Parte 1: El efecto antimaligno de ascitis de los diterpenoides totales de Euphorbiae Ebracteolatae Radix se atribuye a alteraciones de las acuaporinas a través de la inhibición de la actividad de PKC en el riñón
May 18, 2022
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Resumen: Este estudio evaluó el efecto antiascitis de los diterpenoides totales extraídos de Euphorbiae ebracteolato Radix (TDEE) en ratones ascíticos malignos y elucidó su mecanismo subyacente. El TDEE se extrajo con diclorometano y se sometió a cromatografía en columna. Se determinó que la pureza de seis diterpenoides aislados de TDEE era del 77,18 por ciento mediante HPLC. TDEE (3 y 0.6 g de hierbas crudas/kg, po) redujo la ascitis y aumentó la producción de orina. Mientras tanto, el análisis de la viabilidad, el ciclo y la apoptosis de las células tumorales indicó que el TDEE no teníaantitumoralactividad. Además, los niveles de expresión de acuaporinas (AQP) y los niveles de translocación de membrana de proteína quinasa C (PKC) y PKC enriñonesy se midieron las células. TDEE redujo los niveles de AQP1-4 e inhibió la expresión de PKC en la fracción de membrana. Cuatro diterpenoides principales, excepto el compuesto 2, redujeron los niveles de AQP1 en células renales humanas-2. Los compuestos 4 y 5 inhibieron la expresión de AQP2-4 en células del conducto colector de la médula interna murina. La inhibición de la expresión de AQP1-4 inducida por diterpenoides fue bloqueada por acetato de forbol-12-miristato-13- (PMA; agonista de PKC). Los diterpenoides del TDEE son los principales componentes antiascíticos. El efecto antiascítico de los diterpenoides puede estar asociado con alteraciones en los AOP en los riñones para promover la diuresis. La inhibición de la expresión de AOP1-4 por TDEE está relacionada con la inhibición de la activación de PKC.
Palabras clave: Euphorbia ebracteolato Hayata; diuresis; componentes bioactivos; terpenoides; células renales; inhibidor de PKC
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1. Introducción
Euphorbia ebracteolato Hayata (EEH) es un miembro del género Euphorbia en la familia Euphorbiaceae y se usa ampliamente en el tratamiento de distensión y edema abdominal, infección parasitaria, tuberculosis y otras enfermedades en la medicina tradicional china (MTC) [1]. La raíz de EEH (EER) contiene varios terpenoides, que se consideran componentes efectivos. Se han realizado estudios recientes sobre los terpenoides para determinar suantiinflamatorio, antivírico, antituberculosis y otros efectos in vitro [2-5]. Sin embargo, las investigaciones de investigación básica sobre los efectos tradicionales de EER en el tratamiento de la distensión y el edema abdominales son limitadas. De acuerdo con la teoría de la MTC, la EER puede eliminar rápidamente la distensión y el edema abdominales al promover la micción y la diarrea [6]. Nuestros estudios anteriores han demostrado que los diterpenoides totales de EER (TDEE) pueden causar diarrea al regular la expresión de acuaporina (AQP)-1 y AQP3 [7]. Sin embargo, hasta la fecha, las sustancias eficaces de antiascitis en EER siguen sin estar claras.
La distensión abdominal y el edema se describen como ascitis en la medicina moderna. La ascitis es una acumulación patológica de líquido peritoneal [8]. Hay muchas causas de formación de ascitis, como cirrosis, tumor, insuficiencia cardíaca y síndrome nefrótico [9]. La aparición de ascitis está relacionada con la hipertensión portal, que conduce a la vasodilatación arterial esplácnica, la reducción del volumen circulante efectivo, la activación de los sistemas vasoconstrictores endógenos y la retención ávida de agua en los riñones [10]. Las AQP son transportadores rápidos de membrana de agua para cruzar las barreras epiteliales y endoteliales y, por lo tanto, juegan un papel fundamental en el mantenimiento del equilibrio hídrico [11]. Numerosos estudios han demostrado que las AQP desempeñan un papel clave en la formación y el trastorno de la ascitis [12-15]. Hay muchos tipos de AQP en los riñones, como AQP1, AQP2, AQP3 y AQP4[16]. Debido a que TDEE puede regular la expresión de AQP en el intestino [7], proponemos que TDEE se pueda utilizar en el tratamiento de la ascitis mediante la regulación de AQP en los riñones.
