Parte 1: el geraniol mejora la lesión renal mediada por doxorrubicina a través de la alteración del estado antioxidante, la inflamación y la apoptosis: funciones potenciales de NF-kB y Nrf2/Ho-1

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Resumen: mediada por doxorrubicinainsuficiencia renales un problema grave en el tratamiento del cáncer. En consecuencia, este trabajo investigó la capacidad del geraniol para modular la inducción de doxorrubicina.Daño en el riñónutilizando un modelo de rata. Las ratas se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos: control, doxorrubicina (20 mg/kg, intraperitoneal, ip), doxorrubicina más 100 mg/kg de geraniol y doxorrubicina más 200 mg/kg de geraniol. Una sola inyección de doxorrubicina desencadenó insuficiencia renal, como lo demuestran los valores alterados de creatinina sérica, nitrógeno ureico en sangre y albúmina; también provocó cambios histológicos en la arquitectura renal. Además, la doxorrubicina mejoró la peroxidación de lípidos al tiempo que redujo el glutatión reducido, la actividad de catalasa y la expresión de glutatión peroxidasa y superóxido dismutasa. Curiosamente, el pretratamiento con geraniol rescató las alteraciones inducidas por la doxorrubicina en los parámetros antioxidantes renales, la actividad enzimática y la expresión de proteínas y genes inflamatorios y mediadores de la apoptosis. Además, el tratamiento profiláctico con geraniol conservó la mayoría de las características histológicas renales de forma dependiente de la dosis. Estos hallazgos respaldan que el geraniol podría proteger contra la doxorrubicina mediada pordisfunción renal. Sin embargo, se necesita más investigación para aclarar los mecanismos de los efectos protectores del geraniol contra la disfunción renal mediada por doxorrubicina.

Palabras clave: doxorubicina; inflamación; estrés oxidativo; apoptosis; lesión renal; geraniol

1. Introducción

Desde su descubrimiento, la doxorrubicina (Dox), un medicamento contra el cáncer de antraciclina, se ha utilizado ampliamente contra tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas. Entre sus efectos secundarios más frecuentes se encuentra la nefrotoxicidad, descrita como disfunción renal con disminución de la filtración, reabsorción y excreción, que se asocia con un riesgo significativo de morbilidad y mortalidad. Alrededor del 60 % de los pacientes con cáncer que reciben quimioterapia desarrollan nefrotoxicidad, lo que restringe la eficacia terapéutica de Dox[5,6]. Si bien los procesos fundamentales que causan la nefrotoxicidad mediada por Dox aún se desconocen, la literatura sugiere que los posibles contribuyentes incluyenestrés oxidativo, inflamación, yapoptosis. En particular, la evidencia indica que la reducción de Dox-asociadoestrés oxidativo, inflamación, y los eventos apoptóticos pueden ayudar a reducir la toxicidad renal del fármaco.

El factor nuclear (derivado de eritroides 2) similar a 2 (Nrf2) es un factor transcripcional sensible a redox con capacidades antioxidantes, antiinflamatorias y citoprotectoras que sustentan los sistemas de defensa celular. Ante el estrés oxidativo, Nrf2 libera su proteína inhibidora citoplasmática, que ingresa al núcleo y activa varios genes involucrados en la defensa antioxidante, como la hemooxigenasa-1(Ho-1), la glutatión peroxidasa (GPx), la catalasa( CAT) y superóxido dismutasa (SOD) [14-19]. Se ha demostrado que el tratamiento con Dox reduce las expresiones de ARNm y proteína de Nrf2 y, por lo tanto, la de los genes y proteínas antioxidantes posteriores, lo que lleva a la toxicidad renal.

El factor nuclear-kB (NF-kB) es un factor transcripcional que regula la expresión de muchos genes inflamatorios; como figura central de la vía NF-kB, que es activada por especies reactivas de oxígeno (ROS), puede desencadenar una respuesta inflamatoria y la lesión tisular resultante [8,22,23]. Numerosos estudios han informado que Dox causa inflamación y aumenta la producción de citocinas proinflamatorias como la interleucina-6(IL-6), la interleucina-1 beta (L-1), y factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-)[11,13]. Además, se ha demostrado que el aumento de la producción de ROS después del daño renal mediado por Dox desempeña un papel clave en la activación de la vía apoptótica intrínseca a través de la inestabilidad mitocondrial. Los determinantes clave de esta vía son las proteínas asociadas a mitocondrias Bax y Bcl-2; una proporción equilibrada de Bcl-2 a Bax previene la apoptosis, mientras que el desequilibrio conduce a una mayor permeabilidad de la membrana y a la fuga de citocromo c al citosol, lo que activa la caspasa-9(Casp-9) y la caspasa{ {21}} (cápsula-3). Dicha activación generalmente conduce a la fragmentación del ADN y la muerte celular.

Es de gran interés maximizar el uso clínico de los fármacos quimioterapéuticos minimizando sus efectos negativos. En consecuencia, se han realizado esfuerzos de investigación para investigar el uso de varios agentes junto con Dox para mejorar sus efectos adversos [13,30,31]. Los extractos de hierbas y sus ingredientes bioactivos han sido reconocidos durante mucho tiempo por su capacidad para reducir la toxicidad mediada por fármacos. El geraniol es un alcohol monoterpénico acíclico que se encuentra en casi todos los aceites esenciales, como los de jengibre, rosa, naranja, lavanda y limón [32,33]. Numerosos estudios han informado que el geraniol tiene varias propiedades beneficiosas, como antiulceroso, anticancerígeno [35], antidepresivo [36], antiinflamatorio [33] y, además, puede aliviar la nefropatía diabética [37] .

