PARTE Ⅱ: Papel del fibroblasto renal primario humano en dispositivos que imitan la fibrosis mediada por TGF- 1-

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PARTE Ⅱ: Papel del fibroblasto renal primario humano en dispositivos que imitan la fibrosis mediados por TGF- 1-

Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee y otros.

Resumen

fibrosis renales una enfermedad renal crónica progresiva que finalmente conduce a insuficiencia renal terminal. A pesar de varios enfoques para combatirfibrosis renal, un modelo experimental para evaluar los fármacos actualmente disponibles no es ideal. Desarrollamos modelos de imitación b utilizando dispositivos de cocultivo tridimensionales (3D) diseñados con tres capas separadas de intersticio de túbulos, a saber, capas epiteliales, fibroblásticas y endoteliales. Introdujimos células epiteliales tubulares proximales renales humanas (HK-2), células endoteliales de vena umbilical humana y fibroblastos renales derivados de pacientes, y evaluamos los efectos detfactor de crecimiento transformante - (TGF-)yTGF-tratamiento inhibidor en esterenalfibrosismodelo. La expresión de lafibrosismarcador alfa-actina del músculo liso sobreTGF- 1el tratamiento se aumentó en células HK-2 cultivadas en monocapa en un modelo de enfermedad 3D. En el compartimiento vascular derenalfibrosismodelos, la densidad de los vasos se incrementó y disminuyó en elTGF--grupo tratado yTGF--grupo de tratamiento con inhibidores, respectivamente. ELISA multiplex utilizando sobrenadantes en elTGF-Los modelos 3D estimulantes mostraron que los niveles de citocinas proinflamatorias y factores de crecimiento, incluida la interleucina -1 beta, el factor de necrosis tumoral alfa, el factor de crecimiento de fibroblastos básico yTGF- 1, TGF- 2, yTGF- 3se incrementaron, lo que imitaba los microambientes fibróticos de los riñones humanos. Este estudio puede permitir la construcción de un ser humanorenalfibrosis-Imitar el modelo del dispositivo más allá de los experimentos de cultura tradicional.

Palabras clave: fibroblasto renal; fibrosis; TGF- 1

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3. Discusión

TGF- 1juega un papel importante en la acumulación de matriz en la fibrogénesis renal e inhibe la proliferación en la mayoría de las células, incluidas las células epiteliales y endoteliales glomerulares, así como las células epiteliales tubulares 【1】. Sin embargo, TGF-ß1 induce la proliferación en fibroblastos renales humanos a través de la inducción del factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2) [8].

En el presente estudio, establecimos unfibrosis-dispositivo que imita el uso de tres componentes celulares esenciales, incluidos los fibroblastos renales primarios humanos, las células epiteliales tubulares renales y las células endoteliales humanas y lo evaluó como unrenalfibrosismodelo basado enTGF- 1estímulo. Para generarrenalfibrosis-on-a-chip, establecimos un novedoso sistema de cultivo 3D diseñado con tres partes separadas de tejido, con el objetivo de superar los obstáculos asociados con el modelado de enfermedades renales. Nuestro estudio demostró queTGF- 1respuestas celulares inducidas, incluida la transición epitelial-mesenquimatosa tubular (EMT) de las células epiteliales, la alteración microvascular de las células endoteliales y los cambios de citoquinas en los fibroblastos renales. Este es el primer estudio que introduce unfibrosis-Dispositivo de imitación que comprende fibroblastos primarios derivados de riñones humanos y fibroblastos estimulados aislados de pacientes conTGF- 1, un inductor conocido de respuestas fibróticas generalmente utilizado como estándar para imitarfibrosisen cultivos celulares [9]. Estos resultados sugieren queTGF- 1Las células epiteliales tratadas se convierten en un fenotipo similar a una célula mesenquimatosa. CuandoTGF- 1se administra a los fibroblastos, se alteran varias citoquinas para reflejar la inducción de procesos fibróticos. Es evidente que en elrenalfibrosismodelo, los fibroblastos son la fuerza principal detrás del desarrollo del sistema de cultivo establecido a través de la estimulación TGF.