Las AQP desempeñan un papel fundamental en la formación de orina; sin embargo, no se han aclarado los mecanismos de regulación de la expresión de las AQP en los riñones. Actualmente, solo un número limitado de informes indican que las AQP están reguladas a través de las vías de la proteína quinasa C (PKC) y la proteína quinasa A (PKA) [17-20]. Algunos terpenoides aislados de Euphorbia (p. ej., uphold e ingenol 3-angelate) tienen efectos reguladores sobre la PKC. TDEE puede regular la expresión de AQP en los riñones mediante la vía PKC.
En este estudio, extrajimos TDEE y evaluamos su efecto antiascítico, así como también analizamos la expresión de AQP, PKC y las actividades de PKA en los riñones de ratones ascíticos. Luego, aislamos y purificamos los principales diterpenoides de TDEE para investigar sus efectos en los niveles de expresión de proteínas y ARNm de AQP en dos tipos decélulas renales(células -2 de riñón humano (HK-2) y células del conducto colector de la médula interna murina (mIMCD3)). Finalmente, elegimos un compuesto diterpenoide (euphebracteolatin A), usando forbol-12-miristato-13-acetato (PMA; agonista de PKC) para activar la vía de PKC, para identificar si la expresión de AQP en los riñones está regulada. por vía PKC. Este estudio tuvo como objetivo determinar el efecto antiascítico de TDEE en EER y proporcionar una base para la aplicación clínica de EER y la identificación de fármacos candidatos para la diuresis y los efectos antiascíticos.
2. Resultados
2.1.Efectos del TDEE sobre el peso del líquido ascítico, el peso de la orina y el contenido de agua fecal
El tratamiento de ratones ascíticos con extracto total de EER (TEER) y TDEE (3 y 0,6 g de hierbas crudas/kg, po) y furosemida (fármaco positivo) redujo significativamente el aumento del peso del líquido ascítico en comparación con el modelo grupo (Figura 1A). La Figura 1C mostró que la orina pesa significativamente (p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">
2.2. Efectos de TDEE en los niveles de albúmina sérica en ratones ascíticos
La albúmina sérica es la proteína más abundante en el plasma de los vertebrados y puede mantener la presión osmótica de la sangre y regular el transporte de agua. La Figura 1B mostró que la producción de ascitis en ratones modelo provocó una disminución significativa de la albúmina sérica en comparación con el grupo normal. Después del tratamiento con furosemida, TEER y TDEE (3 y 0,6 g de hierbas crudas/kg, po), los niveles de albúmina sérica se recuperaron de manera efectiva en comparación con el grupo modelo. No se observó mejora en este índice en los grupos NTDEE.
2.3.Efectos del TDEE sobre la viabilidad, el ciclo y la apoptosis de las células tumorales en ratones ascíticos
En la ascitis maligna, las células tumorales flotan en el líquido ascítico. Evaluamos si la reducción de la ascitis está relacionada con la actividad anticancerígena de TEER y TDEE. Los resultados mostraron que estos fármacos no inhibían la viabilidad de las células tumorales (Figura 2A) y no provocaban la detención del ciclo celular (Figura 2B) ni la apoptosis (Figura 2C, D).
2.4.Efectos de TDEE en la expresión de AQP en los riñones de ratones ascíticos
El riñón es un órgano importante para la reabsorción de agua y la concentración urinaria. Los canales de agua AQP median el transporte rápido de agua en los riñones. Por lo tanto, examinamos la expresión de AQP en los riñones. La figura 3 mostró que el aumento de la ascitis tuvo poco efecto sobre la expresión de AQP en los riñones en comparación con el grupo normal. Cuando se trató con TEER y TDEE, la expresión de las proteínas AQP1, AQP2, AQP3 y AQP4 fue notablemente más baja que en el grupo modelo en la mayoría de las dosis. TEER resultó en una disminución significativa en la expresión de AQP2, AQP3 y AQP4 en dosis de 3.0 y {{10}}.6g de hierbas crudas/kg, mientras que la expresión de AQP1 solo se redujo en una dosis baja (0,6 g de hierbas crudas/kg). En particular, TDEE tuvo los mismos efectos inhibidores sobre la expresión de AQP3 y AQP4 que TEER en dos dosis. La diferencia entre TDEE y TEER es que TDEE inhibió la expresión de AQP1 y AQP2 solo a una dosis alta (3 g de hierbas crudas/kg). NTDEE tuvo efectos débiles en los niveles de AQP en los riñones y solo reguló la expresión de la proteína AQP4 a una dosis de 3g hierbas crudas/kg.
