo en la concentración de proteína que podría alterar la formación o la función de un complejo multiproteico de policistina activa. En conjunto, nuestros resultados y los de otros investigadores argumentan que el mecanismo de formación de quistes en ADPKD (poliquistosis renal autosómica dominante) es probable que surja de tres mecanismos patogénicos: ganancia de función, pérdida de función y efectos de dosis génica.

La nueva SBPkdlrAc; los ratones constituyen un poderoso modelo de cistogénesis renal que puede proporcionar información importante sobre la fisiopatología de la PKD, PKD1 (poliquistosis renal 1) vías de transducción de señales y socios que interactúan. El estudio de este modelo también puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para restablecer el equilibrio proteico normal dentro de la PKD1 (poliquistosis renal 1) complejo multimérico.

Cistanche tratar la enfermedad renal y mejorar la función renal

REFERENCIAS

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