Davis et al, informaron que el cultivo 3D de células endoteliales es suficiente para que las células invadan y formen una red de luces y tubos, siguiendo un organismo intacto in vivo [10,11]. Varios grupos han informado que los modelos de cultivo 3D exhiben niveles más altos de nefrotoxicidad que los modelos de cultivo celular 2D [12]. Además, la expresión de genes relacionados con la nefrotoxicidad y la inflamación fue significativamente mayor en el modelo de cultivo celular 3D renal que en un cultivo 2D típico [13].

En este estudio, los medios de cultivo de humanosrenalfibrosis-on-a-chip tenía un nivel significativamente más alto de citocinas en comparación con el cultivo 2D. Nuestro grupo ha demostrado que los fibroblastos derivados de pacientes pueden recrear tejidos renales nativos, incluidas las capas de células epiteliales y endoteliales, a través de nuestra propuestafibrosis-modelo en un chip. En consecuencia, estos hallazgos indican que larenalfibrosisEl modelo en un chip simula con precisión el entorno microfísico del riñón humano. Además, debido a que los fibroblastos cultivados en el chip se derivan de pacientes, otros modelos de pacientes clínicamente relevantes se pueden obtener fácil y claramente de manera segura. Por lo tanto, el ser humanorenalfibrosisEl sistema modelo en un chip puede permitir el desarrollo de medicina personalizada con mediciones sensibles de las funciones epiteliales y endoteliales. En nuestros experimentos,fibrosisy la angiogénesis se redujeron en elTGF-grupos tratados con inhibidores. Los inhibidores de TGF- son antagonistas naturales de TGF-, que se han demostrado utilizando varios modelos de enfermedad renal. Parece que es posible realizar experimentos para confirmar la eficacia del tratamiento en modelos de enfermedad usando agentes terapéuticos tales como este inhibidor de TGF. Por lo tanto, este chip ha proporcionado un medio para desarrollar un modelo mejorado de fibrosis renal para medir la morfología y función celular y podría ser útil para realizar evaluaciones de nefrotoxicidad para productos farmacéuticos.

TGF-es el factor profibrótico predominante en varias enfermedades renales [14] y juega un papel en la angiogénesis [15]. Los efectos angiogénicos del TGF- son muy complejos y pueden tener actividad proangiogénica o antiangiogénica según el entorno y varios factores reguladores [16]. Los factores de crecimiento angiogénico como VEGF y FGF-2inducen la angiogénesis in vivo parecen jugar un papel central en la modulación de la angiogénesis in vivo [17-20]. Cierta evidencia indica que estos dos factores pueden actuar sinérgicamente para promover eventos morfogenéticos de células endoteliales [21,22]. Hemos proporcionado evidencia de que la expresión de ARNm de VEGF y la secreción de proteína FGF-2 son significativamente elevadas por TGF- 1 en chips 3D en comparación con el cultivo 2D.

La limitación de nuestrafibrosismodelos podría ser que se crearon en un período de tiempo relativamente corto, 24 h. TGF-beta tiene propiedades pro-fibróticas y antiinflamatorias dentro de una tempranafibrosisproceso, no en el proceso crónico. Convencionalmente,TGF-se ha utilizado principalmente en la inducción de citoquinasfibrosismodelos Sin embargo, dado que solo una citocina no puede representarse in vivo,fibrosismodelos de inducción que utilizan varias sustancias candidatas adicionales, comoTGF-y BMP7 han sido propuestos. Sin embargo, dos o tres citoquinas todavía no son suficientes para reproducirse in vivo. Nosotros usamosTGF-como punto de partida; sin embargo, intentamos implementar un microambiente in vivo en el chip induciendo una tormenta de citoquinas más diversa. Los fibroblastos, un componente celular importante defibrosis, y la estimulación secundaria de citocinas más diversas (IL-1 , TNF- , b-FGF,TGF- 1, TGF-2, yTGF-3) fue inducida en fibroblastos estimulados conTGF-. Así, un entorno similar alfibrosisen el cuerpo humano se reprodujo.