Hasta donde sabemos, actualmente no hay información específica sobre los efectos preventivos del geraniol contra la nefrotoxicidad mediada por Dox. Por lo tanto, estudiamos los efectos y probables mecanismos de acción del geraniol sobre la lesión causada por Dox a través de las vías de señalización NF-kB y Nrf2/Ho-1 en riñones de ratas Wistar.

2. Material y Métodos

2.1.Animales

Se obtuvieron ratas Wistar macho del centro de cuidado de animales de la Universidad King Saud (KSU) en Riyadh, Arabia Saudita. Los animales se mantuvieron en condiciones controladas, como por ejemplo a temperatura ambiente (25 ± 1 grado) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y tenían acceso ilimitado al agua y una dieta estándar según lo autorizado por el Comité de Ética del Estudio Institucional Local de KSU. (REC) con el número de autorización KSU-SE-19-122.

2.2. Diseño experimental

Esta investigación examinó un total de 32 ratas Wistar macho que pesaban 190-210 g, distribuidas en cuatro grupos. A las ratas se les dio una semana para adaptarse al entorno antes del estudio. El grupo del vehículo, también conocido como grupo de control, estaba compuesto por ratas a las que se les administró una formulación oral de solución salina normal. El grupo II consistió en ratas que recibieron Dox (dosis única de 20 mg/kg ip) el día 17 [11]. A las ratas del grupo III y IV se les administraron dosis profilácticas de geraniol (vía oral) a 100 y 200 mg/kg, respectivamente, durante 18 días, y el día 17 se sometieron, asimismo, a Dox (20 mg/kg, ip). El día 18, las ratas fueron sacrificadas usando una combinación de ketamina/xilazina en un ambiente controlado. Se recogió sangre y se aisló el suero, y ambos riñones se extrajeron y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se llevaron a cabo ensayos bioquímicos, de expresión de genes y proteínas en los tejidos congelados. Para el examen histológico, las muestras de tejido renal se lavaron en PBS y luego se conservaron en una solución de formaldehído al 4 por ciento. A lo largo de la investigación, no hubo indicios de angustia o muerte en un animal de experimentación.

2.3. Determinación de marcadores de función renal

Para aislar el suero de la sangre recogida en el momento del sacrificio, las muestras de sangre se centrifugaron durante 10 min a 2000 xg en una centrífuga preenfriada. Luego, el suero obtenido se analizó para cuantificar la albúmina, el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina. Valores deFunción del riñónlos marcadores se calcularon utilizando el Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, EE. UU.

2.4.Eoevaluación de la peroxidación lipídica

La peroxidación lipídica se evaluó en tejidos renales como lo describió anteriormente Ohkawa et al., con ligeras modificaciones.

2.5. Cuantificación de Glutatión Reducido

Los niveles de glutatión reducido (GSH) en el sobrenadante posmitocondrial renal (PMS) se midieron de acuerdo con el método descrito por Sedlak y Lindsay, con modificaciones menores.

2.6. Cuantificación de la Actividad de la Catalasa

La actividad de CAT en el síndrome premenstrual renal se determinó de acuerdo con el método descrito por Claiborne, con modificaciones menores.

2.7. Análisis de expresión génica (RT-qPCR)

Se utilizó el reactivo TRIzolTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para extraer el ARN total de los tejidos renales de acuerdo con las pautas del fabricante. La pureza y la cantidad de muestras de ARN extraídas se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, EE. UU.). Luego, el ARN aislado se transcribió inversamente en ADNc utilizando cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, EE. UU.), y la expresión génica se cuantificó con SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, EE. UU.) en Applied Biosystems 7500 Fast Real- Sistema PCR a tiempo. Luego se usó el enfoque AACt para determinar la expresión relativa de varios genes entre los grupos, con GAPDH empleado como gen de mantenimiento. La Tabla 1 enumera las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio (IDT, Lovaina, Bélgica).

2.8. Análisis de inmunotransferencia

El análisis de transferencia Western se llevó a cabo según lo descrito por Alasmari et al. [41]. Brevemente, las proteínas aisladas (30-50 ug) se sometieron a electroforesis en geles SDS-PAGE y luego se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear con leche descremada en polvo al 5 % durante 60 minutos, se probaron transferencias durante la noche a 4 grados con anticuerpos primarios selectivos (contra Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, caspasa escindida{{ 14}}, Bcl-2, Bax y GAPDH, dilución 1:1000). Posteriormente, las membranas se lavaron y luego se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con HRP adecuados (dilución: 1:5000). El kit de reactivos ECL y el equipo de formación de imágenes en gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) se utilizaron para detectar la presencia de proteínas en la membrana.

2.9.Estudios de Histopatología

Los tejidos renales se fijaron posteriormente en formaldehído al 4 por ciento y luego se procesaron para seccionarlos con parafina y teñirlos. Se utilizó un micrótomo para cortar secciones de parafina a un espesor de 3 μm. A continuación, las secciones cortadas se trataron para eliminar la cera y se tiñeron con colorante de hematoxilina más eosina (H&E) para el examen histopatológico. Las imágenes de histología renal se adquirieron utilizando una cámara DP72 acoplada a un microscopio Olympus BX.

2.10.Análisis de datos

Los datos se analizaron con el programa informático Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, EE. UU.), y los resultados se presentan como medias y desviaciones estándar (media ± SD). Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación de Tukey, con un valor de p de menos de 0.05 que indica significancia estadística (p<>