2.5.Efectos del TDEE sobre la activación de PKC y PKA en los riñones de ratones ascíticos
Estudios previos han indicado que la expresión de AQP podría regularse mediante la activación de PKC y PKA. Examinamos los efectos de TDEE en la activación de PKC-a, PKC- y PKA. La activación de PKC se midió por su translocación desde el citosol a la membrana celular. Como se muestra en las Figuras 4A y B, el nivel de expresión de proteína de PKC- en la fracción de membrana disminuyó significativamente en los grupos TDEE, mientras que no hubo un efecto significativo en el nivel de expresión de proteína de membrana PKC-. La fosfolipasa C (PLC) es una importante molécula de señalización aguas arriba que media la activación de PKC. El tratamiento con TDEE no tuvo ningún efecto sobre los niveles de PLC fosforilada y total (Figura 4D). La PKA es un heterotetrámero que consta de dos subunidades catalíticas unidas a dos subunidades reguladoras. La liberación de subunidades catalíticas es un sello distintivo de la activación de la PKA. En la Figura 4C, TDEE no afectó la expresión de las subunidades catalíticas de PKA.
2.6.Determinación del contenido de seis diterpenoides en TDEE por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Los resultados de los experimentos con animales mostraron que TDEE era la principal fracción efectiva de EER. Aislamos seis diterpenoides (las estructuras de los compuestos 1 a 6 se muestran en la Figura 5; los datos espectrales se agregaron al Material complementario) de TDEE y usamos estos compuestos como estándares para determinar el contenido de diterpenoides en TDEE. Los cromatogramas de HPLC para TDEE y los seis estándares de diterpenoides se presentan en la Figura 6. El contenido de los compuestos 1 a 6 fue 1,07 por ciento, 12,00 por ciento, 12,69 por ciento, 9,15 por ciento, 39,26 por ciento y 3,02 por ciento, respectivamente, contabilizando para el 77,18 por ciento de TDEE.
2.7.Efectos de los diterpenoides de TDEE en la expresión de AQP en células renales
TDEE fue la fracción activa de EER que inhibió la ascitis al reducir la expresión de AQP1, AQP2, AQP3 y AQP4 en los riñones. Al mismo tiempo, TDEE también redujo significativamente la expresión de proteínas y ARNm de AQP1, AQP2, AQP3 y AQP4 en células renales humanas-2 (HK-2) y células del conducto colector interno de la médula murina (mIMCD3) (Figura 7). Los componentes principales de TDEE son los diterpenoides. Comparamos los efectos entre TDEE y la mezcla de diterpenoides (se mezclaron seis diterpenoides aislados según su contenido en TDEE). Los resultados mostraron que los efectos inhibitorios de la mezcla de diterpenoides y TDEE sobre la expresión de AQP1, AQP2, AQP3 y AQP4 fueron similares (Figura 7). Las actividades de cuatro diterpenoides principales de TDEE se evaluaron in vitro. Las Figuras 8 y 9 mostraron que los niveles de expresión de proteína y ARNm de AQP1 en células HK-2 se redujeron significativamente por los compuestos 3, 4 y 5. El tratamiento con el compuesto 2 no indujo una disminución notable en AOP1 en la proteína y el ARNm. niveles Para estos compuestos, el compuesto 3 (un diterpenoide de tipo ent-abietane) fue más activo que los otros compuestos. En células mlMCD3, cuatro compuestos diterpenoides indujeron diferentes grados de inhibición de la expresión de AQP2, AQP3 y AQP4. Los resultados de la expresión de proteínas y genes se presentan en las Figuras 8 y 9. Los compuestos 4 y 5 poseían potentes efectos inhibidores de AQP2, AQP3 y AQP4 en comparación con el grupo de control a nivel de genes y proteínas. Los compuestos 2 y 3 solo mostraron efectos diferentes en la expresión del ARNm de Aqp2, Aqp3 y Aqp4.
2.8.Efectos del activador de PKC sobre la inhibición de AQP inducida por diterpenoides
Los resultados del experimento con animales indicaron que TDEE inhibió simultáneamente la actividad de PKC y la expresión de AQP en los riñones de ratones portadores de células tumorales H22. Para aclarar aún más si la PKC regulaba la expresión de las AQP en las células renales, se pretrató el agonista de la PKC (PMA) en células HK-2 y mIMCD3 1,5 h antes de la estimulación con diterpenoides (eufebracteolatina A). Se detectó el cambio de expresión de PKC de membrana, AOP1, AOP2, AOP3 y AOP4. Los resultados de Western Bolt mostraron que la eufebracteolatina A podría reducir la expresión de proteínas de PKC de membrana, AOP1, AOP2, AOP3 y AOP4, y los efectos podrían atenuarse mediante el pretratamiento con PMA (Figura 10).