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4. Materiales y Métodos

4.1.Cultivos celulares

Kidney fibroblasts(KFs)were isolated from biopsies of the normal tissue portion of renal cell carcinoma patients with an estimated glomerular filtration rate (eGFR)>60 ml/minuto/1,73 m2 después de que los pacientes hayan dado su consentimiento para una segunda biopsia con fines de investigación. Los KF se cultivaron en un medio de crecimiento de fibroblastos (FGM-2, Lonza, Suiza), y se usaron los pasajes 3 a 4 para los experimentos. Los fibroblastos renales se rasparon del cultivo durante 1-2 semanas hasta que las células formaron una monocapa. Para eliminar las células epiteliales que contaminan el cultivo, los fibroblastos se seleccionaron utilizando microesferas magnéticas antifibroblastos (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, EE. UU.) después del primer pase. Las células se separaron usando 0.05 por ciento de tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Welgene, Gyeongsan, Corea), se incubaron con perlas antifibroblastos y se separaron usando una columna magnética, y el flujo- a través de fue recolectado. Los fibroblastos primarios purificados se caracterizaron mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos antifibroblastos conjugados con PE. El disociador de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) suave se utilizó para la trituración suave del tejido renal. Se adquirió un separador magnético Octo MACSTM con columnas MACS LS (con émbolos) para la purificación de células marcadas con microesferas de Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, EE. UU.). Se usaron tubos suaves MACS C (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, EE. UU.) para triturar los riñones para la separación celular. Los MACS Smart Strainers (70 um) se obtuvieron de Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, EE. UU.). Se usó tampón de columna para lavar las columnas y resuspender los sedimentos celulares. El tampón se preparó como una solución que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 por ciento con EDTA 2 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) y se adquirió de Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, EE. UU.). Se cultivaron células endoteliales de vena umbilical humana que expresan proteína fluorescente verde (GFP-HUVECs, Lonza, Suiza) en medio de crecimiento endotelial (EGM-2, Lonza, Suiza), y se usaron células en los pases 3 a 4. La línea celular tubular proximal humana (riñón humano-2(HK-2) se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC). La línea celular se cultivó en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM) suplementado con 10 por ciento de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 ug/mL). Los reactivos se adquirieron de Gibco (Rockville, MD, EE. UU.). Todas las células se separaron usando 0.05 por ciento de tripsina- EDTA y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 grados y 5 por ciento de CO2. Las KF se resuspendieron en FGM-2 a una concentración celular de 4x10 grados células/mL. Células epiteliales tubulares de riñón humano (HK{{49 }}) se resuspendieron a una concentración de 2 × 10 °C/mL en DMEM con alto contenido de glucosa. Las GFP-HUVEC se resuspendieron a una concentración de 2 × 10 °C/mL en EGM-2.

4.2.Reactivos

La matriz estaba compuesta por geles de fibrina, que incluían fibrinógeno comercialmente disponible de plasma bovino, aprotinina de pulmón bovino y trombina de plasma bovino. Los tres materiales antes mencionados fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). El fibrinógeno se disolvió en 1xPBS en un baño de agua (37 grados) durante 30 min a una concentración de 10 mg/ml. La trombina y la aprotinina se disolvieron en agua desionizada a una concentración de 50 unidades/mL y 4 TIU/mL. Las tres soluciones se esterilizaron filtrando a través de un filtro de 0,22 μm. Humano recombinanteTGF- 1se obtuvo de PeproTech EC Ltd. (Londres, Reino Unido). Se adquirió un inhibidor específico de la quinasa del receptor TGF-beta, SB431542, de Tocris Cookson, Inc. (Ellisville, MO, EE. UU.).

4.3. Patrones de celdas en el dispositivo

Antes de la siembra celular para facilitar la unión estrecha, el dispositivo se trató durante 1 minuto en una máquina de plasma (Femto Science Inc., Suwon, Corea) con una potencia de 70 W, 50 Hz. El tratamiento con plasma indujo la hidrofilia de la superficie y ayudó a facilitar el patrón de gel y la carga de medios. Para evitar cambios en la hidrofilia, los experimentos se realizaron dentro de los 30 minutos posteriores al tratamiento con plasma. Se pueden realizar diferentes patrones celulares dentro de los dispositivos de una manera altamente personalizable. Era importante determinar de antemano la composición y concentración de los diferentes tipos de células que se iban a modelar. Para suspensiones de hidrogel celular, se prepararon 37,5 μL de suspensión celular y una alícuota separada de 12,5 μL de solución de fibrinógeno 10 mg/mL (250 μL de solución de fibrinógeno 10 mg/mL con 40 μL de aprotinina 4 TIU/mL) para mezclar inmediatamente antes de la carga. Inmediatamente antes de la carga, los 37,5 μL de la suspensión celular se mezclaron con 12,5 μL de 10 mg/mL de fibrinógeno hasta que se homogeneizaron. Los 50 ul de hidrogel se mezclaron con una gota de 1 ul de trombina (0,5 unidades/ml). Inmediatamente después de mezclar, se inyectó trombina con una suspensión de fibrina de GFP-HUVEC (concentración celular de 2 x 10' células/mL) en el borde exterior del canal exterior (Figura 3, Gel A). Esperamos 3 minutos para que se completara la reticulación del fibrinógeno. Inmediatamente después de mezclar, se colocó trombina con una suspensión de fibrina de KF (concentración celular de 4x10 grados células/mL) a cada lado del fondo del depósito por pocillo (Figura 3, Gel C). Esta suspensión de fibrina de KF se dejó entrecruzar a temperatura ambiente durante 3 min. Se inyectó una suspensión celular de 10 μL de células epiteliales tubulares proximales renales humanas (HK-2) en el puerto de inyección del canal interno (Figura 3, Gel B). Para unir HK-2 a la pared del gel de fibrina en el canal GFP-HUVECs, el dispositivo se giró 90 grados y se colocó en el 5 por ciento de CO, una incubadora durante 30 min a 37 grados. El HK-2 se asentó y formó una lámina celular en el lado del gel de fibrina.

Después de adjuntar el HK-2, el dispositivo se llenó con EGM-2. El dispositivo se incubó durante 3 días a 37 grados en una incubadora con 5 por ciento de CO2. El medio se cambió con o sin 5ng/mLTGF- 1y con 5ng/mLTGF- 1y 10 umTGF- 1inhibidor después de tres días de incubación (Figura 3).

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4.4. inmunocitofluorescencia

Los tejidos cocultivados en el dispositivo se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4 % (p/v) (Biosesang, Seongnam, Corea) en PBS (Welgene, Gyeongsan, Corea) durante 20 min, seguido de permeabilización con un 20 inmersión mínima en Triton X al 0,15 por ciento-100(Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). A continuación, las muestras se trataron con BSA al 3 por ciento (Sigma, EE. UU.) durante 1 hora. Las células se incubaron con anticuerpos adquiridos de Abcam. Los anticuerpos primarios fueron anti-citoqueratina 8 y anti-o-SMA, se dejaron durante 2 días a temperatura ambiente (TA). Como anticuerpo secundario se usó IgG anti-conejo de burro conjugada con Alexa Fluor 647 (H más L). El marcaje del ADN se realizó con una dilución 1:250 de Hoechst33342 (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) durante 3 h a temperatura ambiente. Las imágenes se recolectaron utilizando un microscopio láser confocal Zeiss LSM 710. La intensidad de fluorescencia media (MFI) se midió utilizando ImageJ y un analizador de intensidad de fluorescencia.

4.5. Análisis Multiplex de Citoquinas

Se utilizó el kit humano MSD V-Plex Cytokine and Angiogenesis Panel 1 (Rockville, MD, EE. UU.) para medir las concentraciones de interleucina-1 beta （IL-1ß） y factor de crecimiento de fibroblastos básico （b-FGF） en muestras individuales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En todas las muestras se evaluaron los niveles de proteína total de IL-1 y b-FGF. La cantidad (en pg/mL) se cuantificó a partir de la curva estándar de cada medición.

4.6. Inmunoensayo de microesferas multiplex

Las concentraciones de citocinas se analizaron utilizando un sistema de inmunoensayo multiplex bead (Procarta Cytokine Assay Kit; Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.), basado en tecnología de multiplexado (xMAP; Luminex, Austin, TX, EE. UU.), según la Instrucciones del fabricante. Los datos se adquirieron utilizando una estación de trabajo compatible con Luminex y su software de gestión (estación de trabajo Bio-Plex y software versión 6.0; Bio-Rad, Tokio, Japón), según las instrucciones del fabricante. TGF- 1, TGF- 2 y TGF- 3 humanos relacionados con elfibrosisproceso fueron analizados simultáneamente en las muestras diluidas. Las isoformas deTGF-fueron detectados usando Bio-Plex 200 Systems y Bio-Plex ProTM Human disponible comercialmenteTGF-ensayos (Bio-Rad Laboratories, Inc); en base a la información proporcionada por el fabricante. El kit de ensayo multiplex puede medir cuantitativamente múltiples citocinas del sobrenadante con un límite inferior de detección de 1 pg/mL por citocina. Cada muestra se ejecutó como una medición única para una cantidad limitada del sobrenadante recolectado.

4.7.PCR en tiempo real

La extracción de ARN se realizó con el reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se usaron Master Mix y un kit de síntesis de ADNc Revert Aid First Strand para la transcripción inversa del ARN total. Las qPCR se realizaron con Applied BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los cebadores específicos fueron preparados por Bioneer (Daejeon, Corea) y se usaron en este experimento de la siguiente manera. Las secuencias de los cebadores se resumen en la Tabla 1.

Se usaron diez microlitros de PowerUp SYBR Green Master Mix, 4 μL de ADNc y 2 pmol de cada cebador para PCR en tiempo real en un volumen final de 20 μL. La reacción se llevó a cabo a 95 grados durante 1 segundo y 60 grados durante 20 segundos durante 45 ciclos después de la desnaturalización a 95 grados durante 20 segundos. La PCR se realizó por duplicado o triplicado para cada muestra. Los niveles de cDNA se determinaron usando una curva estándar de umbrales de ciclo. Todos los datos para cada ADNc estaban dentro de la curva estándar correspondiente. Los datos obtenidos se normalizaron a -actina cDNA.

4.8. Análisis estadístico

Los datos cuantitativos se presentan como media ± SD o SE de al menos tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron usando una prueba t de Student de dos colas. Consideramos una diferencia significativa solo a un nivel de confianza del 95 por ciento o superior (p<>

5. Conclusiones

En resumen, los protocolos de este estudio permitieron la construcción de humanosrenalfibrosis-Imitar dispositivos como modelo y mostró varios efectos que no son posibles en los experimentos de cultivo 2D. Creemos que la estrategia de evaluación propuesta en este estudio conducirá a una mejor comprensión de los detallesfibrosismecanismos implicados en los cambios patológicos duranteenfermedad renal. La fibrosis renal en un chip 3D desarrollada podría usarse como un posible modelo in vitro, lo que nos acercará a la creación de un modelo mejorado de riñón en un chip.

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